Метод получения межмолекулярных конъюгатов для иммунохроматографического опредеелния специфических антител



Метод получения межмолекулярных конъюгатов для иммунохроматографического опредеелния специфических антител
Метод получения межмолекулярных конъюгатов для иммунохроматографического опредеелния специфических антител
Метод получения межмолекулярных конъюгатов для иммунохроматографического опредеелния специфических антител

 


Владельцы патента RU 2530560:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН Российской академии наук (ИНБИ РАН) (RU)

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии и представляет собой способ получения межмолекулярных конъюгатов с коллоидным золотом, используемым в иммунохроматографическом анализе. В иммунохроматографических тест-системах наряду с аналитической зоной, предназначенной для связывания анализируемого соединения, как правило, используется контрольная зона, предназначенная для связывания соединения, конъюгированного с меткой. Нанесение контрольной зоны необходимо для того, чтобы контролировать функциональную активность реагента, конъюгированного с меткой. Если окрашивания контрольной зоны не наблюдается, результат теста признается недействительным. Однако в случае применения иммунохроматографии для определения антител в крови с меткой конъюгируется соединение, предназначенное для связывания антител - далее обозначаемое как ССвАт (соединение, связывающее антитела). При этом концентрация антител в пробе зачастую превышает концентрацию ССвАт, поэтому концентрация свободных молекул ССвАт оказывается очень низкой и исчезновение контрольной зоны в этом случае не свидетельствует о нарушении активности конъюгата. Для решения данной проблемы в настоящем изобретении предлагается добавлять к конъюгату антивидовые антитела против антител, сорбированных в контрольной зоне. В этом случае контрольная зона исчезает только в случае потери активности ССвАт. Антивидовые антитела добавляются в концентрациях значительно ниже связывающей способности конъюгата, чтобы не мешать взаимодействию конъюгата с антителами пробы, вследствие чего не наблюдается значительного снижения чувствительности анализа. 3 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии и представляет собой метод получения межмолекулярных конъюгатов, которые используются в качестве маркера при иммунохроматографическом определении антител, специфичных к определенному антигену или группе антигенов (серодиагностике). Применительно к серодиагностике общая схема иммунохроматографии заключается в следующем: проба, потенциально содержащая специфические антитела, под действием капиллярных сил перемещается вдоль тест-полоски. При этом она вначале взаимодействует с окрашенными частицами (коллоидное золото или иная метка), на поверхности которых адсорбирован компонент, предназначенный для связывания с антителами. Обычно в качестве такого компонента используют антивидовые антитела (иммуноглобулины, выделенные из сыворотки животного, иммунизированного препаратом иммуноглобулинов организма, для которого проводится серодиагностика), белок A из Staphylococcus aureus, белок G из Streptococcus spp. или иной реагент для связывания антител - далее обозначаемый как ССвАт (соединение, связывающее антитела). Затем фронт жидкости преодолевает аналитическую (тестовую) зону, которая представляет собой участок мембраны с иммобилизованным антигеном (нативным или специально модифицированным для эффективной сорбции). Степень связывания маркера с иммобилизованным антигеном и, соответственно, интенсивность окрашивания мембраны определяются концентрацией специфических антител в пробе. Для проверки качества реагентов и сохранения функциональности тест-системы используется расположенная далее контрольная зона, в которой компонент, сорбированный на окрашенной частице (ССвАт), связывается с соответствующим иммобилизованным на мембране реагентом (Рис.1).

Количество ССвАт, связанного с поверхностью метки, лимитировано сорбционной емкостью поверхности метки. В качестве метки наиболее часто используется коллоидное золото, а в качестве метода иммобилизации - простая физическая адсорбция белка на поверхности с последующим отделением неадсорбированных молекул с помощью осаждения частиц коллоидного золота центрифугированием. В этом случае концентрация ССвАт в конечном объеме реакционной среды в порах мембран иммунохроматографического теста не превышает 0,1 мг/мл. Концентрация антител в сыворотке крови чаще всего превышает 5 мг/мл. При таком избытке антител концентрация свободного ССвАт быстро уменьшается при контакте с пробой, поэтому интенсивность окраски контрольной зоны значительно снижается, а в некоторых случаях исчезает полностью (Рис.2), вследствие чего можно сделать неверный вывод о непригодности теста. Некоторые производители по этой причине используют в тест-системах смесь из двух конъюгатов, один из которых (конъюгированный с ССвАт) предназначен для связывания в аналитической зоне и не взаимодействует с контрольной зоной, а второй взаимодействует только с контрольной зоной. Например, такой подход использован иммунохроматографических системах серодиагностики Salmonella typhi «Enterocheck-WB» фирмы "Zephyr Biomedicals" (Индия).

