Ранозаживляющий гель
Владельцы патента RU 2468814:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова Российской академии наук (ИНЭОС РАН) (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (ИБР РАН) (RU)
Изобретение относится к области фармацевтической промышленности, а именно к ранозаживляющему гелю. Ранозаживляющий гель для наружного применения, содержащий хитозан, салициловую кислоту, биорегулятор, выделенный из сыворотки крови крупного рогатого скота, представляющий собой фракцию кислых белков в интервале значений рН<3,0, и воду, взятые в определенном соотношении. Вышеописанный гель обладает выраженной ранозаживляющей активностью. 2 ил., 6 пр.
Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно эмульсионным лечебно-профилактическим средствам наружного применения при кожных ранах (в том числе гнойных).
Актуальность разработки таких препаратов вызвана тем, что в настоящее время частота поражений кожи имеет тенденцию к росту. Проблема борьбы с раневыми дефектами крайне важна как для гражданской, так и для военно-полевой медицины. Развитие сложных промышленных производств, наличие на вооружении большинства армий зажигательных смесей, все возрастающее количество природных катаклизмов и техногенных катастроф требует повышение эффективности терапии раневых дефектов при большей доступности и оперативности применения лекарственных препаратов.
Раневые дефекты различной степени тяжести сопровождаются нарушением кислотно-щелочного равновесия и синтеза белков, совокупностью ферментных реакций распада сложных высокомолекулярных и биоорганических соединений, что приводит к некрозу тканей, экссудативным реакциям, образованию грануляционной ткани, бактериальной осемененности раневой поверхности.
В качестве ранозаживляющих препаратов в настоящее время используется большое количество лекарственных средств, среди которых особое место занимают препараты на основе неорганических и металлоорганических соединений, например следующие:
Известным ранозаживляющим препаратом является метилурацил, относящийся к классу пиримидинов и оказывающий влияние на восстановление разрушенных клеток и снижение воспалительных процессов. Для лечения применяется метилурациловая мазь на вазелино-ланолиновой основе. Однако такая основа препятствует нормальному газообмену, что снижает ранозаживляющую активность препарата, особенно при вялотекущих процессах и может вызвать аллергическую реакцию.
Наиболее эффективными являются ранозаживляющие средства, имеющие эмульсионную или гелеобразную консистенцию, так как они легко наносятся и впитываются.
Наиболее близким по технической сущности к заявленному средству является средство для наружного применения "Полимед" [Патент РФ №12140264, кл. А61К 31/00 (1999)], содержащее фенол медицинский, резорцин, борную кислоту, дистиллированную воду, хитозан, диметилсульфоксид, йодистый калий, уксусную кислоту ледяную, глицерин и анестетик при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| Хитозан | 3,0-3,1 |
| Фенол медицинский | 1,0-1,05 |
| Резорцин | 5,0-5,05 |
| Борная кислота | 1,0-1,05 |
| Диметилсульфоксид | 7,5-7,55 |
| Йодистый калий | 2,0-2,05 |
| Уксусная кислота ледяная | 4,8-5,0 |
| Глицерин | 3,0-3,5 |
| Анестетик | 0,5-10,0 |
| Дистиллированная вода | остальное |
При раневых поражениях препарат может использоваться как средство доврачебной помощи, так как на поверхности пораженной кожи образует пленку, которая служит защитным покрытием. "Полимед" представляет собой устойчивый гель и может храниться при комнатной температуре в течение двух лет без потери фармакологической активности и физико-химических свойств.
К недостаткам прототипа следует отнести (i) наличие в его составе токсических и канцерогенных веществ, таких как фенол, борная кислота, диметилсульфоксид, которые могут вызывать аллергические реакции со стороны организма при попадании на кожу и оказывать токсическое действие при попадании в кровь. Кроме этого препарат (ii) недостаточно эффективен из-за отсутствия в его составе активного морфогенетического вещества.
