Способ определения вероятности возникновения врожденных пороков развития плода у беременных женщин




Владельцы патента RU 2517051:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии человека Сибирского отделения Российской академии наук (ИЭЧ СО РАН) (RU)
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кемеровский государственный университет" (КемГУ) (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике, и может быть использовано для определения вероятности возникновения врожденных пороков развития плода у беременных женщин. Для этого проводят забор крови, определяют путем молекулярно-генетического анализа полиморфизм гена фермента детоксикации GSTT1 в лимфоцитарной ДНК. Затем выявляют путем иммуноферментного анализа антител класса А и G - IgA, IgG, специфичных к бензо[а]пирену Bp, эстрадиолу Es и прогестерону Pg в сыворотке крови, служащих показателями иммунной реакции организма на воздействие тератогенных факторов. При определении повышенных значений соотношений уровней антител IgA Bp/Es>2, IgA Bp/Pg>2, IgG Bp/Es>2, IgG Bp/Pg>3 у носителей генотипа GSTT1 «0/0» делают вывод о высокой индивидуальной чувствительности беременной женщины к действию тератогенных факторов. В связи с этим делают прогноз о высокой вероятности возникновения врожденных пороков развития плода. При определении пониженных значений соотношений уровней антител IgA Bp/Es<2, IgA Bp/Pg<2, IgG Bp/Es<2, IgG Bp/Pg<3 у носителей генотипа GSTT1 «+» делают вывод о высокой индивидуальной устойчивости беременной женщины к действию тератогенных факторов. В связи с этим делают прогноз о низкой вероятности возникновения врожденных пороков развития плода. Предложенный способ обеспечивает повышение точности и информативности определения вероятности врожденных пороков. 3 пр., 7 табл.

 

Настоящее изобретение относится к области медицины, иммунологии и генетики человека и может быть использовано для оценки индивидуального риска возникновения врожденных пороков развития плода.

Известен способ прогнозирования патологии внутриутробного развития опорно-двигательного аппарата плода (заявка RU 95121435/14, Кл. G01N 33/48, опубл. 27.02.1998). Методика осуществляется следующим путем: натощак производят забор 10 мл крови из локтевой вены беременной в сроке 6-8 недель беременности. Определяют 10 биохимических показателей крови: содержание α-липопротеидов, билирубина (общего и свободного), холестерина, активность креатинкиназы, кислой и щелочной фосфатаз, аланинаминотрансферазы, РНК-азы, катепсина Д. Каждому показателю в зависимости от его количественного значения присваивают прогностический коэффициент, все коэффициенты суммируют. При суммарном коэффициенте равном от +6 до +25 прогнозируется развитие патологии опорно-двигательного аппарата плода; от +13 до -16 - развитие патологии исключается; а при значениях коэффициента 14 или 15 прогнозируют наличие риска внутриутробного развития патологии опорно-двигательного аппарата плода. Недостатками данного способа являются узконаправленное прогнозирование внутриутробных пороков лишь одной системы органов и отсутствие прогнозирования аномалии развития других систем, а также сложности выполнения и интерпретации результатов ввиду большого количества определений показателей. Кроме того, этот метод не раскрывает этиологических и патогенетических механизмов врожденных пороков развития и потому мало перспективен для дальнейшей разработки методов профилактики врожденных пороков развития плода (ВПРП).

Известен также способ скринингового обследования женщин для прогноза развития эмбриона/плода и рождения здорового либо аномального ребенка (патент G01N 33/53, опубл. 27.03.1998). Суть метода заключается в том, что у женщин детородного возраста с ранними сроками беременности или до беременности осуществляют забор крови, из которой получают сыворотку, затем получают тест-систему HLI-P (очищенные тест-антигены) и проводят твердофазный иммуноферментный анализ, определяют иммунореактивность сывороточных аутоантител организма женщины, оказывающих существенное влияние на нормальный эмбрио/фетогенез и направленных к антигенам, участвующим в процессах развития органов и тканей плода, например, к основному белку миелина, белку S100, анионному прочносвязанному белку хроматина АБХ 14-18, мембранному белку МР65 и при получении данных об отклонении иммунореактивности тестируемых сывороток от уровня нормальных значений к любому из них, по степени выраженности отклонений определяют уровень риска нарушений развития плода. Недостатками данного способа являются: сложность выполнения, многостадийная методика получения посадочных белков, необходимость эталонной сыворотки. Неблагоприятным является также разведение конъюгатов в отмывочном растворе вместо белкового раствора, поддерживающего естественное осмотическое давление.

Кроме того, известен способ предупреждения и снижения риска потери беременности по трем протеинам: аполипопротеину В-100, альфа2макроглобулину (альфа2М) и фибронектину (патент WO 2011/112993 A3, опубл. 15.09.2011). Суть метода заключается в том, что определяют уровень материнских IgG-антител к трофобласт-продуцируемому фибронектину и/или аполипопротеину В-100, и/или отсутствие или недетектируемый уровень антител к альфа2М, что ассоциировано с риском потери беременности.

Наиболее близким способом определения вероятности возникновения ВПРП может служить способ молекулярного анализа генетических полиморфизмов ферментов биотрансформации низкомолекулярных органических соединений: ксенобиотиков (в том числе, полициклических ароматических углеводородов) и эндобиотиков (в том числе, стероидных гормонов) (Гордеева Л.Л., Глушков Л.П., Ермолина И.Л. и др. Сочетание материнских полиморфизмов CYP1A2*F и GST при врожденных пороках развития у плода и новорожденного. // Медицинская генетика, 2011, №11, с.9-15). Известно, что некоторые метаболиты таких соединений, как бензо[а]пирен (Bp), эстрадиол (Es) и прогестерон (Pg), обладают тератогенным эффектом. При делеции в гене GSTTl, приводящей к инактивации данного фермента детоксикации указанных метаболитов, вероятность возникновения ВПРП возрастает. Поэтому «нулевой» генотип GSTTl «0/0» считается неблагоприятным. При нормальном генотипе GSTTl «+» вероятность возникновения врожденных пороков развития плода снижаются. Поэтому генотип GSTTl «+» считается благоприятным для физиологического течения беременности.

