Способ оценки эффективности стимуляции антиоксидантной активности




Владельцы патента RU 2516925:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт кардиологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (RU)
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Национальный исследовательский Томский политехнический университет" (RU)
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к медицине и описывает способ оценки эффективности стимуляции антиоксидантной активности путем определения концентрации восстановленного глутатиона, при этом дополнительно в инкубационную среду добавляют 1,4-дитиоэритритол и аскорбиновую кислоту и при увеличении уровня восстановленного глутатиона с 0,75 нмоль/мг белка до 0,90 нмоль/мг белка и более стимуляцию антиоксидантной системы оценивают как эффективную, а при росте уровня восстановленного глутатиона с 0,75 нмоль/мг белка до 0,80 нмоль/мг белка и менее стимуляцию антиоксидантной активности оценивают как неэффективную. Способ обеспечивает повышение точности, прост в осуществлении и интерпретации полученных результатов. 1 табл.

 

Известны способы оценки эффективности антиоксидантной активности путем определения роста общего содержания SH-групп белков [Microtubule dynamics and glutathione metabolism in phagocytizing human polymorphonuclear leukocytes / B.R. Burchill, J.M. Oliver, С.B. Pearson et al. // J. of Cell Biology. - 1978. - Vol.76, №2. - P.439-447], но данная методика не позволяет оценить уровень восстановленного глутатиона, а, следовательно, оценить эффективность антиоксидантной активности. Известен также способ косвенного определения содержания восстановленного глутатиона по активности глутатионпероксидазы [Медицинские лабораторные технологии: В 2-х томах. / Под ред. А.И. Карпищенко - Т.2 / А.И. Карпищенко. - СПб.: Интермедика. - 1999. - 656 с.], однако активность этого фермента зависит от конформации активного центра фермента. При изменении конформации активного центра фермента его активность меняется, что не позволяет с высокой точностью оценить уровень восстановленного глутатиона, а, следовательно, оценить эффективность антиоксидантной активности. Известен также способ косвенного определения концентрации восстановленного глутатиона по активности глутатионредуктазы [Медицинские лабораторные технологии: В 2-х томах. / Под ред. А.И. Карпищенко - Т.2 / А.И. Карпищенко. - СПб.: Интермедика. - 1999. - 656 с.], однако активность этого фермента зависит от конформации активного центра фермента. При изменении конформации активного центра фермента его активность меняется, что не позволяет достоверно в любой ситуации оценить с высокой точностью уровень восстановленного глутатиона, а следовательно, оценить эффективность антиоксидантной активности.

Известен также способ оценки эффективности антиоксидантной активности по содержанию восстановленного глутатиона, предложенный М.Е. Anderson (1985) в модификации S. Kojima et al. (2004) [Low dose gamma-rays activate immune functions via induction of glutathione and delay tumor growth / S. Kojima, K. Nakayama, H. Ishida // J. Radiat. Res. - 2004. - Vol.45, №1. - P.33-39], основанный на взаимодействии восстановленного глутатиона (GSH) с 5,5'-дитио-бис(2-нитробензойной) кислотой (ДТНБ). При этом образуется окисленный глутатион (GSSG), который затем восстанавливается и вновь взаимодействует с ДТНБ. Данный способ является наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату и выбран в качестве прототипа.

Недостатком данного способа является невозможность стимуляции эффективности работы антиоксидантной активности.

Целью предлагаемого изобретения является повышение эффективности и точности способа.

Указанная цель достигается дополнительным добавлением в инкубационную среду 1,4-дитиоэритритола и аскорбиновой кислоты для оценки эффективности стимуляции антиоксидантной активности.

Новым в данном способе является внесение в инкубационную среду 1,4-дитиоэритритола и аскорбиновой кислоты, без которых невозможна стимуляция антиоксидантной активности и последующая оценка ее эффективности.

Следовательно, только комплексная модернизация способа-прототипа позволяет получить желаемый результат. Только комплексное внесение в инкубационную смесь 1,4-дитиоэритритола и аскорбиновой кислоты позволяет повысить точность оценки эффективности стимуляции антиоксидантной активности, а именно при увеличении уровня восстановленного глутатиона с 0,75 нмоль/мг белка до 0,90 нмоль/мг белка и более стимуляцию антиоксидантной активности оценивают как эффективную, а при росте уровня восстановленного глутатиона с 0,75 нмоль/мг белка до 0,80 нмоль/мг белка и менее стимуляцию антиоксидантной активности оцениваем как неэффективную.

Антиоксидантная система направлена на эффективную нейтрализацию прооксидантов и снижение токсичной для организма гидроперекиси. Основным компонентом антиокидантной системы является восстановленная форма глутатиона.