(http://www.tulipgroup.com/Zephyr_New/html/pack_inserts/Enterochek%20WB.pdf).

Однако в этом случае в контрольной и аналитической зоне связываются разные реагенты, и наличие или отсутствие окраски контрольной зоны не свидетельствует о потере или сохранении активности ССвАт. Нами предлагается иной подход, основанный на добавлении в конъюгат, полученный после адсорбции ССвАт на частицы коллоидного золота и отделения неадсорбированных молекул с помощью осаждения частиц коллоидного золота центрифугированием, антивидовых антител против антител, сорбированных в контрольной зоне теста. Антивидовые антитела добавляются в концентрациях, существенно ниже связывающей способности конъюгата, поэтому данная добавка не приводит к существенному уменьшению чувствительности тест-системы, а контрольная зона образуется только при сохранении функциональной активности ССвАт, что повышает достоверность анализа.

Предложенный подход был реализован заявителями на примере серодиагностики бруцеллеза коров с использованием в качестве антигена липополисахарида (ЛПС) Brucella abortus, в качестве ССвАт - рекомбинантного белка G, к которому добавляли козьи антитела против антител мыши, а в контрольной зоне сорбированы моноклональные мышиные антитела. Рекомбинантный белок G был использован нами, т.к. он обладает наибольшим сродством к иммуноглобулинам крупного рогатого скота, однако для серодиагностики можно также использовать белок А, антивидовые антитела и другие реагенты для связывания антител. Ниже представлено описание способа получения тест-полосок и проведения иммунохроматографического анализа, а также полученные результаты.

Пример

Для изготовления иммунохроматографических тест-систем использовали набор mdi Easypack («Advanced Microdevices», Индия), включающий рабочие мембраны CNPH90 с размером пор 15 мкм, подложку под конъюгат PT-R5, мембрану для нанесения образца FR1(0.6), конечную адсорбирующую мембрану АР045 и ламинирующую защитную пленку на клейкой основе МТ-1.

Иммобилизация белка G на частицах коллоидного золота. Белок G диализовали против 1,000-кратного объема 10 мМ карбонатного буфера, рН 9.0. К коллоидному золоту (D520=1,0) добавляли 0,1 М K2CO3 до достижения pH 9, а затем - белок G в концентрации 8 мкг/мл. Смесь инкубировали 10 мин при комнатной температуре и перемешивании, после чего добавляли 10%-ный водный раствор БСА до конечной концентрации 0,25%.

Частицы коллоидного золота отделяли от неиммобилизовавшегося белка 30-минутным центрифугированием при 6.000 g, ресуспендируя осадок в 50 мМ K-фосфатном буфере, pH 7,4, с 0,1 М NaCl (PBS), содержащем 0,25% БСА.

Нанесение реагентов на иммунохроматографические мембраны. Конъюгат коллоидного золота с белком G наносили на стекловолоконную мембрану (PT-R5, «Advanced Microdevices», Индия) в разведении, соответствующем D520=10,0, в объеме 11 мкл на 1 см полосы с помощью диспенсера IsoFlow фирмы «Imagene Technology» (США). В первом случае (немодифицированная методика) на мембрану наносился только конъюгат с белком G, во втором случае (модифицированная методика) конъюгат с белком G предварительно смешивался с козьими антителами против иммуноглобулинов мыши («Arista Biologicals Inc.» (США)) в концентрации 10 мкг/мл.

Для формирования аналитической зоны использовали препарат ЛПС, выделенный из бактерий Brucella abortus (Национальный центр биотехнологии, Астана, Казахстан). На 1 см полосы наносили 2 мкл препарата ЛПС (1,0 мг/мл в дистиллированной воде).

Для формирования контрольной зоны в первом случае использовали кроличьи антитела против иммуноглобулинов крупного рогатого скота производства фирмы «Имтек» (Россия), на 1 см полосы наносили 2 мкл антител (0, 5 мг/мл в PBS); во втором случае - мышиные моноклональные антитела (Центр молекулярной диагностики и терапии, Москва (Россия)).