К недостаткам данного способа следует отнести отсутствие информации об индивидуальных иммунологических реакциях организма на экзогенные и эндогенные тератогенные вещества. Между тем, известно, что антитела (Ig), специфичные к Bp, Es и Pg способны существенно модифицировать их биологические свойства (Ковалев И.П.., Полевая О.Ю. Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным соединениям. // М.: Наука, 1985, 304 с.). Использование в данном способе только генетических маркеров детоксикации тератогенов без учета фенотипических иммунных реакций существенно снижает его точность и информативность по отношению к определению вероятности ВПРП.

Основной задачей предложенного изобретения является: разработка способа определения вероятности возникновения врожденных пороков развития плода у беременных женщин и повышение точности и информативности путем привлечения в систему лабораторных анализов иммунологических маркеров, в частности, антител, специфичных к тератогенным ксенобиотикам и стероидным гормонам.

Это достигается за счет того, что в предложенном способе определения вероятности возникновения ВПРП проводя определение путем молекулярно-генетического анализа полиморфизма гена фермента детоксикации GSTT1 в лимфоцитарной ДНК и путем иммуноферментного анализа антител классов A и G - IgA, IgG, специфичных к Bp, Hs и Pg n сыворотке крови, служащих показателями иммунной реакции организма на воздействие тератогенных факторов. При определении повышенных значений соотношений уровней антител IgA Bp/Fs>2, IgA Bp/Pg>2, IgG Bp/Hs>2 и IgG Bp/Pg>3 у носителей генотипа GSTTI «0/0» делают вывод о высокой индивидуальной чувствительности организма матери к действию тератогенных факторов и как следствие, о высокой вероятности возникновения ВПРП; при определении пониженных значений соотношений уровней антител IgA Bp/Hs≤2, IgA Bp/Pg≤2, IgG Bp/Fs≤2 и IgG Bp/Pg≤3 у носителей генотипа GSTTI «+» делают вывод о высокой индивидуальной устойчивости организма матери к действию тератогенных факторов и, следовательно, о низкой вероятности возникновения ВПРП.

Новизна данного подхода заключается в разработке комплекса генетических и иммунологических характеристик, оценка совокупности которых необходима для определения индивидуальной чувствительности организма матери к воздействию тератогенных ксено- и эндобиотиков, особенно в условиях проживания в экологически «неблагополучном» регионе, и более точного определения вероятности возникновения ВПРП.

Впервые установлены особенности образования антител к ксено- и эндобиотикам при ВПРП. Среди большого набора иммунологических и генетических показателей выделены маркеры, связанные с высокой вероятностью возникновения ВПРП: IgA Bp/Fs>2; IgA Bp/Pg>2; IgG Bp/Fs>2: IgG Bp/Pg>3 и GSTTI «0/0», а также маркеры, связанные с низкой вероятностью возникновения ВПРП: IgA Bp/Es≤2; IgA Bp/Pg≤2; IgG Bp/Hs≤2; IgG Bp/Pg≤3 и GSTTl «+».

Оценка совокупности уровней антител к ксено- и эндобиотикам и полиморфизма гена фермента детоксикации их тератогенных метаболитов позволила с большей точностью определять вероятность возникновения ВПРП, по сравнению с оценкой вероятности, рассчитанной только на основе анализа полиморфизма маркерного гена. Это может быть применено при прогнозировании состояния плода на ранних сроках беременности. В свою очередь выявленные особенности иммунохимических реакций на указанные соединения раскрывают дальнейшие перспективы для разработки новых методов иммунопрофилактики и иммунотерапии ВПРП.

Способ выполняется в следующей последовательности:

1. Формируют группы наблюдений па основе результатов иммуноферментного анализа антител к Bp, Es и Pg.

Формируют две группы доноров - с высокими и низкими значениями соотношения уровней антител. Для этого проводится анкетирование женщин: собирается гинекологический анамнез на основе медицинских карт. Все женщины подписывают информационное согласие на использование их биоматериала для научных исследований. Забор венозной крови производится натощак. В пластиковые пробирки типа «eppendorf» отделяют сыворотку объемом по 80 мкл и проводят иммуноферментный анализ. На полистироловые микро-планшеты адсорбируют конъюгаты бычьего сывороточного альбумина (BSA) с Bp, Es и Pg (Bp-BSA, Es-BSA, Pg-BSA) и в отдельные лунки только BSA. Инкубируют в течение ночи при +25°C. Планшет отмывают трижды промывочным раствором натрий-фосфатного буфера с добавлением Твин-20. Вносят сыворотку в разведении 1:20 (для IgA-антител), 1:100 (для IgG-антител) и инкубируют 1 час в термошейкере при +37°C с последующим отмыванием промывочным раствором 4 раза. Связывание антител выявляют с помощью конъюгатов антител кролика с пероксидазой хрена, специфичных к IgA и IgG человека. Уровень антител, специфичных к ксено- и эндобиотикам, определяют по формулам:

Ig-Bp=(OD(Bp-BSA)-OD(BSA)/OD(BSA),

Ig-X=(OD(X-BSA)-OD(BSA))/OD(BSA),

где OD - значение оптической плотности в соответствующих лунках, X эндобиотики Es и Pg.