Глутатион - трипептид (L-γ-глутамил-L-цистеилглицин) с молекулярной массой 307 Da, занимает особое место среди SH-содержащих соединений. Наличие γ-глутамильной связи защищает трипептид от ферментативной деградации. В организме глутатион присутствует в двух формах: окисленной - GSSG и восстановленной - GSH, причем содержание GSH в клетках на несколько порядков выше, чем GSSG [Колесниченко Л.С, 1989; Wu G. et al., 2004; Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н., 2005; Марри Р. и соавт., 2009]. По данным P. Pietarinen-Runtti et al. (2000), концентрация GSH в нейтрофилах составляет около 5 нмоль/мг белка. Содержание глутатиона в сыворотке крови здоровых людей незначительно, поэтому клетки основную потребность в GSH обеспечивают путем нематричного синтеза [Wu G. et al., 2004] в ходе двух последовательных реакций, катализируемых γ-глутамилцистеин-синтетазой (КФ 6.3.2.2) и глутатион-синтетазой (КФ 6.3.2.3) [Кулинский В.И., 1990; Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н., 2005; Марри Р. и соавт., 2009]. Лимитирующим звеном синтеза является образование γ-глутамилцистеина, зависящее от наличия L-цистеина и его способности окисляться в L-цистин [Зенков Н.К. и соавт., 2001]. В то же время недостаточность глутатион-синтетазы способствует развитию окислительных повреждений в нейтрофилах [Spielberg S.P. et al., 1979].

Глутатион при физиологических значениях pH имеет две анионные карбоксигруппы, положительно заряженную аминогруппу и SH-группу цистеинового остатка, которая придает GSH свойства восстановителя и способность быстро обезвреживать свободные радикалы и АФК [Day R.M., 2005; Zhu Y., 2007; Circu C.L. et al., 2009]. Глутатин является типичным тиолом и, участвуя в одноэлектронных восстановительных реакциях, становится GS·, который димеризуется до GSSG, легко реагирующего со свободными SH-группами. Второй тип окислительно-восстановительных превращений с участием GSH - это реакции тиолдисульфидного обмена, которые известны как основной путь образования смешанных дисульфидов глутатиона с белками (белок-SSG) и играют роль в регуляции биологических процессов [Chai Y.C. et al., 1994]. В реакциях третьего типа происходит двухэлектронпое окисление глутатиона с образованием интермедиата, который реагирует со второй молекулой GSH (получение GSSG) или иной молекулой (синтез смешанного дисульфида) [Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н., 2005].

GSH является ингибитором АФК и стабилизатором мембран [Биленко М.В, 1989; Udupi V., 1992; Trudel S. et al., 2009]. Он защищает клеточные структуры нейтрофилов от высокотоксичного OCI-, производимого МПО [Carr А.С., Winterbourn С.С., 1997], при этом GSH превращается в глутатион-сульфонамид и дегидроглутатион [Harwood D.T. et al., 2006]. Связывая NO, глутатион образует токсичные для клетки нитрозильные комплексы. Моно нитрозоглутатион может активировать апоптоз [Turpaev К.Т. et al., 1997].

Не всегда восстановительного потенциала GSH достаточно для полной нейтрализации прооксидантов. Существует мнение, что взаимодействие GSH с органическими радикалами эффективно только в условиях удаления O 2 ⋅ − , поэтому глутатион образует с супероксиддисмутазой своеобразную антиоксидантную систему, ибо в противном случае развиваются реакции образования H2O2 и GS· [Панкин В.З. и соавт., 1997; Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006]. В сочетании с витамином B12 глутатион, а также N-ацетилцистеин могут потенцировать прооксидантное и цитотоксическое действие на клетку [Соловьева М.Е. и соавт., 2007].

Основной антиоксидантный эффект GSH реализует посредством участия в работе ферментов. Глутатион выступает донором водорода при восстановлении Н2О2 и перекисей липидов глутатион-пероксидазами и глутатион-8-трансферазами (ГТ) [Hirayama К., 1989; Sies Н. et al., 1997; Кулинский В.И., 1990; Hayes J.D. et al., 2005; Зенков H.K.. и соавт., 2009; Liu G. et al., 2010]. Высокая активность глутатион-редуктазы и накопление GSH оказывает протекторный эффект в отношении альвеолярных макрофагов, инкубируемых с прооксидантами in vitro [Pietarinen Р.К. 1995].

С изменением окислительно-восстановительного баланса сопряжено большое количество реакций, поэтому поддержание оптимального редокс-состояния цитозоля выступает важным условием нормальной жизнедеятельности клеток. Высокая концентрация глутатиона в цитоплазме, его редокс-активность и возможность поддержания в восстановленном состоянии делают систему GSH/GSSG важнейшим внутриклеточным редокс-буфером [Reed М.С.et al., 2008]. Концентрация GSH в клетке в 500-1000 раз превышает уровень НАДФН и других внутриклеточных редокс-систем, поэтому изменения соотношения GSH/GSSG прямо отражают изменения редокс-статуса клетки [Кулинский В.И., 2007; Asian М, Canatan D., 2008; Reed М.С, 2008]. Считают, что буферная емкость системы глутатиона защищает репликативную систему клетки, а дефицит GSH в условиях высокой генерации АФК приводит к снижению синтеза ДНК и белков [Poot М., 1991; Панкин В.З., 1997; Day R.M., Suzuki Y.J., 2005; Liu G. et al., 2010].

К природным антиоксидантам относят также аскорбиновую кислоту, которая играет важную роль в развитии окислительного стресса в организме.

Аскорбиновая кислота реализует свое антиоксидантное действие в плазме, межклеточной жидкости и на внеклеточном уровне. В организме человека аскорбиновая кислота преимущественно представлена в L-форме. Стрессовые ситуации увеличивают количество метаболитов витамина С в виде дегидроаскорбиновой кислоты.