Задачей настоящего изобретения является создание нового эффективного ранозаживляющего средства для наружного применения, обладающего широким спектром действия. В заявляемом средстве отсутствуют токсические компоненты. Кроме того, в его состав входит биорегулятор, выделенный из сыворотки крови, который стимулирует репаративные процессы, восстанавливая морфологически и биохимически нормальные структуры тканей. Указанный биорегулятор содержится в незначительном количестве, что практически сводит до нуля вероятность токсической или аллергической реакции на него со стороны организма.
Техническим результатом решения поставленной задачи является создание эффективного ранозаживляющего средства, которое представляет собой гель для наружного применения, и содержит в качестве активных ингредиентов хитозан, салициловую кислоту и биорегулятор животного происхождения при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| Хитозан | 1,0-3,0 |
| Салициловая кислота | 0,3-0,5 |
| Биорегулятор из сыворотки крови крупного рогатого скота | 10-10-10-12 |
| Вода | остальное. |
Заявляемая композиция содержит следующие действующие компоненты.
Хитозан представляет собой катионный полимер, обычно получаемый из панцирей крабов, обладает бактериостатическими, ранозаживляющими и иммуностимулирующими свойствами, подавляет развитие фиброза, стимулирует макрофаги, способствует нормальному восстановлению кожного покрова. Образуя пленку на поверхности раны, он препятствует попаданию токсических компонентов, обладает хорошим осмотическим эффектом. Хитозан практически не токсичен для организма млекопитающих, его LD50 находится на уровне LD50 сахара и поваренной соли.
Салициловая кислота (о-оксибензойная кислота) - простейшая ароматическая оксикислота, которая представляет собой бесцветные кристаллы, плохо растворимые в воде и хорошо растворимые в органических растворителях; широко распространена в природе, главным образом в виде гликозида ее метилового эфира (метилсалицилата). В промышленности ее обычно получают карбоксилированием фенола. Салициловая кислота обладает слабыми антисептическими, раздражающими и кератолитическими (в больших концентрациях) свойствами. Применяют наружно в мазях, пастах, присыпках и растворах при лечении кожных заболеваний; натриевую соль салициловой кислоты (салицилат натрия), ее амид (салициламид) и ацетилсалициловую кислоту (аспирин) используют как жаропонижающие, противоревматические, противовоспалительные и болеутоляющие средства; благодаря антисептическому действию ее употребляют при консервировании пищевых продуктов. Салициловая кислота токсична в больших дозах, для человека предполагаемая LD50 составляет 1.75 г/кг.
Биорегулятор из сыворотки крови крупного рогатого скота. Для его получения использовали сыворотку крови крупного рогатого скота - стерильный, инактивированный коммерческий препарат, используемый в качестве добавки в ростовую среду клеточных культур, производства ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН».
Выделение биорегулятора из сыворотки крови осуществляли путем высаливания в насыщенном растворе сернокислого аммония. Для этого к охлажденному раствору тканевого экстракта или сыворотки крови постепенно добавляли сухой сернокислый аммоний при постоянном перемешивании до образования насыщенного раствора соли (на 1000 мл раствора 780 г соли). Суспензию белков оставляли на 7 суток при температуре +4°С, после чего центрифугировали для осаждения примесных белков при 12000g в течение 30 минут с помощью центрифуги Т 32А Janetzki (Германия). Собирали фракцию супернатанта и осадка. Фракцию супернатанта диализовали против дистиллированной воды, а фракцию осадка - против физиологического раствора для удаления низкомолекулярных примесей и сульфата аммония в течение 14 дней. Присутствие в растворе ионов аммония определяли реакцией с реактивом Несслера. Полученные фракции супернатантов далее концентрировали, используя роторный вакуумный испаритель, при температуре +37°С. Фракции осадков хранили при температуре -70°С.
Изоэлектрофокусирование фракций супернатантов
Для проведения изоэлектрофокусирования (ИЭФ) приготавливали следующие растворы:
Тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы, 1% Н3РО4.
Легкий электродный раствор - 0,1% NaOH.
Тяжелый градиентный раствор - 75 г сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды.
