Способ детекции ботулинических токсинов


 


Владельцы патента RU 2517120:

Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно - к лабораторной диагностике и иммунологии, и может быть использовано для проведения исследований клинического материала и пищевых продуктов на наличие ботулотоксинов. Сущность: твердую подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм погружают на 1 ч в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, разведенной 1:100 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2, далее подложку высушивают на воздухе, затем точечно наносят исследуемый материал в объеме 1-2 мкл. После полного впитывания исследуемого материала подложку промывают дважды 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2, содержащим 0.05% твина 20, затем помещают подложку в 2%-ный раствор БСА на ФБР или 2%-ный раствор казеината натрия на ФБР на 30 мин. После чего подложку двукратно промывают ФБР-твином и затем помещают ее в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной частицами коллоидного серебра, на 1 ч. После этого погружают подложку на 3-5 мин в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра, и затем промывают подложку проточной водой. После чего визуально определяют наличие ботулинических токсинов в исследуемом материале: если на подложке формируются серые пятна в местах нанесения материала, то исследуемый материал содержит ботулинические токсины, если на подложке нет окрашивания - материал не содержит ботулинических токсинов. Способ позволяет обнаруживать минимальные количества ботулотоксинов, экспрессен, экономичен, прост в постановке и учете результатов реакции, доступен для широкого применения, может осуществляться в полевых условиях, не требует оснащения дорогостоящими реактивами и оборудованием. 1 з.п. ф-лы, 4 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно - к лабораторной диагностике и иммунологии, и может быть использовано для проведения исследований клинического материала и пищевых продуктов на наличие ботулотоксинов.

Ботулизм - тяжелая токсикоинфекция с высокой летальностью (35-85%). Люди чрезвычайно чувствительны к ботулотоксинам. Смертельная доза токсина для человека составляет 1 нг/кг массы тела. Ботулинические токсины в обычных условиях внешней среды сохраняются до года, в консервированных продуктах - годами. Присутствие ботулотоксинов в пищевых продуктах не изменяет органолептических свойств последних.

Ботулинические токсины - яды биологического происхождения II группы патогенности, с наибольшей вероятностью могут быть использованы в качестве поражающих агентов биотерроризма.

Детекцию ботулотоксинов традиционно проводят двумя методами: постановкой реакций пассивной гемагглютинации (РПГА) и биологической нейтрализации токсина на белых мышах (РБНТ) с использованием диагностических противоботулинических поли- и моновалентных сывороток типов A, B, C, E и F. Ориентировочный ответ в РБНТ выдается лишь через 2 суток, окончательный - через 4-8 сут. К сожалению, не всегда имеется возможность проведения работ с лабораторными животными, да и сроки получения результатов в РБНТ длительны. В связи с ограниченной разрешающей способностью агглютинационных методов диагностики, в РПГА не всегда удается обнаружить небольшое количество токсина в клиническом материале, положительном в РБНТ.

Поэтому разработка новых и усовершенствование существующих способов детекции ботулинических токсинов остаются актуальной задачей.

Один из способов обнаружения ботулотоксинов - постановка РПГА. Перед постановкой реакции исследуемый на ботулотоксины материал прогревают при 56°C 20 мин, адсорбируют 50% взвесью формалинизированных эритроцитов барана в течение 15 мин и центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин. РПГА с надосадочной жидкостью ставят в 96-луночном полистироловом планшете с четырьмя или пятью типами ботулинических иммуноглобулиновых антитоксических эритроцитарных диагностикумов. В лунки верхнего ряда микропланшета (за исключением предпоследней лунки) автоматическим дозатором вносят 50 мкл забуференного физиологического раствора pH 7.2 (ЗФР), содержащего 1% нормальной кроличьей сыворотки (разводящая жидкость). Затем в первую лунку вносят 50 мкл исследуемого материала и титруют, перемешивая содержимое лунок и перенося по 50 мкл из 1-ой лунки во 2-ю, из 2-ой в 3-ю и т.д. до 10 лунки включительно, из которой 50 мкл раститрованного исследуемого материала удаляют в дезинфицирующий раствор. Предпоследняя лунка содержит 50 мкл заведомо положительного образца (положительный контроль). Последняя лунка - контроль эритроцитарного диагностикума. После серии двукратного разбавления исследуемого материала в каждую лунку вносят по 1 капле ботулинического иммуноглобулинового антитоксического эритроцитарного диагностикума (из моновалентных сывороток типов A, B, C, E и F). Планшет оставляют на 2-2.5 ч при комнатной температуре. После этого учитывают результаты: в лунках, которые содержат материал в котором присутствуют ботулотоксины, формируются «зонтики», в отсутствие ботулотоксинов в лунке формируются «пуговки». (Г.Г. Онищенко, Ю.М. Федоров, Н.Я. Жилина, В.Г. Субботин, В.В. Алексеев и др. Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму. - Волгоград, 2004. - С.44-52.).