Аскорбиновая кислота и дегидроаскорбиновая кислота играют активную роль в нескольких процессах, включая защиту от инфекции, повышении иммунности, в процессах заживления ран, а также принимая участие в образовании антистрессовых гормонов. Аскорбат является кофактором дофамин-β-гидроксилазы, которая катализирует синтез норадреналина и других катехоламинов. Аскорбиновая кислота является восстановителем для L-пролингидроксилазы, которая необходима для синтеза коллагена и соединительной ткани в целом. В организме с участием аскорбиновой кислоты происходит регенерация α-токоферола из токофероксильного радикала. Окислительный стресс коррелирует с ухудшением секреции инсулина, а терапия аскорбиновой кислотой прерывает повреждающее действие свободных радикалов, уменьшает степень проявления инсулиновой резистентности [М.И. Балаболкин и соавт., 2003]. Ионы аскорбата является одним из активных элементов системы антиоксидантной защиты, предохраняя липиды от окисления их пероксидными радикалами. Антиоксидантный эффект аскорбата проявляется при достаточном количестве других антиоксидаитов, таких как α-токоферол и глутатион. Глутатион восстанавливает дегидроаскорбиновую кислоту прямым и неферментативным путем до аскорбиновой кислоты. Эта реакция является одним из основных механизмов антиоксидантной системы, часто описываемых как восстановительные циклы - глутатион/глутатиондисульфид и аскорбиновая/дегидроаскорбиновая кислота. При этом клетки периферических тканей поглощают экзогенную дегидроаскорбиновую кислоту и в присутствии глутатиона конвертируют ее в цитоплазме в аскорбиновую кислоту. Восстановление глутатиондисульфида в глутатион катализируется глутатион редуктазой и требует участия NADPH в качестве кофактора. Недостаточность глутатиона снижает содержание аскорбиновой кислоты в тканях и одновременно повышает концентрацию дегидроаскорбиновой кислоты.

При недостатке α-токоферола и глутатиона может превалировать прооксидантный эффект аскорбата и его метаболитов. Прооксидантный эффект аскорбиновой кислоты может наблюдаться не только при недостатке α-токоферола и глутатиона, но и при применении высоких доз аскорбиновой кислоты. Избежать прооксидантного эффекта аскорбиновой кислоты можно в случае создания адекватного внутриклеточного уровня восстановленного глутатиона.

Исходя из вышесказанного целесообразно использовать в эксперименте комплексное применение аскорбата с протектором SH-групп, а именно 1,4-дитиоэритритолом. Для проникновения внутрь клетки пассивным транспортом происходит превращение аскорбиновой кислоты в дегидроаскорбиновую кислоту, затем последняя подвергается обратимому превращению в аскорбиновую кислоту при участии восстановленного глутатиона. Следовательно, комплексная модернизация способа-прототипа позволяет повысить точность оценки эффективности стимуляции антиоксидантной активности.

Каждый вновь введенный в формулу изобретения признак выполняет функцию повышение точности и эффективности способа: дополнительное добавление в инкубационную среду 1,4-дитиоэритритола и аскорбиновой кислоты для последующего определения восстановленного глутатиона.

Роль антиоксидантной системы клетки заключается в снижении токсического эффекта свободных радикалов, в том числе и гидроперекисей липидов.

Антиоксидантную защиту обеспечивает широкий круг веществ, различных по происхождению, физико-химической природе и механизмам действия. Общим их свойством, по определению J.M. Gutteridge (1992), является способность, присутствуя в низких по сравнению с окисляемым субстратом концентрациях, существенно задерживать или ингибировать его окисление. Постоянное образование прооксидантов должно быть уравновешено их инактивацией, поэтому для поддержания гомеостаза необходима адекватная ситуации непрерывная регенерация антиоксидантной способности клеток [Зенков Н.К. и соавт., 2001; Blokhina O.et al., 2003].

Общепринятой номенклатуры антиоксидантов в настоящее время не существует, хотя ряд авторов [Dirnascio Р., 1990; Kalra V. et al., 2001; Зайцев В.Г. и соавт., 2003] выделяет два класса: превентивные, снижающие скорость инициации цепной реакции окисления, и гасящие (прерывающие цепь), препятствующие развитию цепной реакции. К превентивным относят каталазу и пероксидазы, разрушающие ROOH, а также агенты, образующие хелатные комплексы с металлами переменной валентности, к прерывающим цепь - фенолы, ароматические амины. В условиях in vivo главными гасящими антиоксидантами являются: витамин E, нейтрализующий ROO· в липидной фазе мембран [Jore D. et al., 1990; Hong J.H. et al., 2004], фермент СОД, улавливающий O 2 ⋅ − в водной фазе клетки [Fridovich I., 1989; Dirnascio P., 1990; Ciurea D., 1992], и церулоплазмин - белок острой фазы, выполняющий антирадикальную функцию в крови [Marklund S.L., 1987; Atanasiu R.X. et al., 1998].

