Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации генетического материала риккетсий методом пцр в реальном времени



Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации генетического материала риккетсий методом пцр в реальном времени
Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации генетического материала риккетсий методом пцр в реальном времени

 

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2581952:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") (RU)

Изобретение относится к биохимии. Описан набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации генетического материала риккетсий методом ПЦР в реальном времени. Набор содержит последовательности олигонуклеотидов, видоспецифичных к риккетсиям: прямой праймер (PrF_gltA) 5`→3`: 5'-GGCTTCGGTCATCGTGT-3' (17 н); обратный праймер (PrR_gltA) 5`→3`: 5'-TTGCTATTTGTAAGAGCGGATTG-3' (23 н); флуоресцентно-меченый ДНК-зонд Z(ROX)_gltA 5`→3`: ROX-CCACGTGCCGCAGTACTTAAAGAAAC-BHQ2' (26 н). Техническим результатом заявляемого изобретения является создание набора специфичных олигонуклеотидных праймеров и зонда для выявления генетического материала риккетсий, в том числе R. tarasevichiae и R. raoultii, в гомогенатах клещей, клинических образцах и биологических жидкостях, распространенных на территории Российской Федерации методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. 1 ил., 3 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано в медицинской практике в виде набора для выявления генетического материала риккетсий в гомогенатах клещей или клинических образцах для уточнения диагноза, а также для решения эпидемиологических и научно-исследовательских задач по изучению распространения риккетсий в природных очагах с различной эпидемической активностью. Использование специфичных праймеров и зондов позволяет выявлять генетический материал риккетсий в исследуемых образцах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

Риккетсии представляют собой мелкие полиморфные α-протеобактерии, являющиеся облигатными внутриклеточными паразитами эукариотических клеток. Многие виды риккетсий являются возбудителями различных инфекционных заболеваний человека, распространенных по всему миру [Parola P., Paddock C.D., Socolovschi C., Labruna M.B., Mediannikov O., Kernif T., Abdad M.Y., Stenos J., Bitam I., Fournier P.E., Raoult D. Update on tick-borne rickettsioses around the world: a geographic approach // Clinical Microbiology Reviews. 2013. 26(4). P. 657-702].

На территории Российской Федерации регистрируется заболеваемость североазиатским клещевым риккетсиозом (риккетсиоз Средней Азии, сибирский клещевой тиф), Астраханской пятнистой лихорадкой и дальневосточным клещевым риккетсиозом [Тарасевич И.В. Современные представления о риккетсиях // Клиническая микробиология и антимикробная терапия. 2005. Т.7, № 2. С. 119-129]. Североазиатский клещевой риккетсиоз, возбудителем которого является R. sibirica, регистрируется преимущественно на юге Западной и Восточной Сибири, Дальнего Востока, а также в Казахстане, Киргизстане, Монголии и Китае [Шпынов С.Н. Эколого-эпидемиологические и молекулярно-генетические аспекты изучения природных очагов риккетсиозов и эрлихиозов в России: дис…док. мед. наук / С.Н. Шпынов. - Омск., 2004. - 204 с.]. R. conorii subsp. cuspia является возбудителем Астраханской пятнистой лихорадки, эпидемически активные очаги которой располагаются в Астраханской области и смежных с ней территориях (Калмыкия, Волгоградская область) [Tarasevich I.V., Makarova V.A., Fetisova N.F., Stepanov A.V., Miskarova E.D., Balayeva N., Raoult D. Astrakhan fever, a spotted-fever rickettsiosis // Lancet. 1991. 337(8734). - P. 172-173]. Дальневосточный клещевой риккетсиоз, вызываемый R. heilongjiangensis, встречается в Хабаровском крае и Амурской области [Mediannikov O.Y., Sidelnikov Y., Ivanov L., Mokretsova E., Fournier P.E., Tarasevich I., Raoult D. Acute tick-borne rickettsiosis caused by Rickettsia heilongjiangensis in Russian Far East // Emerging Infectious Diseases. 2004. № 10(5). P. 810-817]. Современные исследования, проводимые с использованием молекулярно-биологических методов позволили обнаружить в клещах, собранных на территории России, генетический материал и других патогенных для человека видов риккетсий (R. slovaca, R. raoultii, R. helvetica, R. aeschlimannii, R. tarasevichiae) [Rydkina E., Roux V., Fetisova N., Rudakov N., Gafarova M., Tarasevich I., Raoult D. New Rickettsiae in Ticks Collected in Territories of the Former Soviet Union // Emerging Infectious Diseases. 1999. Vol. 5, № 6. P. 811-814.; Rudakov N.V., Shpynov S.N., Samoilenko I.E., Tankibaev M.A. Ecology and epidemiology of spotted fever group Rickettsiae and new data from their study in Russia and Kazakhstan // Annals of the New York Academy of Sciences. 2003. Vol. 990. P. 12-24.; Shpynov S.N., Fournier P.E., Rudakov N.V., Samoilenko I.E., Reshetnikova T.A., Yastrebov V.K., Schaiman M.S., Tarasevich I.V., Raoult D. Molecular identification of a collection of spotted Fever group rickettsiae obtained from patients and ticks from Russia // American Journal Of Tropical Medicine And Hygiene. 2006. № 74(3). P. 440-443]. В зависимости от генетических особенностей как возбудителя, так и пациента клиническая картина риккетсиозов может сильно изменяться, что существенно затрудняет диагностику этой группы инфекционных заболеваний. Поэтому в диагностике риккетсиозов особое значение имеют лабораторные методы анализа, в том числе и молекулярно-биологические. Совершенствование этих методов принципиально важно для более быстрой и надежной диагностики риккетсиозов, в том числе протекающих с атипичной симптоматикой, для идентификации различных видов риккетсий, а также откроет новые возможности для мониторинга природных очагов риккетсиозов.