Однако данный способ недостаточно чувствителен. Он не всегда позволяет обнаруживать небольшое количество ботулотоксинов в образцах, положительных в реакции биологической нейтрализации токсина на белых мышах.

Наиболее близким к предлагаемому является практически 100% достоверный способ детекции ботулотоксинов - РБНТ, включающий введение внутрибрюшинно двум белым мышам по 0.5 мл исследуемого материала. Для контроля специфичности определения токсина четырем белым мышам вводят внутрибрюшинно по 1 мл смеси, состоящей из 0.5 мл материала, содержащего ботулотоксин, и 0.5 мл смеси из моновалентных концентрированных противоботулинических сывороток типов A, B, C, E, F производства НПО «Аллерген» г. Ставрополь.

Смесь исследуемого материала выдерживают с противоботулиническими сыворотками при комнатной температуре в течение 15-30 мин с целью нейтрализации неизвестного ботулинического токсина соответствующими ему антитоксинами и после этого вводят смесь контрольным белым мышам. За мышами, которым ввели только материал, содержащий токсин, наблюдают 44-48 ч с целью выявления у них признаков отравления. Поражение белых мышей ботулиническим токсином проявляется в виде общей слабости, парезов задних конечностей и паралича диафрагмы. Это обусловливает характерные признаки отравления: лежачее положение животных, втянутые бока («осиная талия»), дыхание редкое и глубокое. Сроки проявления указанных признаков и сроки гибели животных зависят от дозы токсина, его активности и типа.

При наличии больших концентраций токсина гибель животных обычно наступает в течение первых суток. При малых концентрациях токсина в исследуемой пробе гибель мышей (или появление признаков отравления) может наблюдаться в более поздние сроки (3-8 сут). У животных (4 контрольные белые мыши), которым ввели смесь материала, содержащего ботулотоксины, с противоботулинической поливалентной сывороткой признаки отравления токсинами должны отсутствовать. Если опытные белые мыши погибают, а контрольные остаются живыми, выдают заключение о наличии ботулинических токсинов в исследуемом материале. Если и опытные, и контрольные мыши живы, то определяют отсутствие ботулотоксинов в исследуемом материале (Г.Г. Онищенко, Ю.М. Федоров, Н.Я. Жилина, В.Г. Субботин, В.В. Алексеев и др. Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму. - Волгоград, 2004. - С.44-52).

Цель изобретения - сокращение времени обнаружения ботулотоксинов, упрощение способа, повышение доступности.

Поставленная цель достигается тем, что твердую пористую подложку перед нанесением исследуемого образца погружают при комнатной температуре на 1 ч в раствор поливалентной противоботулинической диагностической сыворотки. Далее подложку высушивают на воздухе, точечно наносят на нее исследуемый материал (образцы клинического материала от больных или образцы пищевых продуктов) в объеме 1-2 мкл, через 15 мин после полного впитывания материала и подсыхания подложки ее промывают дважды 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2 (ФБР), содержащим 0.05% твина 20 (ФБР-твин), и погружают в раствор инертного белка (2%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина на 0.01 M фосфатном буфере pH 7.2 или 2%-ный раствор казеината натрия на ФБР). После последующего двукратного промывания ФБР-твином подложку на 1 ч помещают в поливалентную противоботулиническую сыворотку, меченную частицами коллоидного серебра. Далее подложку трехкратно промывают ФБР-твином, двукратно - дистиллированной водой и затем погружают в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра на 3-5 мин, после чего подложку промывают проточной водой и высушивают на воздухе. Результаты реакции учитывают визуально. Если формируются разного оттенка серые пятна на подложке в местах нанесения образцов, определяют наличие ботулотоксинов в исследуемом материале. Если в местах нанесения образцов подложка имеет первоначальный белый цвет - определяют отсутствие ботулотоксинов в исследуемом материале.

Сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемый способ отличается от известного тем, что твердую подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм погружают на 1 ч в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, разведенной 1:100 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2, далее подложку подсушивают на воздухе, затем точечно наносят исследуемый материал в объеме 1-2 мкл, после полного впитывания исследуемого материала подложку промывают дважды 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2, содержащим 0.05% твина 20, затем погружают в раствор инертного белка и выдерживают в течение 30 мин при температуре 18-26°C, после чего подложку двукратно промывают ФБР-твином. Затем подложку помещают в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной частицами коллоидного серебра, при комнатной температуре на 1 ч, после этого погружают подложку на 3-5 мин в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра, и затем промывают подложку проточной водой, подсушивают на воздухе, после чего определяют наличие ботулинических токсинов в исследуемом материале - если на подложке сформировались темно-серые пятна в местах нанесения образцов, то исследуемый материал содержит ботулинические токсины, если подложка не окрасилась - материал не содержит ботулинических токсинов.

Таким образом, предлагаемый способ соответствует критерию изобретения «новизна».