Иммунохроматографический анализ (ИХА) проводили при комнатной температуре. Тест-полоску в вертикальном положении погружали на 5 мин в анализируемую сыворотку крови, затем извлекали, помещали на горизонтальную поверхность и через 5 мин визуально контролировали результат иммунохроматографического анализа.

Как видно из рис.3, предложенная схема позволяет увеличить интенсивность контрольной зоны тест-системы. При этом, так как добавленная к коллоидному конъюгату концентрация антивидовых антител значительно ниже концентрации белка G в конъюгате, потери интенсивности окраски аналитической зоны иммунохроматографического теста не наблюдается.

Рис.1. Принцип иммунохроматографического определения специфических антител.

Рис.2. Связывание конъюгата коллоидного золота и белка G в контрольной зоне тест-полоски А. в буферном растворе, не содержащем антител, и Б. в сыворотке крови.

Рис.3. Тестирование иммунохроматографических систем, изготовленных А. по традиционной методике и Б. по методике, предложенной заявителями (с использованием конъюгата коллоидного золота с рекомбинантным белком G и антивидовыми антителами) на сыворотке коровы, больной бруцеллезом.

Способ получения межмолекулярных конъюгатов для иммунохроматографического определения специфических антител, основанный на адсорбционном формировании комплексов между частицами коллоидного золота и соединением, специфически связывающим антитела, с последующим отделением неадсорбированных молекул с помощью осаждения частиц коллоидного золота центрифугированием, отличающийся тем, что к полученному комплексу частиц коллоидного золота и соединения, специфически связывающего антитела, перед проведением иммунохроматографического определения добавляют антивидовые антитела против антител, иммобилизованных в иммунохроматографической тест-системе, благодаря чему часть адсорбированных на частице коллоидного золота молекул, специфически связывающих антитела, сохраняет способность взаимодействовать с определяемыми антителами в пробе, а часть блокируется добавленными антителами.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и клинической биохимии. Сущность способа заключается в том, что фиксированные клетки периферической крови обрабатывают первичными антителами к эстроген-связываюшему белку, специфически взаимодействующими с антигенами на поверхности сегментоядерных гранулоцитов, затем к полученному комплексу антиген-антитело добавляют вторичные антивидовые флуоресцентно-меченные антитела, и при наличии окрашивания поверхности сегментоядерных гранулоцитов диагностируют злокачественные новообразования, а при отсутствии окрашивания поверхности сегментоядерных гранулоцитов диагностируют доброкачественные новообразования.

Изобретение относится области иммунологии и биотехнологии. Предложено однодоменное антитело (VHH), способное связывать цитокин фактор некроза опухолей (ФНО, TNF) человека, фрагмент ДНК, кодирующий антитело по изобретению, способ получения антитела по изобретению, а также способ выявления и определения уровня содержания ФНО человека в биологическом образце.
Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии и к челюстно-лицевой хирургии, и может быть использовано в качестве дополнительного исследования для диагностики поражения вегетативных парасимпатических узлов головы герпесвирусной этиологии.
Область использования: изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии и к челюстно-лицевой хирургии, и может быть использовано в качестве дополнительного исследования для диагностики поражения вегетативных парасимпатических узлов головы герпесвирусной этиологии.
Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и анестезиологии, и может быть использовано для оценки интенсивности острой соматической боли у больных в посттравматическом периоде.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу оценки эффективности противогерпетического действия фотодинамического воздействия на вирус простого герпеса (ВПГ) in vitro.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу прогнозирования самопроизвольного выкидыша у беременных. Сущность изобретения состоит в том, что у женщин в сроке 6-12 недель беременности в периферической крови определяют относительное содержание CD45RA+CD62L+ лимфоцитов и при его значении, равном или более 46,7%, прогнозируют самопроизвольный выкидыш.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан набор праймеров для амплификации фрагментов гена CFTR.
Изобретение относится к области медицины, конкретно к аллергологии, иммунологии и дерматологии, и может быть использовано для прогнозирования развития инфекционных осложнений при атопическом дерматите у детей.
Изобретение относится к области медицины, а именно к неонатологии и детской неврологии, и может использоваться для прогнозирования риска развития поражения центральной нервной системы (ЦНС) у новорожденных детей с различным сроком гестации в неонатальном периоде.

