Способ серологической оценки токсичности анатоксина bordetella pertussis


 


Владельцы патента RU 2514011:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИВС им. И.И. Мечникова" РАМН) (RU)

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для серологической оценки токсичности анатоксина Bordetella pertussis. Сущность способа заключается в том, что в лунки 96-луночных полистироловых планшетов с иммобилизированной гамма-глобулиновой фракцией кроличьих антисывороток к коклюшному токсину вносят исследуемые образцы полуфабриката бесклеточной коклюшной вакцины, прибавляют к ним пероксидазный конъюгат гамма-глобулиновой фракциии кроличьих антисывороток к коклюшному токсину, добавляют к ним субстратную смесь и регистрируют оптическую плотность смеси и на основе оптической плотности выявляют титр присоединившегося к иммуносорбенту коклюшного токсина. При этом в качестве субстратной смеси используют тетраметилбензидин с перекисью водорода. Значения оптической плотности выше 0,2 еД в разведении 1:2 и более считаются соответствующими токсичным препаратам. Использование данного способа позволяет получать более быструю и достоверную оценку токсичности коклюшного токсина в процессе получения бесклеточной коклюшной вакцины в сравнении с трудоемкими методами на животных. 1 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для серологической оценки токсичности анатоксина Bordetella pertussis.

Вакцинация детей против коклюша является основным фактором борьбы с этим заболеванием, особенно опасным для младенцев и детей до 3-летнего возраста. Основными требованиями ко всем вакцинам является выраженная протективная активность и низкие токсические и аллергические свойства. В настоящее время в ряде стран мира разработана бесклеточная коклюшная вакцина, которая обладает сниженными токсическими свойствами. Тем не менее, периодически происходят вспышки заболевания коклюшем, источниками которых являются школьники среднего и старшего возраста, у которых иммунитет к коклюшу резко снижен.

Все это требует дальнейшего совершенствования качества коклюшных вакцин и связанных с этим способов их контроля. Одним из важных качеств вакцин, помимо их эффективности, является их безвредность. Поскольку в составе коклюшных вакцин основным протективным компонентом является коклюшный токсин, то определение содержания его и оценка токсичности является важным фактором.

Известен способ определения содержания коклюшного токсина (КТ) в твердофазном ИФА в 96-луночных полистироловых планшетах, в котором в качестве специфических антител использовали гамма-глобулиновые фракции сывороток кроликов, иммунизированных КТ. В качестве референс-препаратов использовали высокоочищенный препарат КТ, а в качестве субстратной смеси использовали 0,08% раствор 5-аминосалициловой кислоты с 0,05% раствором перекиси водорода. Учет реакции проводили на спектрофотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм (Н.С.Захарова, М.В. Брицина, Н.У. Мерцалова, И.Г. Бажанова, М.Н. Озерецковская, Е.М. Зайцев, А.В. Поддубиков, Б.Ф. Семенов «Отечественная бесклеточная коклюшная вакцина», ЖМЭИ, 2008, №1, с.35-41). Известный способ основан на взаимодействии специфической иммуноглобулиновой фракции сывороток кроликов к КТ с препаратами, содержащими коклюшный токсин. Однако, после обезвреживания КТ, полученный коклюшный анатоксин не взаимодействует с антисыворотками к КТ, что дает возможность контролировать степень обезвреживания препаратов в процессе получения бесклеточной коклюшной вакцины.

Задачей изобретения является разработка способа серологической оценки токсичности анатоксина Bordetella pertussis.

Технический результат заявляемого способа заключается в повышении специфичности и эффективности оценки токсичности коклюшного токсина, позволяющего в короткие сроки без использования лабораторных животных и с высокой степенью точности определить качество безвредности коклюшного анатоксина, что важно в производстве бесклеточной коклюшной вакцины.

Для достижения указанного технического результата в способе серологической оценки токсичности анатоксина Bordetella pertussis путем внесения в лунки 96-луночных полистироловых планшетов с иммобилизированной гамма-глобулиновой фракцией кроличьих сывороток к коклюшному токсину исследуемых образцов полуфабриката бесклеточной коклюшной вакцины, прибавления пероксидазного конъюгата гамма-глобулиновой фракции кроличьих сывороток к коклюшному токсину, прибавления субстратной смеси и регистрации оптической плотности смеси и на основе оптической плотности выявления титра присоединившегося к иммуносорбенту коклюшного токсина, согласно изобретению, в качестве субстратной смеси используют тетраметилбензидин с перекисью водорода; а значения оптической плотности выше 0,2 еД в разведении 1:2 и более считают соответствующими токсичным препаратам.