Соотношение уровней антител ксенобиотик/эндобиотик рассчитывают по формуле:

Ig-Bp/X-(OD(Bp-BSA)-OD(BSA))/(OD(BSA)-OD(BSA))

При количественном преобладании у женщины значений соотношений IgA Bp/Hs и IgA Bp/Pg выше 2, IgG Bp/Es выше 2 и IgG Bp/Pg выше 3, донора относят в группу с высокими значениями соотношений уровней антител. В ином случае, при значениях соотношений IgA Bp/Es≤2, IgA Bp/Pg≤2, IgG Bp/Es≤2 и IgG Bp/Pg≤3 - в группу с низкими значениями соотношений уровней антител.

В нашем исследовании принимали участие 267 беременных женщин, находящихся во II триместре беременности (12-29 педели гестации). Соматический и гинекологический анамнез составлялся на основе медицинских карт. Обязательным критерием для включения женщин в исследования являлось прохождение ультразвукового обследования плода (скринингового на сроках 10-13 недель или 20-24 недели, а также по клиническим показаниям с 12 по 29 недели).

В среднем, соотношение уровней антител ксенобиотик/эндобиотик составило 1,3 для IgA Bp/Es; 1,5 для IgA Bp/Pg; 1,1 для IgG Bp/Es; 2,0 для IgG Bp/Pg. Однако, при учете данных УЗИ обнаружилось, что женщины, вынашивающие беременность с ВПРП, имели соотношения уровней антител ксено-/эндобиотик значимо выше, чем женщины, вынашивающие физиологическую беременность (ФВ). Полученные значения соотношений уровней антител представлены в таблице 1.

2. Формируют таблицу вероятности ВПРП на основе результатов иммуноферментного анализа антител к Bp, Hs и Pg.

Проводят сравнение частот высоких и низких значений соотношений антител у женщин с ФБ и ВПРП. Сравнение частот проводят по критерию χ2 с поправкой Йетса с помощью ППП Statistica 6.0. При значении χ2<3,41 и p>0,05 разницу между группами считают не достоверной и все рассчитанные для них показатели - статистически не значимыми. Отношение шансов и доверительный интервал рассчитывают по формулам:

O R = ( a + 0,5 ) × ( d + 0,5 ) ( b + 0,5 ) × ( c + 0,5 )

где: а - количество доноров с высоким значением данного соотношения уровней антител с диагнозом ВПРП;

b - количество доноров с низким значением данного соотношения уровней антител с диагнозом ВПРП;

c - количество доноров с высоким значением данного соотношения уровней антител с ФБ;

d - количество доноров с низким значением данного соотношения уровней антител с ФБ.

Для построения доверительного интервала CI берут величину L=InOP, которую приближенно можно считать нормально распределенной со средним значением:

или S = ln [ ( a + 0,5 ) × ( d + 0,5 ) ( b + 0,5 ) × ( c + 0,5 ) ]

и стандартным отклонением:

σ ( ln O P ) = ( a + b ) ( c + d ) ( a + b + c + d ) ( a + b + c + d − 1 )

Нижней и верхней доверительными границами показателя, между которыми его показатели находятся с вероятностью 1-α, соответственно составляют величины:

L _ = S − t ∞ ( α ) ⋅ σ ( L )

L ¯ = S − t ∞ ( α ) ⋅ σ ( L ) ,

где t∞(α) - значение критерия Стьюдента, соответствующее вероятности ошибки α.

В качестве нижней и верхней доверительных границ берут антилогарифмы от величин L _ и L ¯ :

e L _ ≤ O P ≤ e L ¯

где е=2,718

Если доверительный интервал не включает значения 1,0, то связь фактор-заболевание считают статистически значимой.

Вероятности возникновения ВПРП для разных значений соотношений уровней антител приведены в таблице 2. При значениях вероятности выше 1,5 делают вывод о предрасположенности к возникновению ВПРП, при значениях ниже 0,7 об устойчивости к формированию ВПРП.

Видно, что при высоких значениях соотношений уровней lg-Bp/Hs и Bp/Pg вероятность возникновения ВПРП составляют 2,5-6,8. При низких значениях соотношений уровней Ig-Bp/Hs и Bp/Pg вероятность возникновения ВПРП<0,5.

3. Определяют генетическую предрасположенность к ВПРП на основе молекулярно-генетического анализа GSTTJ.

Проводят генотипирование женщин. Выделение ДНК из лимфоцитов крови проводится с помощью метода фенол-хлороформной экстракции с последующим осаждением этанолом (Sambrook J., Fritsch В., Maniatis Т., 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. (v. 1-3)).

Используемые тест-системы для молекулярно-генетического анализа полиморфизма GSTT1 разработаны в ИХБФМ СО РАН (г.Новосибирск).

Типирование гена GSTTl проводится методом мультиплексной ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов в режиме реального времени. Олигонуклеотидные праймеры для ПЦР выбираются внутри области делеции в гене GSTTl и связаны с отсутствием синтеза соответствующего продукта ПЦР при анализе образцов ДНК с генотипом GSTT1 «0/0». Для того, чтобы отличить наличие гомозиготной делеции в гене GSTTl от отсутствия ДНК матрицы или ингибирования реакции ПЦР, в амплификационную смесь вводится внутренний контроль, в качестве которого используется некодирующий фрагмент генома с низкой температурой плавления, условно обозначаемый как LTM (low temperature melting). Структура праймеров для LTM детально описана в работе Kostrykina N.A. (Kostrykina N.A., Pechkovskii E.V., Mishukova O.V. et al. Studying the association of polymorphic variants of GSTMl and GSTTI genes with breast cancer in female residents of Altai Krai.// Bull. Exp.Biol. Med. - 2009. - Vol.148, №1. - P.89-93). Размеры амплифицируемых фрагментов: GSTTI - 287 пар оснований, LTM - 127 пар оснований, расчетная температура отжига всех праймеров составляет 64-66°C, ожидаемая температура плавления продуктов амплификации - GSTT1 -92,5°C, 17М-78,5°C.