Более известно деление антиоксидантов на ферменты и соединения неферментативной природы. Последние в определенных концентрациях всегда присутствуют в липидной фазе мембран и водных средах организма и расходуются первыми при устранении проявлений окислительного стресса [Droge W., 2002; Blokhina О., 2003]. Ферменты наиболее активно присоединяется к АОЗ после включения механизмов индукции [Лущак В.И., 2001]. При возникновении ОС расход антиоксидантов возрастает и меняется экспрессия генов, кодирующих белковые компоненты АОЗ [Дубинина Е.Е., 2006]. Между ферментами и неферментативными элементами АОЗ существует равновесие, причем последние при ряде патологических состояний организма могут выступать в качестве прооксидантов [Зенков Н.К. и др., 2001].

Главную роль среди неферментавных аитиоксидантных систем защиты отводят глутатиону.

В настоящее время в лабораторной практике наиболее распространен способ оценки эффективности антиоксидантной активности с помощью определения восстановленного глутатиона.

Содержание восстановленного глутатиона определяют методом, предложенным М.Е. Anderson (1985) в модификации S. Kojima et al. (2004) [Kojima, S. Low dose gamma-rays activate immune functions via induction of glutathione and delay tumor growth / S. Kojima, K. Nakayama, H. Ishida // J. Radiat. Res. - 2004. - Vol.45, №1. - P.33-39]. Принцип метода основан на взаимодействии GSH с 5,5'-дитио-бис(2-нитробензойной) кислотой (ДТНБ) с образованием тио-2-нитробензойной кислоты, водный раствор которой имеет максимум поглощения при длине волны 412 нм. При этом образуется GSSG, который восстанавливается глутатионредуктазой до GSH и вновь взаимодействует с ДТНБ. Скорость образования окрашенного продукта пропорциональна содержанию общего глутатиона. Для определения содержания GSSG пробы прединкубируются с блокатором SH-групп 2-винилпиридином («Wako», Япония), который необратимо связывает GSH и, следовательно, скорость образования окрашенного продукта пропорциональна содержанию GSSG.

Лизат лимфоцитов крови готовят на 5% сульфосалициловой кислоте, которая осаждает белки, но не ингибирует активность глутатионредуктазы. Количество общего глутатиона (GSH и GSSG) определяют в пробе содержащей 0,1 М Na-фосфатный буфер (pH=7,5) с 1 мМ ЭДТА, 0,4 мМ НАДФН2, 0,3 мМ ДТНБ и 1 U/мл глутатион-редуктазы («Wako», Япония). При измерении уровня GSSG супернатант предварительно инкубируют 30 мин с 10 мМ 2-винилпиридином, после чего определяют скорость реакции в описанной выше инкубационной среде. Расчет содержания общего и окисленного глутатиона производят с помощью калибровочных графиков, для построения которых растворы GSH и GSSG («Sigma», США) в концентрации от 3 до 100 мкМ обрабатывают аналогично опытным пробам. Концентрацию GSH рассчитывают как разницу между концентрацией общего глутатиона и GSSG, выражая результат в нмоль/мг белка.

Концентрацию белка в лимфоцитах крови определяют методом [A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Analyt. Biochem. - 1976. - Vol.7, №1, 2. - P.248-254], основанным на взаимодействии Кумасси голубого G-250 с остатками аргинина и лизина в белках. Свободный краситель красного цвета (максимум поглощения - 495 нм) при образовании комплекса с белком переходит в синюю форму (максимум поглощения - 595 нм).

К 0,1 мл лизата лимфоцитов крови добавляют 1,0 мл раствора Кумасси голубого (100 мг красителя, 50 мл 96° этанола, 100 мл 85% H3PO4, H2O до 1,0 л), перемешивают, инкубируют 3 мин при комнатной температуре и измеряют оптическую плотность проб (длина волны 595 нм) против контроля, содержащего 0,1 мл воды и 1,0 мл раствора Кумасси голубого. Содержание белка рассчитывают по калибровочной кривой, построенной по разведениям стандартного раствора альбумина (1,0 мг/мл) и выражают в мг/мл.

В настоящее время крайне важно для оценки эффективности антиоксидантной активности оценить уровень восстановленного глутатиона и осуществить стимуляцию антиоксидантной активности, а затем оценить ее эффективность. Для решения этой задачи предложен новый способ оценки эффективности стимуляции антиоксидантной активности после дополнительного добавления в инкубационную среду 1,4-дитиоэритритола и аскорбиновой кислоты.

Все сказанное свидетельствует о крайней важности разработки способа оценки эффективности стимуляции антиоксидантной активности для защиты клеток от токсического действия активных форм кислорода.

Популярность указанного выше способа обоснован его высокой чувствительностью, простотой осуществления и достаточной адекватностью получаемых результатов, лежащих в основе определения восстановленного глутатиона.

Существенные признаки, характеризующие изобретения проявили в заявленной совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области, и не являются очевидными для специалиста.

Идентичной совокупности признаков не обнаружено при изучении патентной и научной медицинской литературы.

Данное изобретение может быть использовано в медицинской практике для повышения точности оценки эффективности стимуляции антиоксидантной активности при различных заболевания. Таким образом, следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности: «новизна», «изобретательский уровень», «промышленная применимость».

Метод основан на определении восстановленного глутатиона.

Способ осуществляется следующим образом поэтапно:

1. Выделение лимфоцитов крови из венозной крови.