Сущность изобретения поясняется на следующем примере.

Пример.

Постановку ИФА осуществляют в 96-луночных полистироловых планшетах с плоским дном. В лунки планшетов вносят по 0.1 мл раствора гамма-глобулиновых фракций кроличьих антисывороток к КТ в 0,05 М карбонат-бикарбонатом буферном растворе с рН 9.6 и выдерживают планшеты в течение 2 ч при температуре 37°С, а затем в течение 16-18 ч при температуре 4-6°С. После этого лунки планшетов трижды промывают 0,3 мл 0.1 М фосфатного буферного раствора рН 7.4 с 0.005% твина-20. Далее в лунки планшетов вносят серийные разведения образцов БКВ 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024, 1:2048, 1:4096, а также серийные разведения КТ в концентрации от 25 мкг/мл до 5 нг/мл в 0,1 М фосфатном буферном растворе рН 7,4 с 0,005% твина-20 и 1% бычьего сывороточного альбумина. Планшеты выдерживают 1 ч при 37°С и трижды промывают лунки 0,3 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора рН 7,4 с 0,005% твина-20. После этого в лунки планшетов вносят по 0,1 мл рабочего разведения пероксидазного конъюгата гамма-глобулиновых фракций кроличьей антисыворотки к КТ в 0,1 М фосфатном буферном растворе рН 7,4 с 0,005% твина-20 и 1% бычьего сывороточного альбумина. Планшет выдерживают в течение 15 мин при комнатной температуре в недоступном для света месте, затем прибавляют субстратную смесь - тетраметилбензидин с перекисью водорода, добавляют в лунки по 0,1 мл 2М серной кислоты и регистрируют значения оптической плотности субстратной смеси на фотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм.

Вакцину считают токсичной при значениях оптической плотности выше 0,2 еД в разведении 1:2 и более.

Поскольку одной из специфических характеристик действия коклюшного токсина является стимулирование выброса лимфоцитов в кровеносное русло и тем вызывающее увеличение их количества в крови мышей при введении им КТ, в практике вакцинного дела используют оценку активности коклюшного токсина и оценку его токсичности по этому признаку на мышах. Однако этот метод трудоемок и дорог, а также более продолжителен по времени.

Использование заявляемого метода является экономичным, быстрым и специфичным.

Специфичность заявляемого метода показана в сравнении с методом оценки лимфоцитозстимулирующей активности БКВ на мышах. Результаты представлены в таблице.

Сравнительное изучение чувствительности заявляемого и используемого в практике методов оценки токсичности КТ представлено в таблице.

Таким образом, заявляемый метод дает возможность получать более быструю и достоверную оценку токсичности бесклеточной коклюшной вакцины при меньших материальных затратах и в более короткие сроки.

Изучение специфичности заявляемого метода в сравнении с методом оценки лимфоцитозстимулирующей активности полуфабриката коклюшной вакцины и готовой вакцины на мышах.

№№ Серии Препарат Метод исследования
Заявляемый Изучение лимфоцитозстимулирующей активности
Количество КТ, мкг/мл Степень токсичности Количество ЛС** - единиц в мл Степень токсичности
№1 1. Необезвреженный препарат 80 Токсичный 8,15 Токсичный
2. Обезвреженный препарат 0 Нетоксичный 0 Нетоксичный
№2 1.
Необезвреженный препарат
160 Токсичный 4,25 Токсичный
2.Обезвреженный препарат 0 Нетоксичный 0 Нетоксичный
№3 1. Необезвреженный препарат 64 Токсичный 4,3 Токсичный
2. обезвреженный препарат 0 Нетоксичный 0 Нетоксичный
№4 1. необезвреженный препарат 200 Токсичный 4,55 Токсичный
2. обезвреженный препарат 0 Нетоксичный 0,24* Нетоксичный
№5 1.
необезвреженный препарат
300 Токсичный 7,7 Токсичный
2. Обезвреженный препарат 40 Токсичный 7,35 Токсичный
3. Дополнительно обезвреженный препарат 0 Нетоксичный 0,27 Нетоксичный

* - препараты с количеством ЛС-единиц менее 1,0 считаются нетоксичными.

** - ЛСА выражали в единицах, рассчитанных по формуле:

Количество лейкоцитов опытной гр. - кол-во лейкоцитов контр гр.