Проведенный анализ патентной и специальной литературы показал, что предлагаемый способ отличается как от прототипа, так и от других технических решений в данной и смежных областях. Так, авторами не найден способ детекции ботулотоксинов, который осуществлялся бы на твердых пористых подложках (нитроцеллюлозных мембранах) с применением в качестве диагностикума поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной коллоидным серебром. Предлагаемые режимы способа позволяют достичь поставленной цели - ускорить получение результатов анализа и отказаться от использования лабораторных животных, тем самым повысить доступность способа обнаружения ботулинических токсинов. При этом предлагаемый способ специфичен, характеризуется отсутствием положительного реагирования с материалом от больных острыми кишечными инфекциями, а также не контаминированными ботулотоксинами пищевыми продуктами и позволяет обнаруживать минимальные количества ботулотоксинов, экспрессен, экономичен, прост в постановке и учете результатов реакции, доступен для широкого применения, не требует оснащения дорогостоящими реактивами и оборудованием.

Данный способ детекции ботулотоксинов может быть использован в клинических, санитарно-гигиенических и научно-исследовательских лабораториях, занимающихся исследованиями на ботулизм.

Таким образом, предлагаемый способ детекции ботулотоксинов соответствует критериям «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Предлагаемый способ детекции ботулотоксинов осуществляется следующим образом: твердую пористую подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм (нитроцеллюлозные мембраны, либо фильтры «Synpor», Чехия) погружают при комнатной температуре на 1 ч в раствор поливалентной противоботулинической против типов A, B, C, E, F сыворотки (производства НПО «Аллерген», г. Ставрополь), разведенной 1:100 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2. Далее подложку высушивают на воздухе, точечно наносят исследуемый материал в объеме 1-2 мкл, после полного впитывания и подсыхания на подложке образца ее помещают в чашку Петри, промывают дважды 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2, содержащим 0.05% твина 20, и погружают в раствор инертного белка (2%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина на 0.01 M фосфатном буфере pH 7.2 или 2%-ный раствор казеината натрия на ФБР), блокируя оставшиеся свободные участки на подложке в течение 30 мин при комнатной температуре. После последующего двукратного промывания ФБР-твином подложку помещают в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной частицами коллоидного серебра, на 1 ч. Результаты реакции учитываются визуально после погружения подложки на 3-5 мин в водный раствор, содержащий 0,5% лимонной кислоты, 0,1% метола и 0,2% азотнокислого серебра, и последующего промывания проточной водой. Если формируются разного оттенка серые пятна на подложке в местах нанесения образцов, то определяют наличие ботулотоксинов в исследуемом материале. Если в местах нанесения образцов подложка имеет первоначальный (белый) цвет определяют отсутствие ботулотоксинов в исследуемом материале.

Параллельно ставят положительный контроль (материал заведомо содержит ботулотоксины, т.е. данный материал дал положительный результат в РБНТ) и отрицательный контроль (разводящая жидкость). В местах нанесения материала содержащего ботулотоксины формируются серые пятна, в местах нанесения разводящей жидкости серые пятна не формируются, подложка сохраняет первоначальный белый цвет.

Процедура мечения поливалентной противоботулинической сыворотки частицами коллоидного серебра, включает 2 этапа: приготовление раствора коллоидного серебра и мечения им специфических противоботулинических антител. Золь серебра получают восстановлением азотнокислого серебра боргидридом натрия. Для этого к 5 мл 0.05% водного раствора боргидрида натрия одномоментно приливают равный объем 0.02% водного раствора азотнокислого серебра. Интенсивно встряхивают на шуттеле при комнатной температуре в течение 15 мин. Цельную поливалентную противоботулиническую сыворотку предварительно диализуют в течение 5-6 ч против дистиллированной воды, осветляют центрифугированием (12000g, 2 мин) и в объеме 62.5 мкл вносят в стакан, куда одномоментно быстро выливают 10 мл золя серебра. Смесь перемешивают на магнитной мешалке 20 мин при комнатной температуре, затем в течение последующих 20 мин стабилизируют внесением равного объема 0.01 M фосфатного буфера pH 7.2, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина, 2 мл предварительно отцентрифугированной нормальной кроличьей сыворотки (12000g, 15 мин) и 2.0 мл 0.5%-ного водного раствора полиэтиленгликоля - 20000. Далее в полученный комплекс добавляют 0.15 M хлористого натрия и 0.1% боргидрида натрия, и дополнительно легко перемешивают 5-10 мин.