Пробирки с венозной гепаринизированной кровью (25 Ед./мл) выдерживали при температуре 37°C в течение 40 минут для отделения плазмы и эритроцитов. Затем пробирки переносят в стерильный ламинарный шкаф для выполнения процедуры выделения лимфоцитов крови. Полученную плазму наслаивают на градиент плотности Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция) (ρ=1,077 г/см3) в соотношении 1:2 и центрифугируют при 500 g в течение 20 минут [Bignold L.P., 1987]. После центрифугирования собирают образовавшееся интерфазное кольцо из смеси мононуклеарных клеток в стерильную центрифужную пробирку с 4,5 мл питательной среды ((90% RPMI-1640 («Вектор-Бест», Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот», Россия), инактивированной при температуре 56°C в течение 30 мин, 0,3 мг/мл L-глутамина («Борисовский ЗМП», Беларусь), 100 мкг/мл гентамицина, 2 ммоль/мл Hepes («Flow», Великобритания)), затем центрифугируют 10 минут при 500 g. Процедуру отмывки повторяют дважды: последовательно ресуспендируя клетки и затем центрифугируя в течение 10 минут при 500 g. Выделение лимфоцитов из мононуклеарной фракции клеток проводят на двойном градиенте Перколла [Ulmer A.J., 1979]. Стандартный изоосмотический раствор Перколла (SIP) получают смешиванием одного объема 10х PBS (фосфатно-солевого буфера (pH 7,4)) с девятью объемами Перколла («Sigma», США) (плотность полученного раствора - 1,130 г/мл). Затем готовят 47,5% стандартный изоосмотический раствор Перколла (47,5% SIP) и 15,0% стандартный изоосмотический раствор Перколла (15,0% SIP). К клеточной суспензии добавляют 1,5 мл SIP (4°C), перемешивают и переносят в новую стерильную пробирку. Сверху наслаивают 5 мл 47,5% SIP (4°C). Создают верхнюю фазу посредством 2 мл 15,0% SIP (4°C). Центрифугируют при 1500 g и 4°C 45 минут. Собирают интерфазное кольцо (лимфоцитарную фракцию клеток). Объем доводят до 5 мл питательной средой ((90% RPMI-1640 («Вектор-Бест», Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот», Россия), инактивированной при температуре 56°C в течение 30 мин, 0,3 мг/мл L-глутамина («Борисовский ЗМП», Беларусь), 100 мкг/мл гентамицина, 2 ммоль/мл Hepes («Flow», Великобритания)), температура раствора должна соответствовать 37°C. Далее проводят центрифугирование при 700 g и 20°C в течение 10 минут. Затем удаляют супернатант до конечного объема 1 мл.

2. Количественное определение численности жизнеспособных лимфоцитов крови с помощью окраски трипановым синим микроскопическим методом.

Лимфоциты крови ресуспендируют в 1 мл клеточной взвеси. Отбирают 100 мкл ресуспендированной клеточной суспензии и добавляют 100 мкл 0,1% раствора трипанового синего на физрастворе, хорошо перемешивают и заполняют камеру Горяева. Предварительно к камере притирают покровное стекло так, чтобы появлялись радужные, ньютоновые кольца (только при этих условиях соблюдался правильный объем камеры). Каплю клеточной взвеси с красителем вносят под притертое покровное стекло. Подсчет клеток производят в 5-ти больших квадратах по диагонали камеры Горяеева. Расчет клеточности лимфоцитов крови производят по формуле:

A×106=(число клеток)/4

где, A - клеточность лимфоцитов крови.

3. Внесение в инкубационную смесь заявленных добавок.

В культуральную смесь добавляют соединения: 1,4-дитиоэритритол в концентрации 5 мМ и аскорбиновую кислоту в конечной концентрации 0,14 мМ.

4. Биохимическое исследование восстановленного глутатиона.

Лизат лимфоцитов готовят на 5% сульфосалициловой кислоте, которая осаждает белки, но не ингибирует активность глутатионредуктазы. Количество общего глутатиона (GSH и GSSG) определяют в пробе содержащей 0,1 М Na-фосфатный буфер (pH=7,5) с 1 мМ ЭДТА, 0,4 мМ НАДФН2, 0,3 мМ ДТНБ и 1 U/мл глутатионредуктазы («Wako», Япония). Окисленный глутатион определяют аналогичным способом в клеточном лизате после предварительной инкубации пробы в течение 30 мин с 10 мМ 2-винилпиридином. Расчет содержания общего и окисленного глутатиона производят с помощью калибровочных графиков, для построения которых используют растворы GSH и GSSG («МР», США) в концентрации от 3 до 100 мкМ, обработанные аналогично опытным пробам. Концентрацию GSH рассчитывают как разницу между концентрацией общего глутатиона и GSSG, выражая результат в нмоль/мг белка.

Исследование антиоксидантной активности по способу-прототипу и предлагаемому способу выполнялось 40 раз. Результаты исследования обработаны статистически с использованием пакета программ Stat Soft Statistica 6.0.