Амплификация проводится с помощью амплификатора iCycler iQ5 (Bio-Rad, США). ПЦР проводится при следующих условиях: начальная денатурация 3 мин при 95°C, 38 циклов в режиме: денатурация 10 с при 95°C, отжиг праймеров 10 с при 64°C, элонгация 14 с при 72°C. Результаты интерпретируются исходя из анализа графиков накопления флуоресценции. Отсутствие флуоресцентного сигнала указывает на гомозиготность индивидуума по делеции гена («0»). Гетерозиготы по мутации (генотип «+/0») рассматриваются в одной группе с носителями нормальных генов («+»).

Следствием делеции в гене GSTTl является отсутствие функциональной активности этого фермента инактивации гено- токсических метаболитов низкомолекулярных органических соединений. (Hayes J.D., Flanagan J.U., Jowscy I.R. Glutathione transferases.// Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. - 2005. - Vol.45. - P.51-88).

4. Формируют таблицу вероятности ВПРП на основе результатов молекулярно-генетического анализа.

Проводят сравнение частот генотипов у женщин с ФБ и с ВПРП. Отношение шансов рассчитывают по формулам:

O R = ( a + 0,5 ) × ( d + 0,5 ) ( b + 0,5 ) × ( c + 0,5 )

где: а - количество доноров-носителей делеционного генотипа GSTTl «0/0» с диагнозом ВПРП;

b - количество доноров-носителей нормального генотипа GSTTl «+» с диагнозом ВПРП;

с - количество доноров-носителей делеционного генотипа GSTTl «0/0» с ФБ;

d - количество доноров-носителей нормального генотипа GSTTl «+» с ФБ.

Доверительный интервал (С1) выстраивают так же, как описано в пункте 2. Значения вероятности возникновения ВПРП для разных сочетаний генотипов приведены в таблице 3. При наличии делеции в гене GSTTl (0/0) вероятность возникновения ВПРП возрастают в 2,1 раза. При наличии GSTTl «+» вероятность возникновения ВПРП снижаются до 0,5.

5. Формируют таблицу вероятности возникновения ВПРП на основе результатов иммуноферментного анализа антител к Bp, Es и Pg в комплексе с молекулярно-генетическим анализом полиморфизма GSTTl.

Проводят сравнение частот сочетаний генотипа GSTTl «0/0» с высокими значениями соотношений уровней антител у женщин с ФБ и ВПРП. Отношение шансов рассчитывают по формулам:

O R = ( a + 0,5 ) × ( d + 0,5 ) ( b + 0,5 ) × ( c + 0,5 )

где: a - количество доноров-носителей делеционного генотипа GSTT1 «0/0» с высоким значением соотношения уровней антител с диагнозом ВПРП;

b - количество остальных доноров из выборки с диагнозом ВПРП; с - количество доноров-носителей делеционного генотипа GSTTl «0/0»

с - высоким значением соотношения уровней антител с ФБ;

d - количество остальных доноров из выборки с ФБ.

Проводят сравнение частот сочетаний генотипа GSTTl «+» с низкими значениями соотношении уровней антител у женщин с ФБ и ВПРП. Отношение шансов рассчитывают по формулам:

O R = ( a + 0,5 ) × ( d + 0,5 ) ( b + 0,5 ) × ( c + 0,5 )

где: a - количество доноров-носителей нормального генотипа GSTTl «+» с низкими значением соотношения уровней антител с диагнозом ВПРП;

b - количество остальных доноров из выборки с диагнозом ВПРП;

с - количество доноров-носителей нормального генотипа GSTTl «+» с низким значением соотношения уровней антител с ФБ;

d - количество остальных доноров из выборки с ФБ.

Доверительные интервалы (C1) выстраивают так же, как описано в пункте 2. Результаты представлены в таблице 4. Видно, что у гомозигот по делеции GSTTl «0/0» при высоких значениях соотношений IgA Bp/Es>2, IgA Bp/Pg>2, IgG Bp/Es>2, IgG Bp/Pg>3 значения OR значительно выше, чем при анализе только антител без учета генетического полиморфизма GSTT1 (табл.2); значения и OR значительно выше, чем при анализе только генетического полиморфизма GSTTl без учета уровней антител (табл.3). У носителей нормального генотипа GSTTl «+» при низких значениях соотношений IgA Bp/Es<2, IgA Bp/Pg<2, IgG Bp/Es<2, IgG Bp/Pg<3 значения χ2 выше, а значения OR ниже, чем при анализе только генетического полиморфизма GSTTl без учета уровней антител. Это подтверждает, что предлагаемый способ определения вероятности возникновения ВПРП у беременных женщин с помощью иммуноферментного анализа антител к Bp, Es и Pg в комплексе с молекулярно-генетическим анализом полиморфизма GSTTl по сравнению с известным методом с помощью только одного анализа генетического полиморфизма GSTTl отличается более высокой точностью и информативностью.

6. Детальное описание способа.

Пример 1.

У обследуемой Т., 25 лет, первая беременность, на сроке 12 недель в стеклянную пробирку была взята кровь из локтевой вены в объеме 3 мл. 80 мкл плазмы были отобраны для дальнейшего проведения иммуноферментного анализа. Полистироловые планшеты инкубировались ночь при +25°С с конъюгатами Bp-, Es- и Pg-BSA и отдельно с BSA. Сыворотку разводили в белковом растворе с добавлением 0,5% Twin-20. Связывание антител выявляли с помощью конъюгатов антител кролика, специфичных к иммуноглобулинам человека. Показания оптической плотности снимали на фотометре «Пикон» (Россия). Образец ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови методом фенол-хлороформной экстракции с последующем осаждением этанолом. Типирование гена GSTTl проводили методом мультиплексной ПЦР. Амплификацию проводили с использованием амплификатора iCycler iQ5 (Bio-Rad, США). Обнаруженные генетические полиморфизмы и значения соотношений антител представлены в таблице 5. Выявлено наличие высоких значений соотношений уровней антител в сочетании с делецией в гене GSTT1. Па этом основании сделано заключение о наличии высокой вероятности возникновения ВПРП, что подтвердилось после прохождения пациенткой ультразвукового обследования плода на сроке 23 недель гестации. По результатам УЗИ был поставлен диагноз: врожденный порок развития костно-мышечного аппарата укорочение левого предплечья и кисти.