Известен способ определения ДНК риккетсиеподобного микроорганизма "Montezuma" (таксономическое положение определено только до принадлежности к порядку Rickettsiales) путем проведения двухраундовой ПЦР (патент РФ №2233888, МПК С12Q 1/68, опубл. 10.08.2004 г.). Проведение ПЦР в два раунда, с одной стороны, увеличивает ее чувствительность и специфичность, с другой, значительно увеличивает время проведения анализа, а также его себестоимость. В основе метода определения ДНК возбудителя, описываемого в патенте, лежит ПЦР с электорфоретической детекцией. Детекция накопления ампликонов осуществляется при открывании пробирки с исследуемым материалом, что увеличивает риск получения ложноположительных результатов из-за контаминации проб и реагентов продуктами амплификации. Существенное количество манипуляций с исследуемым образцом увеличивает затраты времени на анализ и повышает вероятность ошибок [Иванов М.К., Порываев В.Д., Кандрушин Е.В. Особенности количественного анализа методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // "Новости "Вектор-Бест" № 4(50) 2008]. Предлагаемый в патенте РФ №2233888 набор олигонуклеотидных праймеров предназначен для идентификации гена 16S rRNA. Этот ген, исходя из своих биологических функций, является крайне консервативным (гомология различных видов риккетсий по этому гену составляет 97,2 - 99,9%). Идентификация гена 16S rRNA для первичной идентификации риккетсий в членистоногих переносчиках сопряжена с высокой вероятностью контаминации.

Известен метод детекции генетического материала риккетсий с помощью гибридизации олигонуклеотидных зондов с ДНК риккетсий (патент США №5976791, МПК C12Q1/68, опубл. 02.11.1999 г.). Метод не предназанчен для выявления R. tarasevichiae и R. raoultii. Для идентификации вида риккетсии в биологическом образце предлагаемый метод подразумевает проведение реакции обратной транскрипции 16S rRNA, что увеличивает стоимость и время проведения анализа.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является набор праймеров (94 олигонуклеотидных праймера) для детекции целого ряда возбудителей инфекционных заболеваний, переносимых клещами (заявка США №20110104696, МПК C12Q1/68, опубл. 05.05.2011 г.). Среди них есть представители риккетсий, но набор праймеров не предназначен для детекции R. tarasevichiae и R. raoultii, которые широко распространены на территории Российской Федерации. Кроме того, предлагаемый протокол подразумевает проведение ПЦР в 50 мкл реакционной смеси, а время элонгации составляет 1 минуту 40 секунд, что приводит к значительным затратам на анализ и суммарному времени проведения анализа.