При проведении исследования по способу-прототипу уровень восстановленного глутатиона составил 0,75±0,06 нмоль/мг белка, а при оценке по предлагаемому способу в случае эффективной стимуляции антиоксидантной активности уровень восстановленного глутатиона составил 0,92±0,08 нмоль/мг белка, а в случае не эффективной стимуляции антиоксидантной активности уровень восстановленного глутатиона составил 0,80±0,07 нмоль/мг белка (табл.1). То есть при эффективной стимуляции антиоксидантной активности уровень восстановленного глутатиона возрастает на 19% и более, а при неэффективной стимуляции антиоксидантной активности уровень восстановленного глутатиона увеличивается менее чем на 5%.

Полученные результаты уровня восстановленного глутатиона соответствую данным литературы [Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н., 2005].

Итак, при применении способа-прототипа был получен недостаточно точный результат, не позволивший установить эффективность стимуляции антиоксидантной активности, что связано с отсутствием биохимической стимуляции процесса, а наиболее эффективным и точным был предлагаемый способ.

При этом предлагаемый способ прост в исполнении и интерпретации полученных результатов.

Таблица 1
Оценка эффективности стимуляции антиоксидантной активности
Определение GSH по способу-прототипу Определение GSH по предлагаемому способу
До стимуляции После стимуляции с ростом GSH
  До 0,90 нмоль/мг белка и более До 0,08 нмоль/мг белка и менее
n=40 n=40 n=34 n=6
0,73±0,07 нмоль/мг белка 0,75±0,06 нмоль/мг белка 0,92±0,08 нмоль/мг белка 0,803±0,07 нмоль/мг белка

Способ оценки эффективности стимуляции антиоксидантной активности путем определения концентрации восстановленного глутатиона, отличающийся тем, что дополнительно добавляют в инкубационную среду 1,4-дитиоэритритол и аскорбиновую кислоту и при увеличении уровня восстановленного глутатиона с 0,75 нмоль/мг белка до 0,90 нмоль/мг белка и более стимуляцию антиоксидантной системы оценивают как эффективную, а при росте уровня восстановленного глутатиона с 0,75 нмоль/мг белка до 0,80 нмоль/мг белка и менее стимуляцию антиоксидантной активности оценивают как неэффективную.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины и касается рекомбинантных химерных полипептидов, несущих эпитопы различных иммунодоминантных белков спирохет комплекса Borellia Burgdorferisensu lato, и способа серодиагностики иксодового клещевого боррелиоза.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки функционального состояния лимфоцитов человека. Для этого проводят оценку реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) при стимуляции их в течение 72 часов фитогемагглютинином (ФГА) иммуноцитохимическим методом в люминесцентном микроскопе в реакции непрямой иммунофлюоресценции.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу прогнозирования бронхолегочной дисплазии у недоношенных детей с экстремально низкой массой тела (ЭНМТ) при рождении.
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для серологической оценки токсичности анатоксина Bordetella pertussis. Сущность способа заключается в том, что в лунки 96-луночных полистироловых планшетов с иммобилизированной гамма-глобулиновой фракцией кроличьих антисывороток к коклюшному токсину вносят исследуемые образцы полуфабриката бесклеточной коклюшной вакцины, прибавляют к ним пероксидазный конъюгат гамма-глобулиновой фракциии кроличьих антисывороток к коклюшному токсину, добавляют к ним субстратную смесь и регистрируют оптическую плотность смеси и на основе оптической плотности выявляют титр присоединившегося к иммуносорбенту коклюшного токсина.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для количественного определения клеток-предшественников в кроветворной ткани.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии, и может быть использовано для оценки напряженности адаптации у пациентов с ургентной хирургической патологией органов брюшной полости. Способ оценки напряженности адаптации у пациентов с ургентной хирургической патологией органов брюшной полости, характеризующийся тем, что определяют количество лейкоцитов; абсолютные количества CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+, CD25+, CD38+, CD95+ лимфоцитов; абсолютное количество CD16+ нейтрофилов; содержание иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM; количество фагоцитирующих нейтрофилов и циркулирующих иммунных комплексов в крови пациента; затем по формулам множественной регрессии рассчитывают значения пятнадцати главных компонент, определяющих показатели иммунного статуса; затем рассчитывают индивидуальный показатель напряженности адаптации - SГК как среднее квадратическое отклонение попарно между главными компонентами, составляющими между собой 105 пар, по формуле: S Г К = 1 105 ∑ i = 1, x = 1 15 ( Г К i − Г К х ) 2 где ГКi, ГКx - главные компоненты: ГК-1-ГК-15; и при значениях SГК<1,0 оценивают напряженность адаптации как критическую, приводящую к срыву механизмов адаптации.
Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано врачами других специальностей. Сущность способа: у беременных по данным проведенного ультразвукового исследования выявляют наличие новообразований придатков, выявляют наличие синдрома задержки развития плода I и II степени (СЗРП).
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики нарушений микроциркуляции при остеоартрозе у женщин, работающих в условиях физического перенапряжения.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа количественного определения фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253». Способ предусматривает обеззараживание и выделение РНК из вируссодержащего материала, постановку реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме «реального времени» с использованием специфичных праймеров RV5-5'-GTTGGGCACTGAAACTGCTA-3', RV6-5'-GAATCTCCGGGTTCAAGAGT-3' и зонда RV7-5'-ROX-AATCCTCCTTGAACTCCATGCGACAGA-BHQ2.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к полипептиду, несущему эпитоп BNP(1-32) человека, для получения лигандов, направленных против BNP(1-32) человека или proBNP(1-108) человека, где указанный полипептид имеет формулу a 1 − R 1 − X 1 − F G R K M D R − X 2 − R 2 − a 2 .