Пример 2.

У первобеременной Н., 28 лет, на сроке 19 недель гестации в стеклянную пробирку была взята кровь из локтевой вены в объеме 3 мл. Антитела определялись описанным методом ИФА. Лейкоцитарную ДНК выделяли с использованием фенол-хлороформной экстракции. Генотипирование GSTTl проводилось описанным методом ПЦР. Результаты обследования представлены в таблице 6. По результатам иммуноферментного анализа выявлены высокие значения соотношений уровней антител. Кроме того, выявлена делеция в гене GSTTl. На этом основании сделан вывод о наличии высокой вероятности возникновения ВПРП. Это подтвердилось результатами УЗИ на сроке 24 недель. Был поставлен диагноз: врожденный порок развития мочевыделительной системы - аплазия правой почки.

Пример 3.

У первобеременной Л., 25 лет, на сроке 15 недель гестации была взята кровь из локтевой вены в объеме 3 мл. Антитела определялись описанным методом ИФЛ. Лейкоцитарную ДНК выделяли с использованием фенол-хлороформной экстракции. Генотипирование GSTTl проводилось описанным методом ПЦР. Результаты обследования представлены в таблице 7. Выявлены пониженные значения соотношений антител, а также отсутствие делеции в гене GSTT1. Сделан вывод о снижении вероятности возникновения ВПРП. По данным УЗИ на сроках 22 и 31 недели каких-либо патологий плода выявлено не было.

Медианы соотношений уровней антител ксенобиотик/эндобиотик у женщин с врожденными пороками развития плода (ВПРП) и с физиологической беременностью (ФБ). Достоверность различий (р) рассчитана с помощью непараметрического критерия Mann-Whitney

Таблица 1
Антитела ФБ ВПРП P
IgA Bp/Hs 1,1 1,6 0,0016
IgA Bp/Pg 1,3 2,9 0,0000001
IgG Bp/Hs 1,0 1,4 0,000096
IgG Bp/Pg 1,9 2,15 0,068

Вероятность возникновения ВПРП на основе результатов иммуноферментного анализа антител к Bp, Es и Pg

Таблица 2
Антитела Уровень ФБ ВПРП χ2 (p) OR(CI) ВПРП
    n(%) n(%)    
IgA Bp/Hs ≤2 131(78,9) 59(58,4) 10,8 0,4(0,14-0,9)
  >2 35(21,1) 42(41,6) (0,0016) 2,6(1,02-6,8)
IgA Bp/Pg ≤2 135(81,3) 39(38,6) 48,6 0,1 (0,05-0.3)
  >2 31(18,7) 62(61,4) (0,00001) 6,8(2,6-17,6)
IgG Bp/F,s ≤2 151(91) 71(70,3) 17,8 0,24(0,09-0,6)
  >2 15(9) 30(29,7) (0,00001) 4,2(1,6-10,8)
IgG Bp/Pg ≤3 136(81,9) 65(64,3) 9,5 0,4(0,15-1,04)
  >3 30(18,1) 36(35,7) (0,0021) 2,5(0,9-6,4)
Таблица 3
Вероятность возникновения ВПРП на основе результатов молекулярно-генетического анализа полиморфизма GSTT1
Генетический ФБ ВПРП χ2 (р) OR(CI) ВПРП
Маркер n(%) n(%)    
GSTTl «0/0» 36(21,6) 37(36,6) 6,3 2,08(1,1-5,3)
GSTTl «+» 130(78,4) 64(63,4) (0,012) 0,5(0,2-1,2)
Таблица 4
Вероятность возникновения ВПРП на основе результатов иммуноферментного анализа антител к Bp, Es и Pg в комплексе с молекулярно-генетическим анализом полиморфизма GSTTl
GSTTl антитела ФБ n(%) ВПРП n(%) χ2 (p) OR (CI) ВПРП
GSTTl «0/0» IgA Bp/Es>2 4(2,4) 14(13,8) 11,34 (0,0008) 6(2,3-15,5)
  IgA Bp/Pg>2 4(2,4) 18(17,8) 17,74 (0,00001) 8(3-20,7)
  IgG Bp/Es>2 3(1,8) 10(9,9) 7,22 (0,0072) 5,4(2,06-13,8)
  IgG Bp/Pg>3 5(3) 12(11,8) 6,86 (0,0088) 4,1(1,5-10,6)
GSTTl «+» IgA Bp/Es<2 92(56) 36(35,6) 9,07 (0,0026) 0,4(0,2-1,2)
  IgA Bp/Pg<2 98(59,7) 20(19,8) 11,2 (0,0008) 0,3(6,1-0,9)
  IgG Bp/Es<2 111(67,7) 43(42,6) 14,2 (0,0002) 0,4(0,1-0,9)
  IgG Bp/Pg<3 102(62,2) 40(39,6) 11,1 (0,0008) 0,4(0,2-1,07)
Таблица 5
Результаты обследования пациентки Т.
Генетический полиморфизм Значения соотношений уровней антител
GSTTl «0/0» IgA БП/ЭС 4.4
  IgA БП/ПГ 8,8
  IgG БП/ЭС 2,2
  IgG БП/ПГ 2,7
Таблица 6
Результаты обследования пациентки Н.
Генетический полиморфизм Значения соотношений уровней антител
GSTT1 «0/0» IgA БП/ЭС 5.6
  IgA БП/ПГ 6,3
  IgG БП/ЭС 5,7
  IgG БП/ПГ 8.8
Таблица 7
Результаты обследования пациентки А.
Генетический полиморфизм Значения соотношении уровней антител
GSTTl «+» IgA БП/ЭС 0,9
  IgA БП/ПГ 0,8
  IgG БП/ЭС 1,4
  IgG БП/ПГ 1,8