Пример 1. Детекцию ботулинических токсинов проводили как описано выше: образцы клинического материала (рвотные массы), предварительно подготовленные к исследованию в соответствии с «Инструкцией по применению сывороток диагностических ботулинических типов A, B, C, E, F нативных лошадиных или крупного рогатого скота сухих для реакции биологической нейтрализации (1998)», наносили в виде капель объемом 1 мкл на твердую пористую подложку с размером пор 0,17 мкм, заранее обработанную в течение 1 ч при комнатной температуре поливалентной противоботулинической сывороткой в разведении 1:100 ФБР и высушенной на воздухе. После полного впитывания материала и подсыхания подложки ее помещали в чашку Петри и дважды промывали ФБР-твином. Далее подложку погружали на 30 мин в 2% раствор бычьего сывороточного альбумина на ФБР, после чего дважды промывали ФБР-твином. Затем подложку погружали в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной коллоидным серебром, на 1 ч при комнатной температуре. После тщательного трехкратного промывания ФБР-твином и двукратного дистиллированной водой подложку погружали на 3 мин в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра. Затем подложку промывали проточной водой и высушивали на воздухе. Регистрацию результатов реакции проводили визуально. В местах нанесения исследуемого образца (рвотных масс) и в параллельно поставленных положительных контролях (заведомо положительный материал в РБНТ от больных с установленным клиническим диагнозом ботулизма) на подложке сформировались четкие окрашенные в серый цвет пятна. В местах нанесения отрицательных контролей (ФБР, клинический материал от больного с ОКИ неустановленной этиологии) окрашенных пятен на подложке не наблюдалось, подложка осталась белой.

Таким образом, исследуемый образец (рвотные массы), содержит ботулинические токсины.

Параллельно определяли наличие ботулотоксинов в исследуемом образце по способу-прототипу (в РБНТ) - опытные белые мыши погибли через 37 часов, контрольные мыши остались живыми. Таким образом, результаты, полученные по предлагаемому способу и способу-прототипу, совпали - исследуемый образец содержит ботулинические токсины.

Пример 2. Детекцию ботулинических токсинов проводили как описано выше: образцы клинического материала (промывные воды кишечника), предварительно подготовленные к исследованию в соответствии с «Инструкцией по применению сывороток диагностических ботулинических типов A, B, C, E, F нативных лошадиных или крупного рогатого скота сухих для реакции биологической нейтрализации (1998)», наносили в виде капель объемом 2 мкл на твердую пористую подложку с размером пор 0,45 мкм, заранее обработанную в течение 1 ч при комнатной температуре поливалентной противоботулинической сывороткой в разведении 1:100 ФБР и высушенной на воздухе. После полного впитывания материала и подсыхания подложки ее помещали в чашку Петри и дважды промывали ФБР-твином. Далее подложку погружали на 30 мин в 2% раствор казеината натрия на ФБР, после чего дважды промывали ФБР-твином. Затем погружали подложку в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной коллоидным серебром, на 1 ч при комнатной температуре. После тщательного трехкратного промывания ФБР-твином и двукратного дистиллированной водой подложку погружали на 5 мин в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра. Затем подложку промывали проточной водой и высушивали на воздухе. Регистрацию результатов реакции проводили визуально. В местах нанесения исследуемого образца (промывные воды кишечника) на подложке сформировались четкие окрашенные в серый цвет пятна. В местах нанесения положительных контролей (заведомо положительный материал в РБНТ от больных с установленным клиническим диагнозом ботулизма) на подложке также сформировались четкие окрашенные в серый цвет пятна. В местах нанесения отрицательных контролей (ФБР, клинический материал от больного с ОКИ неустановленной этиологии) окрашенных пятен на подложке не наблюдалось, подложка осталась белой.

Таким образом, исследуемый образец (промывные воды кишечника) содержит ботулинические токсины.

Параллельно определяли наличие ботулотоксинов в исследуемом образце (промывные воды кишечника) по способу-прототипу (в РБНТ) - опытные белые мыши погибли через 46 часов, контрольные мыши остались живыми. Таким образом, результаты, полученные по предлагаемому способу и способу-прототипу, совпали - исследуемый образец содержит ботулинические токсины.

Пример 3. Детекцию ботулинических токсинов проводили как описано выше: исследуемый образец (рыба холодного копчения), предварительно подготовленная к исследованию в соответствии с ГОСТ 10444.7-86 «Методы выявления ботулинических токсинов и C. Botulinum», наносили в виде капель объемом 1 мкл на твердую пористую подложку с размером пор 0,17 мкм, заранее обработанную в течение 1 ч при комнатной температуре поливалентной противоботулинической сывороткой в разведении 1:100 на ФБР. После полного впитывания материала и подсыхания подложки ее дважды промывали ФБР-твином. Далее подложку погружали на 30 мин в 2% раствор бычьего сывороточного альбумина на ФБР, после чего дважды промывали ФБР-твином. Затем погружали подложку в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной коллоидным серебром, на 1 ч при комнатной температуре. После трехкратного промывания ФБР-твином и двукратного дистиллированной водой подложку погружали на 3 мин в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра. Далее промывали подложку проточной водой и высушивали на воздухе. Регистрацию результатов реакции проводили визуально. В местах нанесения исследуемого образца (рыба холодного копчения) на подложке сформировались окрашенные в серый цвет пятна. В местах нанесения положительных контролей (заведомо положительный материал в РБНТ - рыба холодного копчения, содержащая ботулотоксины) также сформировались окрашенные в серый цвет пятна. В местах нанесения отрицательных контролей (ФБР, образцы из свежепойманной сырой рыбы, отрицательные в РБНТ) пятен нет, подложка осталась белой.