Предложена группа изобретений: фармацевтическая композиция, содержащая иммунологически активный энантиомер компонента катионного липида R-DOTAP или S-DOTAP, способ применения указанного энантиомера для вызова иммуностимулирующего адъювантного эффекта в иммунной системе, способ индукции иммунного ответа у пациента с его использованием и способ лечения или предотвращения заболевания у пациента путем индукции липидом иммуностимулирующего адъювантного эффекта.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для противоопухолевой иммунотерапии. Для этого больному вводят дендритные клетки (ДК), получаемые из кожи, селезенки, костного мозга, тимуса, лимфатических узлов, пуповинной крови или периферической крови больного (аутологичные ДК), при этом ДК больному вводят поэтапно.
Изобретение относится к технологии производства медицинских иммунобиологических препаратов и может быть использовано в практике производства туляремийной живой вакцины.
Изобретение относится к ветеринарии, в частности к профилактике и лечению трихофитии крупного рогатого скота. Инактивированная вакцина для профилактики и лечения трихофитии крупного рогатого скота содержит элементы гриба Trichophyton verrucosum - клетки и фрагменты мицелия, микроконидии, артроспоры, хламидоспоры; формалин и физиологический раствор при следующем соотношении компонентов в 1 мл: элементы гриба Trichophyton verrucosum - фрагменты   мицелия, микроконидии, артроспоры, хламидоспоры 80-120 млн формалин 0,003 мл физиологический раствор до 1 мл Техническим результатом заявленного изобретения является повышение длительности иммунитета до 30 месяцев, повышение стабильности вакцины и срока хранения вакцины до 18 месяцев, возможность полного освобождения хозяйств от возбудителя трихофитии крупного рогатого скота, а также упрощение применения вакцины, снижение себестоимости ее производства и использования, снижение нагрузки на иммунную систему животных.
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и представляет собой жидкую среду высушивания для стабилизации биомассы вторичного сбора чумного микроба вакцинного штамма EV.
Изобретение относится к медицине, а именно к терапии и кардиологии, и касается коррекции эндотелиальной дисфункции. Для этого вводят активированную - потенцированную форму антител к эндотелиальной синтазе оксида азота в сочетании с активированной - потенцированной формой антител к С-концевому фрагменту AT1 рецептора ангиотензина II.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Описана активная иммуностимулирующая вакцина, содержащая по меньшей мере одну РНК, предпочтительно мРНК, кодирующую по меньшей мере два антигена, которые инициируют иммунный ответ у млекопитающего, предназначенная для лечения рака легких, прежде всего немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), предпочтительно выбранного из основных трех его подтипов, плоскоклеточной карциномы легких, аденокарциномы и крупноклеточной карциномы легких, или нарушений, связанных с НМРЛ.
Изобретение относится к области ветеринарии. Способ получения антилютеальной крови - АлК, заключается в том, что мерину двукратно с интервалом 14 дней подкожно вводят лютеолизат в дозе по 20 мл, содержащий части желтого тела беременности коров, и через 14 дней после второго введения берут кровь из яремной вены.

Настоящая группа изобретений относится к области медицины, а именно к терапии и фармакологии, и может быть использована для повышения фармакологической активности и терапевтической эффективности лекарственных средств на основе активированных - потенцированных форм сверхразбавленных антител.
Изобретение относится к области медицины и ветеринарии и касается способа получения очищенного антигена Dirofilaria immitis. Представленный способ включает механическую гомогенизацию, центрифугирование гомогената, отбор надосадочной жидкости и использование ее как антигена, при этом для гомогенизации используют головной конец длиной 2 см половозрелой самки Dirofilaria immitis, который помещают в 0,25 М водный раствор сахарозы в соотношении 1:3, замораживают при температуре -18°С, проводят механическую гомогенизацию и экстракцию белков в 0,25 М водном растворе сахарозы при 4°С в течение 12 часов, далее проводят ультразвуковую гомогенизацию супернатанта при 70 кГц 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в 3 циклах при 0°С, образовавшийся после ультразвуковой гомогенизации супернатант растворяют в охлажденном ацетоне при температуре 0°С в соотношении 1:20 с экспозицией 1 час при температуре 4°С.

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к урологии, и касается лечения заболеваний предстательной железы. Для этого вводят лекарственное средство, содержащее активированную - потенцированную форму антител к простатоспецифическому антигену и в качестве дополнительного усиливающего компонента активированную -потенцированную форму антител к эндотелиальной NO-синтазе. Введение такого комбинированного лекарственного средства обеспечивает эффективное лечение заболеваний предстательной железы за счет синергетического действия входящих в него компонентов, заключающегося в усилении антипролиферативного, противовоспалительного эффектов и улучшении функционального состояния простаты. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 1 пр.
Наверх