Техническим результатом заявляемого технического решения является создание набора специфичных олигонуклеотидных праймеров и зонда для выявления генетического материала нескольких видов риккетсий, в том числе R. tarasevichiae и R. raoultii, в гомогенатах клещей, клинических образцах и биологических жидкостях, распространенных на территории Российской Федерации методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

Указанный технический результат достигается созданием набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации генетического материала риккетсий методом ПЦР в реальном времени, содержащего последовательности олигонуклеотидов, видоспецифичных к риккетсиям:

- прямой праймер (PrF_gltA) 5`→3`:

5'-GGCTTCGGTCATCGTGT-3' (17 н)

- обратный праймер (PrR_gltA) 5`→3`:

5'-TTGCTATTTGTAAGAGCGGATTG-3' (23 н)

- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд Z(ROX)_gltA 5`→3`:

ROX-CCACGTGCCGCAGTACTTAAAGAAAC-BHQ2' (26 н)

Диагностические праймеры и флуоресцентно-меченый зонд конструировались на участок гена цитратсинтазы риккетсий и оптимизации концентраций компонентов реакционной смеси и условий проведения ПЦР, что обеспечивает заявляемому техническому решению соответствие критериям «новизна» и «изобретательский уровень». Для контроля амплификации были получены рекомбинантные плазмиды, содержащие нуклеотидную последовательность фрагмента гена цитратсинтазы.

Изобретение поясняется следующими графическими материалами. На фиг. 1 представлена зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации рекомбинантной плазмиды в реакции (концентрация выражена в геном-эквивалентах на реакцию).

Описание получения набора праймеров и зонда. Для анализа и конструирования праймеров в международной базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) были выбраны следующие нуклеотидные последовательности гена цитратсинтазы: R. prowazekii (CP004888), R. typhi (AE017197), R. sibirica (JX945526), R. asiatica (AB297810), R. helvetica (KM288467), R. raoultii (EU036985), R. rickettsii (DQ150686), R. slovaca (U59725), R. conorii subsp. caspia (U59728), R. aeschlimannii (DQ235776), R. peacockii (DQ100162), R. japonica (AY743327), R. heilongjiangensis (AB473812), R. tarasevichiae (DQ168981), R. canadensis (U59713). Сравнительный анализ и выравнивание нуклеотидных последовательностей были проведены с использованием пакетов программ MEGA 6.06 и DNASTAR Lasergene 7.0. Анализ известных последовательностей гена цитратсинтазы позволил найти достаточно консервативные участки, пригодные для дизайна диагностических олигонуклеотидных праймеров и зонда. Дизайн олигонуклеотидов выполняли с помощью программы PerlPrimer v1.1.21 и VectorNTI 8. Анализ свойств олигонуклеотидных праймеров и зондов проводился с использованием программы Vector NTI 8.

Для идентификации генетического материала риккетсий методом ПЦР в реальном времени были подобраны праймеры и зонд, представленные ниже в таблице 1:

Таблица 1. Состав праймеров и зонд, используемые для заявляемого набора

Название праймера/зонда Нуклеотидная последовательность (5'→3') Длина ПЦР продукта (п.н.)
PrF_gltA 5'-GGCTTCGGTCATCGTGT-3' 120
PrR_gltA 5'-TTGCTATTTGTAAGAGCGGATTG-3'
Z(ROX)_gltA ROX-CCACGTGCCGCAGTACTTAAAGAAAC-BHQ2'

Пример 1. Проверка аналитической чувствительности набора праймеров и зонда

Для контроля амплификации был получен положительный контрольный образц (ПКО), представляющий собой рекомбинантную плазмиду, несущую фрагмент гена цитратсинтазы, являющийся матрицей для амплификации спецефических ДНК-фрагментов.