Таким образом, исследуемый образец (рыба горячего копчения) содержит ботулинические токсины.

Параллельно определяли наличие ботулотоксинов в исследуемом образце по способу-прототипу (в РБНТ) - опытные белые мыши погибли через 34 часа, контрольные мыши остались живыми. Таким образом, результаты, полученные по предлагаемому способу и способу-прототипу, совпали - исследуемый образец содержит ботулинические токсины.

Пример 4. Детекцию ботулинических токсинов проводили, как описано выше: исследуемый образец (рыба горячего копчения) предварительно подготовленный к исследованию в соответствии с ГОСТ 10444.7-86 «Методы выявления ботулинических токсинов и C. Botulinum», наносили в виде капель объемом 2 мкл на твердую пористую подложку с размером пор 0,45 мкм, заранее обработанную в течение 1 ч при комнатной температуре поливалентной противоботулинической сывороткой в разведении 1:100 на ФБР. После полного впитывания материала и подсыхания подложки ее дважды промывали ФБР-твином. Далее подложку погружали на 30 мин в 2% раствор казеината натрия на ФБР, после чего дважды промывали ФБР-твином. Затем погружали подложку в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной коллоидным серебром, на 1 ч. После тщательного трехкратного промывания ФБР-твином и двукратного дистиллированной водой подложку погружали на 5 мин в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра, далее промывали подложку проточной водой и высушивали на воздухе. Регистрацию результатов проводили визуально. В местах нанесения исследуемого образца подложка осталась белой (пятен нет). В местах нанесения на подложку положительных контролей (заведомо положительный материал в РБНТ - рыба холодного копчения, содержащая ботулотоксины) сформировались окрашенные в серый цвет пятна. В местах нанесения отрицательных контролей (ФБР, образцы из свежепойманной сырой рыбы, отрицательные в РБНТ) окрашенные пятна не формируются, подложка остается белой.

Таким образом, в исследуемом образце не обнаружены ботулотоксины.

Параллельно определяли наличие ботулотоксинов в исследуемом образце по способу-прототипу (в РБНТ) - опытные и контрольные мыши остались живыми. Таким образом, результаты, полученные по предлагаемому способу и способу-прототипу, совпали - исследуемый образец не содержит ботулинические токсины.

Указанный способ детекции ботулотоксинов использован при анализе 57 проб клинического материала и пищевых продуктов, поступивших на исследование в лабораторию.

Исследование материала на наличие ботулотоксинов параллельно проводили по способу-прототипу (в РБНТ) и по способу-аналогу (в РПГА). Отмечено полное совпадение результатов, полученных при детекции ботулотоксинов в исследуемых образцах, по способу-прототипу и по предлагаемому способу.

По сравнению со способом-аналогом предлагаемый способ более чувствителен: при использовании предлагаемого способа ботулотоксины были определены в 39 пробах (из 57), что полностью совпало с результатами, полученными по способу-прототипу. По способу-аналогу ботулотоксины были определены только в 23 пробах (из 57).

Однако по сравнению со способом-прототипом предлагаемый способ обнаружения ботулинических токсинов доступнее, быстрее, проще, не требует использования лабораторных животных, может осуществляться в полевых условиях.

1. Способ детекции ботулинических токсинов, включающий визуальное определение наличия ботулинических токсинов, отличающийся тем, что твердую подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм погружают на 1 ч в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, разведенной 1:100 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2, далее подложку высушивают на воздухе, затем точечно наносят исследуемый материал в объеме 1-2 мкл, после полного впитывания исследуемого материала подложку промывают дважды 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2, содержащим 0.05% твина 20, затем помещают подложку в раствор инертного белка на 30 мин, после чего подложку двукратно промывают ФБР-твином и затем помещают ее в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной частицами коллоидного серебра, на 1 ч, после этого погружают подложку на 3-5 мин в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра, и затем промывают подложку проточной водой, после чего определяют наличие ботулинических токсинов в исследуемом материале: если на подложке в местах нанесения исследуемого материала формируются серые пятна, то исследуемый материал содержит ботулинические токсины, если на подложке нет окрашивания - материал не содержит ботулинических токсинов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве раствора инертного белка используют 2%-ный раствор БСА на ФБР или 2%-ный раствор казеината натрия на ФБР.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, а именно к способу прогнозирования риска развития рецидива воспалительных заболеваний кишечника. Сущность способа состоит в том, что у больных с воспалительными заболеваниями кишечника с помощью иммуноферментного анализа в крови определяют уровень α-дефензина (αД) в нг/мл в плазме крови и содержание β-дефензина (βД) в нг/г и кальпротектина (ФК) в мкг/г в кале, рассчитывают вероятность развития рецидива воспалительного заболевания кишечника (p) в % по формуле.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике, и может быть использовано для определения вероятности возникновения врожденных пороков развития плода у беременных женщин.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для иммунохимического анализа. Аналитическая ванна для проведения мультиплексного дот-иммуноанализа представляет собой монолитный блок, выполненный из химически инертного термопластичного материала, с набором реакционных ячеек для рабочих и отмывочных растворов и термически герметизированных фольгой, имеющей слой полимерного термопластичного материала. Ячейки ванны выполнены в поперечном сечении в виде вытянутого ассиметричного шестиугольника с острыми противоположно расположенными углами, предназначенными в качестве направляющих при введении в ячейки ванны пластин иммуночипа для предотвращения их контакта с внутренней поверхностью ванны.