Способ определения вероятности возникновения врожденных пороков развития плода у беременных женщин, включающий забор крови, определение путем молекулярно-генетического анализа полиморфизма гена фермента детоксикации GSTTl в лимфоцитарной ДНК и путем иммуноферментного анализа антител классов A и G - IgA, IgG, специфичных к бензо[а]пирену Bp, эстрадиолу Es и прогестерону Pg в сыворотке крови, служащих показателями иммунной реакции организма на воздействие тератогенных факторов, и при определении повышенных значений соотношений уровней антител IgA Bp/Es>2, IgA Bp/Pg>2, IgG Bp/Es>2, IgG Bp/Pg>3 у носителей генотипа GSTTl «0/0» делают вывод о высокой индивидуальной чувствительности беременной женщины к действию тератогенных факторов и, как следствие, о высокой вероятности возникновения врожденных пороков развития плода, и при определении пониженных значений соотношений уровней антител IgA Bp/Es≤2, IgA Bp/Pg≤2, IgG Bp/Es≤2, IgG Bp/Pg≤3 у носителей генотипа GSTTl «+» делают вывод о высокой индивидуальной устойчивости беременной женщины к действию тератогенных факторов и, следовательно, о низкой вероятности возникновения врожденных пороков развития плода.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для иммунохимического анализа. Аналитическая ванна для проведения мультиплексного дот-иммуноанализа представляет собой монолитный блок, выполненный из химически инертного термопластичного материала, с набором реакционных ячеек для рабочих и отмывочных растворов и термически герметизированных фольгой, имеющей слой полимерного термопластичного материала. Ячейки ванны выполнены в поперечном сечении в виде вытянутого ассиметричного шестиугольника с острыми противоположно расположенными углами, предназначенными в качестве направляющих при введении в ячейки ванны пластин иммуночипа для предотвращения их контакта с внутренней поверхностью ванны.

Изобретение относится к медицине и описывает способ оценки эффективности стимуляции антиоксидантной активности путем определения концентрации восстановленного глутатиона, при этом дополнительно в инкубационную среду добавляют 1,4-дитиоэритритол и аскорбиновую кислоту и при увеличении уровня восстановленного глутатиона с 0,75 нмоль/мг белка до 0,90 нмоль/мг белка и более стимуляцию антиоксидантной системы оценивают как эффективную, а при росте уровня восстановленного глутатиона с 0,75 нмоль/мг белка до 0,80 нмоль/мг белка и менее стимуляцию антиоксидантной активности оценивают как неэффективную.