10000 лейкоцитов (10000 лимфоцитов условно принято за 1 единицу ЛСА)

Способ серологической оценки токсичности анатоксина Bordetella pertussis путем внесения в лунки 96-луночных полистироловых планшетов с иммобилизированной гамма-глобулиновой фракцией кроличьих антисывороток к коклюшному токсину исследуемых образцов полуфабриката бесклеточной коклюшной вакцины, прибавления пероксидазного конъюгата гамма-глобулиновой фракции кроличьих сывороток к коклюшному токсину, прибавления субстратной смеси и регистрации оптической плотности смеси, и на основе оптической плотности, выявление титра присоединившегося к иммуносорбенту коклюшного токсина, отличающийся тем, что в качестве субстратной смеси используют тетраметилбензидин с перекисью водорода, а значение оптической плотности выше 0,2 еД в разведении 1:2 и более считают соответствующим токсичным препаратам.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для количественного определения клеток-предшественников в кроветворной ткани.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии, и может быть использовано для оценки напряженности адаптации у пациентов с ургентной хирургической патологией органов брюшной полости. Способ оценки напряженности адаптации у пациентов с ургентной хирургической патологией органов брюшной полости, характеризующийся тем, что определяют количество лейкоцитов; абсолютные количества CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+, CD25+, CD38+, CD95+ лимфоцитов; абсолютное количество CD16+ нейтрофилов; содержание иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM; количество фагоцитирующих нейтрофилов и циркулирующих иммунных комплексов в крови пациента; затем по формулам множественной регрессии рассчитывают значения пятнадцати главных компонент, определяющих показатели иммунного статуса; затем рассчитывают индивидуальный показатель напряженности адаптации - SГК как среднее квадратическое отклонение попарно между главными компонентами, составляющими между собой 105 пар, по формуле: S Г К = 1 105 ∑ i = 1, x = 1 15 ( Г К i − Г К х ) 2 где ГКi, ГКx - главные компоненты: ГК-1-ГК-15; и при значениях SГК<1,0 оценивают напряженность адаптации как критическую, приводящую к срыву механизмов адаптации.
Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано врачами других специальностей. Сущность способа: у беременных по данным проведенного ультразвукового исследования выявляют наличие новообразований придатков, выявляют наличие синдрома задержки развития плода I и II степени (СЗРП).
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики нарушений микроциркуляции при остеоартрозе у женщин, работающих в условиях физического перенапряжения.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа количественного определения фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253». Способ предусматривает обеззараживание и выделение РНК из вируссодержащего материала, постановку реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме «реального времени» с использованием специфичных праймеров RV5-5'-GTTGGGCACTGAAACTGCTA-3', RV6-5'-GAATCTCCGGGTTCAAGAGT-3' и зонда RV7-5'-ROX-AATCCTCCTTGAACTCCATGCGACAGA-BHQ2.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к полипептиду, несущему эпитоп BNP(1-32) человека, для получения лигандов, направленных против BNP(1-32) человека или proBNP(1-108) человека, где указанный полипептид имеет формулу a 1 − R 1 − X 1 − F G R K M D R − X 2 − R 2 − a 2 .

Изобретение относится к устройствам для проведения иммуноанализа и может использоваться для лабораторной диагностики вирусных инфекций. Микрофлюидная система включает канал для анализируемой жидкости и еще четыре канала, расположенных перпендикулярно к каналу для анализируемой жидкости и одним концом соединяющихся с ним, при этом один из этих каналов является измерительным и в него помещены рецепторы в жидкой среде, другой канал является опорным и содержит только жидкую среду, а в два остальных канала помещены флуоресцентные метки с иммобилизованным на них субстратом в жидкой среде.
Изобретение относится к области медицины, а именно к биохимии, и может быть использовано для определения протеолитической модификации клеточных рецепторов на модели выделенных лимфоцитов периферической крови.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу прогнозирования риска развития нагноительной формы заболевания и его затяжного течения у больных в возрасте 10-15 лет с инфильтративной формой зооантропонозной трихофитии.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и может быть использована для повышения эффективности и достоверности определения уровня токсикантов в различных средах путем проведения твердофазного иммуноферментного анализа.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу прогнозирования бронхолегочной дисплазии у недоношенных детей с экстремально низкой массой тела (ЭНМТ) при рождении. Сущность способа состоит в том, что исследуют пуповинную кровь ребенка на основе определения информативных показателей: гестационного возраста ребенка при рождении, концентрации интерферона-γ и С-реактивного белка в сыворотке пуповинной крови с последующим вычислением прогностического индекса по формуле. При D менее 0 делают заключение об отсутствии прогностических признаков развития бронхолегочной дисплазии у недоношенных детей с экстремально низкой массой тела (ЭНМТ), а при D более 0 прогнозируют развитие бронхолегочной дисплазии. Использование заявленного способа позволяет осуществить раннее доклиническое прогнозирование развития бронхолегочной дисплазии у новорожденного с ЭНМТ. 4 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки функционального состояния лимфоцитов человека. Для этого проводят оценку реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) при стимуляции их в течение 72 часов фитогемагглютинином (ФГА) иммуноцитохимическим методом в люминесцентном микроскопе в реакции непрямой иммунофлюоресценции. В качестве маркера ядерного антигена Ki-67 используют моноклональное антитело к Ki-67. О функциональной способности лимфоцитов судят по количеству визуализированных (светящихся) Ki-67-положительных клеток, имеющих фокусы свечения в ядре клеток, появляющиеся после искусственной стимуляции их к пролиферации ФГА. При значении антиген-позитивных клеток меньше 49% судят о снижении функциональной активности лимфоцитов у лиц с нарушением иммунного статуса. Использование данного способа позволяет проводить раннюю иммунодиагностику, в том числе онкогематологических заболеваний. 4 пр., 1табл., 1ил.