Изобретение относится к медицине и описывает способ оценки эффективности стимуляции антиоксидантной активности путем определения концентрации восстановленного глутатиона, при этом дополнительно в инкубационную среду добавляют 1,4-дитиоэритритол и аскорбиновую кислоту и при увеличении уровня восстановленного глутатиона с 0,75 нмоль/мг белка до 0,90 нмоль/мг белка и более стимуляцию антиоксидантной системы оценивают как эффективную, а при росте уровня восстановленного глутатиона с 0,75 нмоль/мг белка до 0,80 нмоль/мг белка и менее стимуляцию антиоксидантной активности оценивают как неэффективную.

Изобретение относится к области медицины и касается рекомбинантных химерных полипептидов, несущих эпитопы различных иммунодоминантных белков спирохет комплекса Borellia Burgdorferisensu lato, и способа серодиагностики иксодового клещевого боррелиоза.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки функционального состояния лимфоцитов человека. Для этого проводят оценку реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) при стимуляции их в течение 72 часов фитогемагглютинином (ФГА) иммуноцитохимическим методом в люминесцентном микроскопе в реакции непрямой иммунофлюоресценции.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу прогнозирования бронхолегочной дисплазии у недоношенных детей с экстремально низкой массой тела (ЭНМТ) при рождении.
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для серологической оценки токсичности анатоксина Bordetella pertussis. Сущность способа заключается в том, что в лунки 96-луночных полистироловых планшетов с иммобилизированной гамма-глобулиновой фракцией кроличьих антисывороток к коклюшному токсину вносят исследуемые образцы полуфабриката бесклеточной коклюшной вакцины, прибавляют к ним пероксидазный конъюгат гамма-глобулиновой фракциии кроличьих антисывороток к коклюшному токсину, добавляют к ним субстратную смесь и регистрируют оптическую плотность смеси и на основе оптической плотности выявляют титр присоединившегося к иммуносорбенту коклюшного токсина.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для количественного определения клеток-предшественников в кроветворной ткани.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии, и может быть использовано для оценки напряженности адаптации у пациентов с ургентной хирургической патологией органов брюшной полости. Способ оценки напряженности адаптации у пациентов с ургентной хирургической патологией органов брюшной полости, характеризующийся тем, что определяют количество лейкоцитов; абсолютные количества CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+, CD25+, CD38+, CD95+ лимфоцитов; абсолютное количество CD16+ нейтрофилов; содержание иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM; количество фагоцитирующих нейтрофилов и циркулирующих иммунных комплексов в крови пациента; затем по формулам множественной регрессии рассчитывают значения пятнадцати главных компонент, определяющих показатели иммунного статуса; затем рассчитывают индивидуальный показатель напряженности адаптации - SГК как среднее квадратическое отклонение попарно между главными компонентами, составляющими между собой 105 пар, по формуле: S Г К = 1 105 ∑ i = 1, x = 1 15 ( Г К i − Г К х ) 2 где ГКi, ГКx - главные компоненты: ГК-1-ГК-15; и при значениях SГК<1,0 оценивают напряженность адаптации как критическую, приводящую к срыву механизмов адаптации.
Изобретение относится к медицине и касается способа определения К-антигена Streptococcus pneumoniae для серологической диагностики циркулирующих штаммов пневмококков путем постановки реакции агглютинации на стекле с использованием определенного набора диагностических агглютинирующих пневмококковых сывороток, состоящего из 4 пуловых сывороток, в составе которых содержатся следующие антитела к К-антигенам, в первой из которых содержатся антитела к К-антигенам: 23F, 19F, 6A, 7F, 4, 14, во второй пуловой сыворотке: 19F, 18C, 9V, 6B, 4, 5, 14, в третьей пуловой сыворотке: 6A, 9V, 19A, 1, 4, 5, 14, в четвертой пуловой сыворотке: 7F, 6B, 1, 3, 5, 14. Изобретение обеспечивает сокращение трудозатрат, снижение трудоемкости, простоту, объективность оценки результата в сроки более короткие (2-3 раза), чем в прототипе. 13 пр.
Изобретение относится к медицине и, в частности к гематологии, вирусологии и инфекционным заболеваниям и описывает способ диагностики вирусных гепатитов путем определения в пробе крови РНК или ДНК вирусов методом ПЦР, при этом в случае отсутствия РНК или ДНК вирусов в сыворотке, плазме крови или «шапке» сгустка крови исследование проводят в сгустке крови больного, предварительно отделенном от сыворотки крови, высушенном и растворенном в физиологическом растворе хлористого натрия, и в случае наличия РНК или ДНК вирусов диагностируют гепатит. Способ обеспечивает повышение точности диагностики. 1 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии. Предложен способ прогнозирования исхода острого периода ишемического инсульта, заключающийся в определении в венозной крови на 1-й день ишемического инсульта соотношения содержания лиганда растворимого 6 члена суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (sFasL) и растворимого рецептора Fas (sFas) (sFasL/sFas), и при соотношении концентраций sFasL/sFas, меньшем или равном 2,41±0,26, прогнозируют благоприятный исход, при большем 2,67 -неблагоприятный исход. 2 пр., 3 ил.
Изобретение относится к области медицинской диагностики и касается способа прогнозирования риска развития рассеянного склероза (РС) у больных с оптическим невритом. Сущность способа: в сыворотке крови пациента с острым оптическим невритом определяют значение разницы оптической плотности при длине волны 492 нм исследуемой сыворотки и контрольной сыворотки, в качестве которой используют смешанный пул сывороток здоровых людей, регистрируют величины пиковой латентности Р100 зрительных вызванных потенциалов (ЗВП) и амплитуды N95 паттерн-электроретинографии (ПЭРГ) на стандартный стимул. При значении разницы оптической плотности исследуемой сыворотки и контрольной сыворотки, равном или более 0,2, снижении амплитуды N95 ПЭРГ на стандартный стимул на 10% и более по сравнению с нормой и удлинении пиковой латентности Р100 ЗВП на 10% и более по сравнению с нормой, прогнозируют высокий риск развития рассеянного склероза. При значении разницы оптической плотности исследуемой сыворотки и контрольной сыворотки менее 0,2, снижении амплитуды N95 ПЭРГ на стандартный стимул менее чем на 10% по сравнению с нормой и удлинении пиковой латентности Р100 ЗВП менее чем на 10% по сравнению с нормой прогнозируют невысокий риск развития PC. Способ обеспечивает повышение надежности прогнозирования риска развития РС, отличается простотой и скоростью выполнения, не требует применения дорогостоящих методов исследования, не связан с травмированием тканей глаза. 2 пр.