Изобретение относится к области медицины и касается рекомбинантных химерных полипептидов, несущих эпитопы различных иммунодоминантных белков спирохет комплекса Borellia Burgdorferisensu lato, и способа серодиагностики иксодового клещевого боррелиоза.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки функционального состояния лимфоцитов человека. Для этого проводят оценку реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) при стимуляции их в течение 72 часов фитогемагглютинином (ФГА) иммуноцитохимическим методом в люминесцентном микроскопе в реакции непрямой иммунофлюоресценции.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу прогнозирования бронхолегочной дисплазии у недоношенных детей с экстремально низкой массой тела (ЭНМТ) при рождении.
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для серологической оценки токсичности анатоксина Bordetella pertussis. Сущность способа заключается в том, что в лунки 96-луночных полистироловых планшетов с иммобилизированной гамма-глобулиновой фракцией кроличьих антисывороток к коклюшному токсину вносят исследуемые образцы полуфабриката бесклеточной коклюшной вакцины, прибавляют к ним пероксидазный конъюгат гамма-глобулиновой фракциии кроличьих антисывороток к коклюшному токсину, добавляют к ним субстратную смесь и регистрируют оптическую плотность смеси и на основе оптической плотности выявляют титр присоединившегося к иммуносорбенту коклюшного токсина.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для количественного определения клеток-предшественников в кроветворной ткани.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии, и может быть использовано для оценки напряженности адаптации у пациентов с ургентной хирургической патологией органов брюшной полости. Способ оценки напряженности адаптации у пациентов с ургентной хирургической патологией органов брюшной полости, характеризующийся тем, что определяют количество лейкоцитов; абсолютные количества CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+, CD25+, CD38+, CD95+ лимфоцитов; абсолютное количество CD16+ нейтрофилов; содержание иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM; количество фагоцитирующих нейтрофилов и циркулирующих иммунных комплексов в крови пациента; затем по формулам множественной регрессии рассчитывают значения пятнадцати главных компонент, определяющих показатели иммунного статуса; затем рассчитывают индивидуальный показатель напряженности адаптации - SГК как среднее квадратическое отклонение попарно между главными компонентами, составляющими между собой 105 пар, по формуле: S Г К = 1 105 ∑ i = 1, x = 1 15 ( Г К i − Г К х ) 2 где ГКi, ГКx - главные компоненты: ГК-1-ГК-15; и при значениях SГК<1,0 оценивают напряженность адаптации как критическую, приводящую к срыву механизмов адаптации.
Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано врачами других специальностей. Сущность способа: у беременных по данным проведенного ультразвукового исследования выявляют наличие новообразований придатков, выявляют наличие синдрома задержки развития плода I и II степени (СЗРП).
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики нарушений микроциркуляции при остеоартрозе у женщин, работающих в условиях физического перенапряжения.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу прогнозирования риска развития рецидива воспалительных заболеваний кишечника. Сущность способа состоит в том, что у больных с воспалительными заболеваниями кишечника с помощью иммуноферментного анализа в крови определяют уровень α-дефензина (αД) в нг/мл в плазме крови и содержание β-дефензина (βД) в нг/г и кальпротектина (ФК) в мкг/г в кале, рассчитывают вероятность развития рецидива воспалительного заболевания кишечника (p) в % по формуле. При полученном значении вероятности, равном или превышающем 50%, прогнозируют высокий риск развития рецидива, а при полученном значении вероятности менее 50% прогнозируют низкий риск развития рецидива. Использование заявленного способа позволяет своевременно спрогнозировать риск развития рецидива воспалительных заболеваний кишечника. 2 пр.
Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно - к лабораторной диагностике и иммунологии, и может быть использовано для проведения исследований клинического материала и пищевых продуктов на наличие ботулотоксинов. Сущность: твердую подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм погружают на 1 ч в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, разведенной 1:100 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2, далее подложку высушивают на воздухе, затем точечно наносят исследуемый материал в объеме 1-2 мкл. После полного впитывания исследуемого материала подложку промывают дважды 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2, содержащим 0.05% твина 20, затем помещают подложку в 2%-ный раствор БСА на ФБР или 2%-ный раствор казеината натрия на ФБР на 30 мин. После чего подложку двукратно промывают ФБР-твином и затем помещают ее в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной частицами коллоидного серебра, на 1 ч. После этого погружают подложку на 3-5 мин в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра, и затем промывают подложку проточной водой. После чего визуально определяют наличие ботулинических токсинов в исследуемом материале: если на подложке формируются серые пятна в местах нанесения материала, то исследуемый материал содержит ботулинические токсины, если на подложке нет окрашивания - материал не содержит ботулинических токсинов. Способ позволяет обнаруживать минимальные количества ботулотоксинов, экспрессен, экономичен, прост в постановке и учете результатов реакции, доступен для широкого применения, может осуществляться в полевых условиях, не требует оснащения дорогостоящими реактивами и оборудованием. 1 з.п. ф-лы, 4 пр.
Изобретение относится к медицине и касается способа определения К-антигена Streptococcus pneumoniae для серологической диагностики циркулирующих штаммов пневмококков путем постановки реакции агглютинации на стекле с использованием определенного набора диагностических агглютинирующих пневмококковых сывороток, состоящего из 4 пуловых сывороток, в составе которых содержатся следующие антитела к К-антигенам, в первой из которых содержатся антитела к К-антигенам: 23F, 19F, 6A, 7F, 4, 14, во второй пуловой сыворотке: 19F, 18C, 9V, 6B, 4, 5, 14, в третьей пуловой сыворотке: 6A, 9V, 19A, 1, 4, 5, 14, в четвертой пуловой сыворотке: 7F, 6B, 1, 3, 5, 14. Изобретение обеспечивает сокращение трудозатрат, снижение трудоемкости, простоту, объективность оценки результата в сроки более короткие (2-3 раза), чем в прототипе. 13 пр.
Изобретение относится к медицине и, в частности к гематологии, вирусологии и инфекционным заболеваниям и описывает способ диагностики вирусных гепатитов путем определения в пробе крови РНК или ДНК вирусов методом ПЦР, при этом в случае отсутствия РНК или ДНК вирусов в сыворотке, плазме крови или «шапке» сгустка крови исследование проводят в сгустке крови больного, предварительно отделенном от сыворотки крови, высушенном и растворенном в физиологическом растворе хлористого натрия, и в случае наличия РНК или ДНК вирусов диагностируют гепатит. Способ обеспечивает повышение точности диагностики. 1 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии. Предложен способ прогнозирования исхода острого периода ишемического инсульта, заключающийся в определении в венозной крови на 1-й день ишемического инсульта соотношения содержания лиганда растворимого 6 члена суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (sFasL) и растворимого рецептора Fas (sFas) (sFasL/sFas), и при соотношении концентраций sFasL/sFas, меньшем или равном 2,41±0,26, прогнозируют благоприятный исход, при большем 2,67 -неблагоприятный исход. 2 пр., 3 ил.
Изобретение относится к области медицинской диагностики и касается способа прогнозирования риска развития рассеянного склероза (РС) у больных с оптическим невритом. Сущность способа: в сыворотке крови пациента с острым оптическим невритом определяют значение разницы оптической плотности при длине волны 492 нм исследуемой сыворотки и контрольной сыворотки, в качестве которой используют смешанный пул сывороток здоровых людей, регистрируют величины пиковой латентности Р100 зрительных вызванных потенциалов (ЗВП) и амплитуды N95 паттерн-электроретинографии (ПЭРГ) на стандартный стимул. При значении разницы оптической плотности исследуемой сыворотки и контрольной сыворотки, равном или более 0,2, снижении амплитуды N95 ПЭРГ на стандартный стимул на 10% и более по сравнению с нормой и удлинении пиковой латентности Р100 ЗВП на 10% и более по сравнению с нормой, прогнозируют высокий риск развития рассеянного склероза. При значении разницы оптической плотности исследуемой сыворотки и контрольной сыворотки менее 0,2, снижении амплитуды N95 ПЭРГ на стандартный стимул менее чем на 10% по сравнению с нормой и удлинении пиковой латентности Р100 ЗВП менее чем на 10% по сравнению с нормой прогнозируют невысокий риск развития PC. Способ обеспечивает повышение надежности прогнозирования риска развития РС, отличается простотой и скоростью выполнения, не требует применения дорогостоящих методов исследования, не связан с травмированием тканей глаза. 2 пр.