Легкий градиентный раствор - 15 г сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды.
Фракции супернатантов сыворотки крови и экстракта костной ткани (общим объемом 100 мл каждая) разделяли с помощью метода ИЭФ в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5-10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). В колонку наслаивали растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подавали из градиентного смесителя, легкий электродный раствор. Исследуемую фракцию (не более 100 мг белка) в виде раствора вводили в тяжелый градиентный раствор. ИЭФ проводили при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирали фракции объемом 10 мл. Детекцию белков осуществляли на спектрофотометре Ultrospec 1100 pro, (Biochrom Ltd., Великобритания) при 280 нм, для каждой фракции определяли значение рН с помощью рН-метра Oakton 2100 series (EUTECH Instruments, Сингапур). Согласно полученной картине разделения собирали фракцию кислых белков в интервале значений рН<3,0, которую далее длительно диализовали против дистиллированной воды и концентрировали. Данную фракцию далее разбавляли до соответствующей концентрации 10-9-10-11 мг белка/мл.
Существенным отличием заявляемого изобретения является то, что предлагаемое ранозаживляющее средство в форме геля содержит новый биорегулятор, выделенный из сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС) в низких концентрациях, обладающий выраженным репарирующим действием, приводящим к восстановлению морфологически и биохимически нормальной ткани кожи.
Для приготовления заявляемого ранозаживляющего геля растворяют 10-30 г хитозана в 1 л воды в присутствии 3-5 г салициловой кислоты при 50°С. Раствор стерилизуют при 120°С в течение 5 мин, при этом образуется гель, который охлаждают, фильтруют, а затем в полученный гель добавляют 10 мл водного раствора биорегулятора из сыворотки крови КРС в концентрации 10-9-10-11 мг/мл. Тщательно перемешивают в течение 15-30 мин и получают готовый для использования гель. Указанные выше количества хитозана (от 10 до 30 г) выбраны потому, что при таком содержании хитозана получается гель с определенным размером пор, через которые наиболее эффективно происходит высвобождение биорегулятора на раневую поверхность.
Указанный выше интервал концентраций биорегулятора был выбран потому, что в диапазоне концентраций от 10-9 до 10-11 мг/мл биорегулятор обеспечивает максимальную заживляющую эффективность заявляемого средства.
При нанесении на поверхность раны тонкого слоя ранозаживляющего геля образуется пленка, проницаемая для воздуха, но при этом препятствующая проникновению и размножению микроорганизмов на раневой поверхности за счет бактерицидного и бактериостатического действия салициловой кислоты и хитозана, соответственно. На поверхность раны из образовавшейся пленки поступает также вышеописанный биорегулятор, который оказывает регуляторное морфогенетическое действие; за счет этого и достигается технический результат в виде эффективного ранозаживляющего действия и восстановления повреждения. Кроме того, в результате нанесения геля на поверхность раны существенно снижается болевой эффект.
Изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами получения и примерами конкретных составов заявляемого ранозаживляющего геля, а также фигурами 1 и 2, иллюстрирующими ранозаживляющее действие предлагаемого средства.
ПОДПИСИ К ФИГУРАМ
Фиг.1. Заживление кожной раны у мыши на 8 сут: а - с добавлением гноя в рану; б - без добавления гноя в рану; в - с добавлением гноя и мази левомеколь; г - с добавлением гноя и биорегулятора из сыворотки крови в составе хитозанового геля.
Увеличение ок. 10, об × 10. Цифрами помечены: 1 - эпителий, 2 - дерма, 3 - подкожная жировая ткань, 4 - струп, 5 - протоки желез.
Фиг.2. Заживление кожной раны у мыши на 13 сут: а - с добавлением гноя в рану; б -без добавления гноя в рану; в - с добавлением гноя и мази левомеколь; г - с добавлением гноя и биорегулятора сыворотки крови в составе хитозанового геля. Увеличение ок. 10, об × 20. Цифрами помечены: 1 - эпителий, 2 - дерма, 3 - подкожная жировая ткань, 4 - струп, 5 - протоки желез.