Изобретение относится к медицине. При осуществлении способа через 3 ч после перорального введения препарата «Аласенс» в дозе 15 мг/кг массы тела получают трехканальное RGB флуоресцентное изображение зоны интереса. Оценивают долю участия красного канала в изображении опухоли. Оценивают значение Rcut=(R/(R+G+B))·100%, где Rcut - доля участия красного канала в изображении здоровой кожи, R, G и В - яркости красного, зеленого и синего каналов изображения здоровой кожи. Из полученного трехканального RGB флуоресцентного изображения формируют изображение в оттенках серого I(x,y). Для каждой точки изображения I(x,y) вычисляют отношение , где R(x,y), G(x,y), В(x,y) - яркости красного, зеленого и синего каналов RGB флуоресцентного изображения с координатами x, y. Выполняют действие I(x,y)=0 для точек, в которых значение меньше 10%. При отображении опухоли на полученном результирующем изображении I(x,y) диагностируется злокачественная опухоль, а при исчезновении опухоли - доброкачественная. Способ позволяет повысить информационную способность за счет более точного отображения границ недоброкачественной опухоли. 1 прим.

Изобретение относится к области медицинской и ветеринарной иммунологии и предназначено для определения функциональной активности комплемента по его действию на инфузории. В измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий вносят суспензию клеток Tetrahymena pyriformis и испытуемую сыворотку крови с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту. Совпадение динамики изменения числа живых клеток во времени для испытуемой сыворотки и контрольной, представляющей пул 10 сывороток здоровых доноров, предполагает равенство активностей сывороточного комплемента в этих сыворотках. Предлагаемое изобретение обеспечивает универсальный способ расчета определения функциональной активности комплемента с использованием пригодной для всех видов животных мишени для действия активного комплемента, не требующей дополнительной сенсибилизации антителами и не подверженной реактивному лизису. 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 4 пр.