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для иммунохимического анализа. Аналитическая ванна для проведения мультиплексного дот-иммуноанализа представляет собой монолитный блок, выполненный из химически инертного термопластичного материала, с набором реакционных ячеек для рабочих и отмывочных растворов и термически герметизированных фольгой, имеющей слой полимерного термопластичного материала. Ячейки ванны выполнены в поперечном сечении в виде вытянутого ассиметричного шестиугольника с острыми противоположно расположенными углами, предназначенными в качестве направляющих при введении в ячейки ванны пластин иммуночипа для предотвращения их контакта с внутренней поверхностью ванны. По верхнему краю ванны выполнен выпуклый сварочный профиль в виде клиновидных в сечении буртиков, окантовывающих каждую ячейку. Изобретение обеспечивает повышение качества проведения иммунохимических реакций в ванне за счет исключения прилипания иммуночипов к внутренней поверхности стенок ячеек. 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике, и может быть использовано для определения вероятности возникновения врожденных пороков развития плода у беременных женщин. Для этого проводят забор крови, определяют путем молекулярно-генетического анализа полиморфизм гена фермента детоксикации GSTT1 в лимфоцитарной ДНК. Затем выявляют путем иммуноферментного анализа антител класса А и G - IgA, IgG, специфичных к бензо[а]пирену Bp, эстрадиолу Es и прогестерону Pg в сыворотке крови, служащих показателями иммунной реакции организма на воздействие тератогенных факторов. При определении повышенных значений соотношений уровней антител IgA Bp/Es>2, IgA Bp/Pg>2, IgG Bp/Es>2, IgG Bp/Pg>3 у носителей генотипа GSTT1 «0/0» делают вывод о высокой индивидуальной чувствительности беременной женщины к действию тератогенных факторов. В связи с этим делают прогноз о высокой вероятности возникновения врожденных пороков развития плода. При определении пониженных значений соотношений уровней антител IgA Bp/Es<2, IgA Bp/Pg<2, IgG Bp/Es<2, IgG Bp/Pg<3 у носителей генотипа GSTT1 «+» делают вывод о высокой индивидуальной устойчивости беременной женщины к действию тератогенных факторов. В связи с этим делают прогноз о низкой вероятности возникновения врожденных пороков развития плода. Предложенный способ обеспечивает повышение точности и информативности определения вероятности врожденных пороков. 3 пр., 7 табл.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу прогнозирования риска развития рецидива воспалительных заболеваний кишечника. Сущность способа состоит в том, что у больных с воспалительными заболеваниями кишечника с помощью иммуноферментного анализа в крови определяют уровень α-дефензина (αД) в нг/мл в плазме крови и содержание β-дефензина (βД) в нг/г и кальпротектина (ФК) в мкг/г в кале, рассчитывают вероятность развития рецидива воспалительного заболевания кишечника (p) в % по формуле. При полученном значении вероятности, равном или превышающем 50%, прогнозируют высокий риск развития рецидива, а при полученном значении вероятности менее 50% прогнозируют низкий риск развития рецидива. Использование заявленного способа позволяет своевременно спрогнозировать риск развития рецидива воспалительных заболеваний кишечника. 2 пр.
Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно - к лабораторной диагностике и иммунологии, и может быть использовано для проведения исследований клинического материала и пищевых продуктов на наличие ботулотоксинов. Сущность: твердую подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм погружают на 1 ч в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, разведенной 1:100 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2, далее подложку высушивают на воздухе, затем точечно наносят исследуемый материал в объеме 1-2 мкл. После полного впитывания исследуемого материала подложку промывают дважды 0.01 M фосфатным буфером pH 7.2, содержащим 0.05% твина 20, затем помещают подложку в 2%-ный раствор БСА на ФБР или 2%-ный раствор казеината натрия на ФБР на 30 мин. После чего подложку двукратно промывают ФБР-твином и затем помещают ее в раствор поливалентной противоботулинической сыворотки, меченной частицами коллоидного серебра, на 1 ч. После этого погружают подложку на 3-5 мин в водный раствор, содержащий 0.5% лимонной кислоты, 0.1% метола и 0.2% азотнокислого серебра, и затем промывают подложку проточной водой. После чего визуально определяют наличие ботулинических токсинов в исследуемом материале: если на подложке формируются серые пятна в местах нанесения материала, то исследуемый материал содержит ботулинические токсины, если на подложке нет окрашивания - материал не содержит ботулинических токсинов. Способ позволяет обнаруживать минимальные количества ботулотоксинов, экспрессен, экономичен, прост в постановке и учете результатов реакции, доступен для широкого применения, может осуществляться в полевых условиях, не требует оснащения дорогостоящими реактивами и оборудованием. 1 з.п. ф-лы, 4 пр.
Изобретение относится к медицине и касается способа определения К-антигена Streptococcus pneumoniae для серологической диагностики циркулирующих штаммов пневмококков путем постановки реакции агглютинации на стекле с использованием определенного набора диагностических агглютинирующих пневмококковых сывороток, состоящего из 4 пуловых сывороток, в составе которых содержатся следующие антитела к К-антигенам, в первой из которых содержатся антитела к К-антигенам: 23F, 19F, 6A, 7F, 4, 14, во второй пуловой сыворотке: 19F, 18C, 9V, 6B, 4, 5, 14, в третьей пуловой сыворотке: 6A, 9V, 19A, 1, 4, 5, 14, в четвертой пуловой сыворотке: 7F, 6B, 1, 3, 5, 14. Изобретение обеспечивает сокращение трудозатрат, снижение трудоемкости, простоту, объективность оценки результата в сроки более короткие (2-3 раза), чем в прототипе. 13 пр.
Изобретение относится к медицине и, в частности к гематологии, вирусологии и инфекционным заболеваниям и описывает способ диагностики вирусных гепатитов путем определения в пробе крови РНК или ДНК вирусов методом ПЦР, при этом в случае отсутствия РНК или ДНК вирусов в сыворотке, плазме крови или «шапке» сгустка крови исследование проводят в сгустке крови больного, предварительно отделенном от сыворотки крови, высушенном и растворенном в физиологическом растворе хлористого натрия, и в случае наличия РНК или ДНК вирусов диагностируют гепатит. Способ обеспечивает повышение точности диагностики. 1 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии. Предложен способ прогнозирования исхода острого периода ишемического инсульта, заключающийся в определении в венозной крови на 1-й день ишемического инсульта соотношения содержания лиганда растворимого 6 члена суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (sFasL) и растворимого рецептора Fas (sFas) (sFasL/sFas), и при соотношении концентраций sFasL/sFas, меньшем или равном 2,41±0,26, прогнозируют благоприятный исход, при большем 2,67 -неблагоприятный исход. 2 пр., 3 ил.
Изобретение относится к области медицинской диагностики и касается способа прогнозирования риска развития рассеянного склероза (РС) у больных с оптическим невритом. Сущность способа: в сыворотке крови пациента с острым оптическим невритом определяют значение разницы оптической плотности при длине волны 492 нм исследуемой сыворотки и контрольной сыворотки, в качестве которой используют смешанный пул сывороток здоровых людей, регистрируют величины пиковой латентности Р100 зрительных вызванных потенциалов (ЗВП) и амплитуды N95 паттерн-электроретинографии (ПЭРГ) на стандартный стимул. При значении разницы оптической плотности исследуемой сыворотки и контрольной сыворотки, равном или более 0,2, снижении амплитуды N95 ПЭРГ на стандартный стимул на 10% и более по сравнению с нормой и удлинении пиковой латентности Р100 ЗВП на 10% и более по сравнению с нормой, прогнозируют высокий риск развития рассеянного склероза. При значении разницы оптической плотности исследуемой сыворотки и контрольной сыворотки менее 0,2, снижении амплитуды N95 ПЭРГ на стандартный стимул менее чем на 10% по сравнению с нормой и удлинении пиковой латентности Р100 ЗВП менее чем на 10% по сравнению с нормой прогнозируют невысокий риск развития PC. Способ обеспечивает повышение надежности прогнозирования риска развития РС, отличается простотой и скоростью выполнения, не требует применения дорогостоящих методов исследования, не связан с травмированием тканей глаза. 2 пр.