Пример 1. Получение ранозаживляющего геля
Хитозан, салициловую кислоту и биорегулятор из сыворотки крови КРС используют при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| Хитозан | 1,0 |
| Салициловая кислота | 0,3 |
| Биорегулятор из сыворотки крови крупного рогатого скота | 10-10 |
| Вода | остальное (98,7). |
10 г хитозана растворяют в 1 л воды в присутствии и 3 г салициловой кислоты при 50°С. Раствор стерилизуют при 120°С в течение 5 мин, охлаждают, фильтруют и прибавляют 10 мл водного раствора биорегулятора из сыворотки крови КРС в концентрации 10-9 мг/мл.
Пример 2.
Хитозан, салициловую кислоту и биорегулятор из сыворотки крови КРС используют при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| Хитозан | 2,0 |
| Салициловая кислота | 0,3 |
| Биорегулятор сыворотки крови крупного рогатого скота | 10-11 |
| Вода | остальное (97,7). |
20 г хитозана растворяют в 1 л воды в присутствии и 3 г салициловой кислоты при 50°С. Раствор стерилизуют при 120°С в течение 5 мин, охлаждают, фильтруют и прибавляют 10 мл водного раствора биорегулятора из сыворотки крови КРС в концентрации 10-10 мг/мл.
Пример 3.
Хитозан, салициловую кислоту и биорегулятор сыворотки крови КРС используют при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| Хитозан | 3,0 |
| Салициловая кислота | 0,5 |
| Биорегулятор из сыворотки крови крупного рогатого скота | 10-12 |
| Вода | остальное (96,5). |
30 г хитозана растворяют в 1 л воды в присутствии 5 г салициловой кислоты при 50°С. Раствор стерилизуют при 120°С в течение 5 мин, охлаждают, фильтруют и прибавляют 10 мл водного раствора биорегулятора из сыворотки крови КРС в концентрации 10-11 мг/мл.
Ранозаживляющее действие заявляемых гелевых композиций было изучено на модели кожной гнойной раны in vivo. Было изучено влияние полученных гелей на заживление гнойных ран на коже у млекопитающих in vivo.
Эксперимент проводили на мышах-гибридах F1, самцы, весом 20-22 г - 36 животных. У каждой мыши, наркотизированной эфиром, на спине вырезали лоскут кожи, диаметром около 1 см. Сразу же после операции в течение 13 суток ежедневно на рану наносили препарат. Мышей разделяли на 4 группы. В первой контрольной группе мышам сразу же после операции на рану наносили гной; во второй - оставляли без воздействия. В опытных группах после нанесения на раны гноя, на рану наносили в одной группе исследуемый препарат, в другой - мазь левомеколь. Исследования кожных ран проводили на 3, 8, 13-е сутки после травмы на поперечных гистологических срезах.
Пример 4.
В качестве ранозаживляющего препарата был использован гель, полученный согласно примеру 1.
На 3 сутки после формирования раны:
Во всех случаях наблюдали незаживающую рану с отсутствием эпителия в центре раны. В дерме наблюдали сильное воспаление с инфильтрацией нейтрофилов. На данной стадии заживления раны не представлялось возможным адекватно оценить действие какого-либо препарата.
На 8-е сутки после формирования раны:
В ране, обработанной гноем, эпителизация не полная, струп прилегает к поверхности раны, в дерме очаг воспаления и множество сосудов, образуется фиброзный рубец, жировая ткань не выражена (Фиг.1а).
В ране, не обработанной гноем, происходит эпителизация, струп отходит от эпителия. В дерме образуется фиброзный рубец, видны незначительные очаги воспаления. Выражена подкожная жировая ткань с протоками желез (Фиг.1б).
При обработке гнойной раны левомеколем наблюдали выраженное воспаление в дерме. Не происходило полной эпителизации, струп прилегал плотно к ране, происходило образование фиброзного рубца, подкожная жировая ткань не выражена (Фиг.1в).