Изобретение относится к области медицины и касается рекомбинантных химерных полипептидов, несущих эпитопы различных иммунодоминантных белков спирохет комплекса Borellia Burgdorferisensu lato, и способа серодиагностики иксодового клещевого боррелиоза. Предложены рекомбинантные химерные полипептиды rmBmpA-frp83, rmOspA-frp83, rmDbpB-rmOspA, rmFlaA-frFlaB и rmOspCBg-rmOspCBa, полученные на основе экспрессии генов, амплифицированных методом ПЦР на ДНК западносибирского изолята Borrelia garinii 20047T или, в случае белка rmOspCBa, на ДНК изолята Borrelia afzelii. Представленные изобретения расширяют арсенал рекомбинантных полипептидов, пригодных для серодиагностики иксодового клещевого боррелиоза, повышения специфичности и чувствительности диагностики ИКБ, в том числе дифференциальной диагностики ранней стадии и стадии диссеминированной инфекции в регионах распространения западносибирских изолятов Borrelia burgdorferi s.1., и могут быть использованы в качестве антигенов для иммуноферментного анализа. 6 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 5 пр.

Изобретение относится к медицине и описывает способ оценки эффективности стимуляции антиоксидантной активности путем определения концентрации восстановленного глутатиона, при этом дополнительно в инкубационную среду добавляют 1,4-дитиоэритритол и аскорбиновую кислоту и при увеличении уровня восстановленного глутатиона с 0,75 нмоль/мг белка до 0,90 нмоль/мг белка и более стимуляцию антиоксидантной системы оценивают как эффективную, а при росте уровня восстановленного глутатиона с 0,75 нмоль/мг белка до 0,80 нмоль/мг белка и менее стимуляцию антиоксидантной активности оценивают как неэффективную. Способ обеспечивает повышение точности, прост в осуществлении и интерпретации полученных результатов. 1 табл.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для иммунохимического анализа. Аналитическая ванна для проведения мультиплексного дот-иммуноанализа представляет собой монолитный блок, выполненный из химически инертного термопластичного материала, с набором реакционных ячеек для рабочих и отмывочных растворов и термически герметизированных фольгой, имеющей слой полимерного термопластичного материала. Ячейки ванны выполнены в поперечном сечении в виде вытянутого ассиметричного шестиугольника с острыми противоположно расположенными углами, предназначенными в качестве направляющих при введении в ячейки ванны пластин иммуночипа для предотвращения их контакта с внутренней поверхностью ванны. По верхнему краю ванны выполнен выпуклый сварочный профиль в виде клиновидных в сечении буртиков, окантовывающих каждую ячейку. Изобретение обеспечивает повышение качества проведения иммунохимических реакций в ванне за счет исключения прилипания иммуночипов к внутренней поверхности стенок ячеек. 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике, и может быть использовано для определения вероятности возникновения врожденных пороков развития плода у беременных женщин. Для этого проводят забор крови, определяют путем молекулярно-генетического анализа полиморфизм гена фермента детоксикации GSTT1 в лимфоцитарной ДНК. Затем выявляют путем иммуноферментного анализа антител класса А и G - IgA, IgG, специфичных к бензо[а]пирену Bp, эстрадиолу Es и прогестерону Pg в сыворотке крови, служащих показателями иммунной реакции организма на воздействие тератогенных факторов. При определении повышенных значений соотношений уровней антител IgA Bp/Es>2, IgA Bp/Pg>2, IgG Bp/Es>2, IgG Bp/Pg>3 у носителей генотипа GSTT1 «0/0» делают вывод о высокой индивидуальной чувствительности беременной женщины к действию тератогенных факторов. В связи с этим делают прогноз о высокой вероятности возникновения врожденных пороков развития плода. При определении пониженных значений соотношений уровней антител IgA Bp/Es<2, IgA Bp/Pg<2, IgG Bp/Es<2, IgG Bp/Pg<3 у носителей генотипа GSTT1 «+» делают вывод о высокой индивидуальной устойчивости беременной женщины к действию тератогенных факторов. В связи с этим делают прогноз о низкой вероятности возникновения врожденных пороков развития плода. Предложенный способ обеспечивает повышение точности и информативности определения вероятности врожденных пороков. 