Изобретение относится к медицине. При осуществлении способа через 3 ч после перорального введения препарата «Аласенс» в дозе 15 мг/кг массы тела получают трехканальное RGB флуоресцентное изображение зоны интереса. Оценивают долю участия красного канала в изображении опухоли. Оценивают значение Rcut=(R/(R+G+B))·100%, где Rcut - доля участия красного канала в изображении здоровой кожи, R, G и В - яркости красного, зеленого и синего каналов изображения здоровой кожи. Из полученного трехканального RGB флуоресцентного изображения формируют изображение в оттенках серого I(x,y). Для каждой точки изображения I(x,y) вычисляют отношение , где R(x,y), G(x,y), В(x,y) - яркости красного, зеленого и синего каналов RGB флуоресцентного изображения с координатами x, y. Выполняют действие I(x,y)=0 для точек, в которых значение меньше 10%. При отображении опухоли на полученном результирующем изображении I(x,y) диагностируется злокачественная опухоль, а при исчезновении опухоли - доброкачественная. Способ позволяет повысить информационную способность за счет более точного отображения границ недоброкачественной опухоли. 1 прим.

Изобретение относится к области медицинской и ветеринарной иммунологии и предназначено для определения функциональной активности комплемента по его действию на инфузории. В измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий вносят суспензию клеток Tetrahymena pyriformis и испытуемую сыворотку крови с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту. Совпадение динамики изменения числа живых клеток во времени для испытуемой сыворотки и контрольной, представляющей пул 10 сывороток здоровых доноров, предполагает равенство активностей сывороточного комплемента в этих сыворотках. Предлагаемое изобретение обеспечивает универсальный способ расчета определения функциональной активности комплемента с использованием пригодной для всех видов животных мишени для действия активного комплемента, не требующей дополнительной сенсибилизации антителами и не подверженной реактивному лизису. 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 4 пр.
© Патентный поиск, поиск патентов на изобретения - FindPatent.RU 2012-2024
Политика конфиденциальности 2014-05-20 2014-05-19T14:30:10
Наверх