Изобретение относится к способам иммуноанализа для детектирования или количественного измерения искомых аналитов в образцах и может быть использовано в лабораторной и клинической практике для детектирования антител, протеинов, гормонов, лекарственных форм в биологических образцах в широком диапазоне концентраций. Сущность способа заключается в том, что для каждого искомого аналита иммобилизуют на твердом носителе на первой микрозоне первый специфический связывающий компонент с высокой аффинностью к искомому аналиту, на второй микрозоне иммобилизуют первый специфический связывающий компонент с низкой аффинностью к искомому аналиту, на микрозоны одновременно вносят аналит и второй специфический связывающий компонент, меченый первой детектируемой меткой и имеющий высокую аффинность к аналиту, первую смесь инкубируют и получают первый специфический комплекс, меченый первой детектируемой меткой, к первой смеси добавляют третий специфический связывающий компонент, меченый второй детектируемой меткой и имеющий низкую аффинность к искомому аналиту, при этом второй и третий специфические связывающие компоненты имеют идентичную эпитопную специфичность, затем инкубируют вторую смесь и получают второй специфический комплекс, меченый второй детектируемой меткой, удаляют не связавшиеся компоненты реакции и детектируют сигналы меток, связанных с первым и вторым специфическими комплексами в первой и второй микрозонах, концентрацию аналита определяют путем сравнения измеренных сигналов с калибровочной кривой, построенной для известных значений концентрации аналита. Использование способа позволяет повысить точность определения концентраций аналитов. 5 з. п.ф., 3 пр., 8 ил.
Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству, и касается способа прогноза гипертензионных осложнений беременности у пациенток с гестационным сахарным диабетом. Способ основан на исследовании следующих параметров: наличие вариантного аллеля 704С гена AGT: (генотип 704ТС или 704СС), наличие вариантного аллеля 521Т гена AGT (генотип 521СТ или 521ТТ), наличие вариантного аллеля 1166С гена AGTR1 (генотип 1166АС или 1166СС), наличие вариантного аллеля 786С гена NOS3 (генотип 786ТС или 786 СС). Также устанавливают: возраст старше 35 лет, крупный плод в анамнезе, наличие у пациентки ИМТ ≥40 кг/м2, наличие патологии сердечнососудистой системы у родственников. Затем вычисляют прогностический индекс по формуле: Р=0,861 × X1+0,636 × Х2+0,271 × Х3+0,793 × Х4+1,487 × Х5+0,822 × Х6+0,869 × Х7+0,801 × Х8 - 2,421, где X1 - наличие С аллеля гена AGT (полиморфизм 704 Т>С) в генотипе (если есть -1, если нет - 0). Х2 - наличие Т аллеля гена AGT (полиморфизм 521 С>Т) в генотипе (если есть -1, если нет - 0). Х3 - наличие С аллеля гена AGTR1 (полиморфизм 1166 А>С) в генотипе (если есть -1, если нет - 0). Х4 - наличие С аллеля гена NOS3 (полиморфизм 786 Т>С) в генотипе (если есть -1, если нет - 0). Х5 - возраст старше 35 лет (если старше -1, если нет - 0). Х6 - крупный плод в анамнезе (если было - 1, если нет - 0). Х7 - индекс массы тела пациентки >40 кг/м (если>40 кг/м -1, если нет - 0). Х8 - наличие патологии сердечно-сосудистой системы у родственников (если есть - 1, если нет - 0). Const= -2,42129. Если P<0, судят об отсутствии угрозы развития гипертензионных осложнений. Если Р>0, прогнозируют развитие гипертензионных осложнений. Изобретение обладает чувствительностью 80%, специфичностью 74,47%, эффективностью 75%. Данная формула позволяет прогнозировать развитие гипертензионных осложнений до появления клинических признаков. 2 пр.

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для обнаружения злокачественных опухолей, включая рак молочной железы, рак почек. Для этого проводят измерение экспрессии полипептида, обладающего способностью связываться посредством реакции антиген-антитело с антителом против белка CAPRIN-1, имеющего любую из аминокислотных последовательностей с четными номерами SEQ ID NO:2-30 списка последовательностей, в образце, полученном из живого организма, посредством реакции антиген-антитело в образце, выделенном из живого организма. Также предложен агент для обнаружения злокачественной опухоли. Группа изобретений обеспечивает высокую чувствительность при диагностике злокачественных опухолей. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 4 ил., 5 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для качественной экспресс-диагностики злокачественных новообразований околоушной слюнной железы по содержанию биомаркеров в плазме крови и в ротовой жидкости пациента. Для этого проводят исследования плазмы венозной крови и ротовой жидкости пациента методом стандартного иммуноэлектрохемилюминисцентного анализа. Забор венозной крови и ротовой жидкости проводят в любой последовательности. В качестве биомаркера в ротовой жидкости пациента выбирают раковый антиген 125 / cancer antigen 125 (CA 125), а в качестве биомаркера в плазме крови выбирают нейрон-специфическую енолазу / neuron-specific enolase, при содержание в ротовой жидкости пациента CA 125 в количестве 957,1-1528,5 ед/мл и нейрон-специфической енолазы / neuron-specific enolase в количестве 30-57,9 нг/мл диагностируют железистый рак околоушной слюнной железы пациента. Если определяют содержание в ротовой жидкости пациента CA 125 в количестве 1739,3-2709,7 ед/мл и содержание в плазме крови пациента нейрон-специфической енолазы / neuron-specific enolase в количестве 16,1-24,5 нг/мл - диагностируют лимфому околоушной слюнной железы пациента. Затем по полученным результатам определения содержания биомаркеров в плазме крови и в ротовой жидкости пациента прогнозируют тактику лечения. Изобретение обеспечивает точность и чувствительность дифференциальной диагностики в день обращения пациента, повышение вероятности выявления процесса злокачественных новообразований у пациента на ранних стадиях заболевания. 2 з.п. ф-лы, 6 пр.
Наверх