3 пр., 7 табл.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу прогнозирования риска развития рецидива воспалительных заболеваний кишечника. Сущность способа состоит в том, что у больных с воспалительными заболеваниями кишечника с помощью иммуноферментного анализа в крови определяют уровень α-дефензина (αД) в нг/мл в плазме крови и содержание β-дефензина (βД) в нг/г и кальпротектина (ФК) в мкг/г в кале, рассчитывают вероятность развития рецидива воспалительного заболевания кишечника (p) в % по формуле. При полученном значении вероятности, равном или превышающем 50%, прогнозируют высокий риск развития рецидива, а при полученном значении вероятности менее 50% прогнозируют низкий риск развития рецидива. Использование заявленного способа позволяет своевременно спрогнозировать риск развития рецидива воспалительных заболеваний кишечника. 2 пр.
Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно - к лабораторной диагностике и иммунологии, и может быть использовано для проведения исследований клинического материала и пищевых продуктов на наличие ботулотоксинов. Сущность: твердую подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм погружают на 1 ч в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, разведенной 1:100 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2, далее подложку высушивают на воздухе, затем точечно наносят исследуемый материал в объеме 1-2 мкл. После полного впитывания исследуемого материала подложку промывают дважды 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2, содержащим 0.05% твина 20, затем помещают подложку в 2%-ный раствор БСА на ФБР или 2%-ный раствор казеината натрия на ФБР на 30 мин. После чего подложку двукратно промывают ФБР-твином и затем помещают ее в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной частицами коллоидного серебра, на 1 ч. После этого погружают подложку на 3-5 мин в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра, и затем промывают подложку проточной водой. После чего визуально определяют наличие ботулинических токсинов в исследуемом материале: если на подложке формируются серые пятна в местах нанесения материала, то исследуемый материал содержит ботулинические токсины, если на подложке нет окрашивания - материал не содержит ботулинических токсинов. Способ позволяет обнаруживать минимальные количества ботулотоксинов, экспрессен, экономичен, прост в постановке и учете результатов реакции, доступен для широкого применения, может осуществляться в полевых условиях, не требует оснащения дорогостоящими реактивами и оборудованием. 1 з.п. ф-лы, 4 пр.
Изобретение относится к медицине и касается способа определения К-антигена Streptococcus pneumoniae для серологической диагностики циркулирующих штаммов пневмококков путем постановки реакции агглютинации на стекле с использованием определенного набора диагностических агглютинирующих пневмококковых сывороток, состоящего из 4 пуловых сывороток, в составе которых содержатся следующие антитела к К-антигенам, в первой из которых содержатся антитела к К-антигенам: 23F, 19F, 6A, 7F, 4, 14, во второй пуловой сыворотке: 19F, 18C, 9V, 6B, 4, 5, 14, в третьей пуловой сыворотке: 6A, 9V, 19A, 1, 4, 5, 14, в четвертой пуловой сыворотке: 7F, 6B, 1, 3, 5, 14. Изобретение обеспечивает сокращение трудозатрат, снижение трудоемкости, простоту, объективность оценки результата в сроки более короткие (2-3 раза), чем в прототипе. 13 пр.
Изобретение относится к медицине и, в частности к гематологии, вирусологии и инфекционным заболеваниям и описывает способ диагностики вирусных гепатитов путем определения в пробе крови РНК или ДНК вирусов методом ПЦР, при этом в случае отсутствия РНК или ДНК вирусов в сыворотке, плазме крови или «шапке» сгустка крови исследование проводят в сгустке крови больного, предварительно отделенном от сыворотки крови, высушенном и растворенном в физиологическом растворе хлористого натрия, и в случае наличия РНК или ДНК вирусов диагностируют гепатит. Способ обеспечивает повышение точности диагностики. 1 пр.
Наверх