При воздействии ранозаживляющего геля на гнойную рану происходила интенсивная эпителизация раны, полное отслоение струпа, в дерме отсутствовали очаги воспаления, в подкожной жировой ткани можно было наблюдать формирование протоков желез и мышечных элементов (Фиг.1г).
На 13 сутки после формирования кожной раны:
При инфицировании раны гноем в центральной части раны наблюдали образование очага хронического воспаления и формирование соединительнотканного рубца в дерме, отмечали отсутствие полной реэпитализации (Фиг.2а).
Во второй контрольной группе животных (необработанная гноем рана) наблюдали практически полную реэпителизацию, незначительное воспаление. В дерме было много мелких капилляров, волокна коллагена расположены плотными тяжами параллельно эпидермису, то есть формируется фиброзный рубец. В подкожной ткани также происходило формирование рубца, волокна коллагена более рыхлые, чем в дерме, но почти отсутствуют жировые клетки (Фиг.2б).
В опытной группе с левомеколем наблюдали практически полную реэпителизацию, но эпителий отслаивался от дермы. В дерме присутствовали очаги воспаления. Подкожная жировая ткань не выражена, отсутствовали жировые клетки. В итоге образовался фиброзный рубец (Фиг.2в).
В опытной группе с исследуемым ранозаживляющим препаратом наблюдали сильное стягивание краев раны и практически полную ее реэпителизацию, более выраженную, чем у животных обеих контрольных групп, отслойки эпителия практически не наблюдали. Структура дермы почти восстановлена, отмечали отсутствие очагов воспаления. В подкожной ткани отмечено восстановление многочисленных протоков желез, а в дерме и волосяных фолликулов. Жировая ткань сильно развита. В отдельных участках под раной отмечено частичное восстановление мышечных элементов. Полученные данные указывают на исключительно высокую эффективность препарата в заживлении кожных ран у млекопитающих in vivo. Препарат не только стимулировал регенерацию в кожной ране, но и способствовал формированию в области травмы морфологически полностью восстановленной ткани (Фиг.2г).
Пример 5.
В качестве ранозаживляющего геля используют гель, полученный согласно примеру 2.
При воздействии ранозаживляющего геля на гнойную рану происходила интенсивная эпителизация раны без отслойки эпителия, стягивание краев раны, отслоение струпа, в дерме отсутствовали очаги воспаления, структура дермы восстановлена, в подкожной жировой ткани можно было наблюдать развитие жировой ткани, формирование протоков желез и мышечных элементов. Структура кожи восстанавливалась практически полностью.
Пример 6.
В качестве ранозаживляющего геля используют гель, полученный согласно примеру 3.
При воздействии ранозаживляющего геля на гнойную рану происходила полная эпителизация раны, отслоение струпа, структура дермы почти восстановлена, в дерме отсутствовали очаги воспаления, происходило формирование волосяных фолликулов, в подкожной жировой ткани можно было наблюдать формирование протоков желез, а в отдельных участках под раной отмечено частичное восстановление мышечных элементов.
Ранозаживляющий гель способствует формированию морфологически полностью восстановленной ткани в области травмы, стимулируя регенерацию в кожной ране.
В результате проведенных исследований установлено, что
1. Заявляемый ранозаживляющий гель активно участвует в процессе регенерации ран на коже у млекопитающих in vivo.
2. Под воздействием ранозаживляющего геля происходит практически полное восстановление морфологической структуры поврежденной ткани кожи.
3. Заявляемый ранозаживляющий гель может быть использован для предотвращения образования рубцовой ткани и заживления гнойных ран кожи.
Ранозаживляющий гель для наружного применения, содержащий хитозан, отличающийся тем, что в качестве активных ингредиентов содержит: салициловую кислоту, биорегулятор, выделенный из сыворотки крови крупного рогатого скота, представляющий собой фракцию кислых белков в интервале значений рН<3,0, и воду, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| Хитозан | 1,0-3,0 |
| Салициловая кислота | 0,3-0,5 |
| Биорегулятор | 10-10-10-12 |
| Вода | Остальное |