Изобретение относится к медицине. При осуществлении способа через 3 ч после перорального введения препарата «Аласенс» в дозе 15 мг/кг массы тела получают трехканальное RGB флуоресцентное изображение зоны интереса. Оценивают долю участия красного канала в изображении опухоли. Оценивают значение Rcut=(R/(R+G+B))·100%, где Rcut - доля участия красного канала в изображении здоровой кожи, R, G и В - яркости красного, зеленого и синего каналов изображения здоровой кожи. Из полученного трехканального RGB флуоресцентного изображения формируют изображение в оттенках серого I(x,y). Для каждой точки изображения I(x,y) вычисляют отношение , где R(x,y), G(x,y), В(x,y) - яркости красного, зеленого и синего каналов RGB флуоресцентного изображения с координатами x, y. Выполняют действие I(x,y)=0 для точек, в которых значение меньше 10%. При отображении опухоли на полученном результирующем изображении I(x,y) диагностируется злокачественная опухоль, а при исчезновении опухоли - доброкачественная. Способ позволяет повысить информационную способность за счет более точного отображения границ недоброкачественной опухоли. 1 прим.

Изобретение относится к области медицинской и ветеринарной иммунологии и предназначено для определения функциональной активности комплемента по его действию на инфузории. В измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий вносят суспензию клеток Tetrahymena pyriformis и испытуемую сыворотку крови с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту. Совпадение динамики изменения числа живых клеток во времени для испытуемой сыворотки и контрольной, представляющей пул 10 сывороток здоровых доноров, предполагает равенство активностей сывороточного комплемента в этих сыворотках. Предлагаемое изобретение обеспечивает универсальный способ расчета определения функциональной активности комплемента с использованием пригодной для всех видов животных мишени для действия активного комплемента, не требующей дополнительной сенсибилизации антителами и не подверженной реактивному лизису. 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 4 пр.

Изобретение относится к способам иммуноанализа для детектирования или количественного измерения искомых аналитов в образцах и может быть использовано в лабораторной и клинической практике для детектирования антител, протеинов, гормонов, лекарственных форм в биологических образцах в широком диапазоне концентраций. Сущность способа заключается в том, что для каждого искомого аналита иммобилизуют на твердом носителе на первой микрозоне первый специфический связывающий компонент с высокой аффинностью к искомому аналиту, на второй микрозоне иммобилизуют первый специфический связывающий компонент с низкой аффинностью к искомому аналиту, на микрозоны одновременно вносят аналит и второй специфический связывающий компонент, меченый первой детектируемой меткой и имеющий высокую аффинность к аналиту, первую смесь инкубируют и получают первый специфический комплекс, меченый первой детектируемой меткой, к первой смеси добавляют третий специфический связывающий компонент, меченый второй детектируемой меткой и имеющий низкую аффинность к искомому аналиту, при этом второй и третий специфические связывающие компоненты имеют идентичную эпитопную специфичность, затем инкубируют вторую смесь и получают второй специфический комплекс, меченый второй детектируемой меткой, удаляют не связавшиеся компоненты реакции и детектируют сигналы меток, связанных с первым и вторым специфическими комплексами в первой и второй микрозонах, концентрацию аналита определяют путем сравнения измеренных сигналов с калибровочной кривой, построенной для известных значений концентрации аналита. Использование способа позволяет повысить точность определения концентраций аналитов. 5 з. п.ф., 3 пр., 8 ил.
Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству, и касается способа прогноза гипертензионных осложнений беременности у пациенток с гестационным сахарным диабетом. Способ основан на исследовании следующих параметров: наличие вариантного аллеля 704С гена AGT: (генотип 704ТС или 704СС), наличие вариантного аллеля 521Т гена AGT (генотип 521СТ или 521ТТ), наличие вариантного аллеля 1166С гена AGTR1 (генотип 1166АС или 1166СС), наличие вариантного аллеля 786С гена NOS3 (генотип 786ТС или 786 СС). Также устанавливают: возраст старше 35 лет, крупный плод в анамнезе, наличие у пациентки ИМТ ≥40 кг/м2, наличие патологии сердечнососудистой системы у родственников. Затем вычисляют прогностический индекс по формуле: Р=0,861 × X1+0,636 × Х2+0,271 × Х3+0,793 × Х4+1,487 × Х5+0,822 × Х6+0,869 × Х7+0,801 × Х8 - 2,421, где X1 - наличие С аллеля гена AGT (полиморфизм 704 Т>С) в генотипе (если есть -1, если нет - 0). Х2 - наличие Т аллеля гена AGT (полиморфизм 521 С>Т) в генотипе (если есть -1, если нет - 0). Х3 - наличие С аллеля гена AGTR1 (полиморфизм 1166 А>С) в генотипе (если есть -1, если нет - 0). Х4 - наличие С аллеля гена NOS3 (полиморфизм 786 Т>С) в генотипе (если есть -1, если нет - 0). Х5 - возраст старше 35 лет (если старше -1, если нет - 0). Х6 - крупный плод в анамнезе (если было - 1, если нет - 0). Х7 - индекс массы тела пациентки >40 кг/м (если>40 кг/м -1, если нет - 0). Х8 - наличие патологии сердечно-сосудистой системы у родственников (если есть - 1, если нет - 0). Const= -2,42129. Если P<0, судят об отсутствии угрозы развития гипертензионных осложнений. Если Р>0, прогнозируют развитие гипертензионных осложнений. Изобретение обладает чувствительностью 80%, специфичностью 74,47%, эффективностью 75%. Данная формула позволяет прогнозировать развитие гипертензионных осложнений до появления клинических признаков. 2 пр.
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2014-05-27 2014-05-26T14:52:08
Наверх