Для определения аналитической чувствительности из концентрированного раствора плазмидной ДНК были приготовлены последовательные 10-кратные разведения. Определение концентрации ДНК осуществляли спектрофотометрически с помощью флуориметра «Qubit 2.0» («Invitrogen», США). ПЦР в режиме реального времени для детекции генетического материала риккетсий проводили на приборе DT-lite («ДНК-Технология», Россия), детекцию результатов амплификации (фиг. 1) осуществляли по каналу ROX (поглощение λ=585 нм; флуоресценция λ=610 нм). На фиг. 1 представлена зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации рекомбинантной плазмиды в реакции (концентрация выражена в геном-эквивалентах на реакцию).

Минимальное количество ДНК-матриц, детектируемое в ПЦР после оптимизации условий проведения реакции, выраженное в ГЭ (геномных эквивалентах), составило 80 ГЭ в образце.

Эксперимент по определению аналитической чувствительности был повторен с использованием ДНК-полимераз различных фирм-производителей на приборах как плашечного типа (DT-lite («ДНК-Технология», Россия) и CFX96 Touch («Bio-Rad», США)), так и на приборе роторного типа - Rotor Gene 6000 («Corbett Research», Австралия). Результаты эксперимента приведены в таблице 2. Показано, что для обнаружения ДНК риккетсий с заявляемой чувствительностью возможно применение как Smart, так и Taq ДНК-полимераз.

Таблица 2.
Зависимость значений Ct от концентрации рекомбинантной плазмиды при ее выявлении с использованием различных видов ДНК-полимераз и детекцией результатов на различных приборах.
Используемый термоциклер DT-lite CFX-96 Rotor-Cene
Используемая ДНК-полимераза* Smart Медиген Taq
Медиген
Taq
СибЭнзим
Smart
Медиген
Количество ДНК-матрицы (гена-мишени) 8•107 15,5 15,6 15,6 14,9 14,5
8•106 19,1 18,9 19,4 18,7 18,3
8•105 22,5 23,9 22,7 22,2 21,1
8•104 25,9 26,1 26,7 26,1 25,5
8•103 29,1 30,8 29,7 28,8 28,6
8•102 34,1 33,7 33,8 34,1 34,1
8•101 35,7 35,9 36,1 36,5 36,0
Примечание: SmartTaq ДНК-полимераза («Медиген», Россия), Taq ДНК-полимераза («Медиген», Россия), Taq ДНК-полимераза («СибЭнзим», Россия).

Пример 2. Проверка специфичности набора праймеров и зондов

Специфичность разработанного набора праймеров и зонда определялась в два этапа. На первом этапе специфичность праймеров и ДНК-зонда была проанализирована с использованием поисковой системы BLAST в режиме online. Нуклеотидные последовательности праймеров/зонда проверяли на наличие гомологии со всеми известными нуклеотидными последовательностями в международной базе данных GenBank. Выбранные праймеры и ДНК-зонд не имели гомологии с человеческой ДНК. На втором этапе аналитическая специфичность была оценена нами экспериментально. Для этого была использована панель, содержащая геномную ДНК человека, мыши, клещей различных видов (Ixodes persulcatus, Ixodes pavlovskyi, Ixodes ricinus, Dermacentor reticulatus, Hyalomma anatolicum), возбудителей других инфекций, передающихся клещами (Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia muris, Ehrlichia canis, Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Babesia divergens, Babesia microti, кДНК вируса клещевого энцефалита штаммов 205 и Коларово-2008). Отрицательные результаты ПЦР-РВ анализа с каждым из вышеперечисленных образцов позволяют оценить специфичность набора по использованной выборке образцов как 100 %.

Пример 3. Определение ДНК риккетсий в образцах клещей, отловленных в Новосибирской области

В исследование было взято 305 клещей (Ix. persulcatus, Ix. pavlovskyi - 220; Dermacentor spp. - 85), отловленных на территории Новосибирской области.

Приготовление суспензий клещей осуществляли растиранием в ступке с 300 мкл фосфатно-солевого буфера (pH 7,4). Процедуру выделения ДНК из исследуемого материала проводили с использованием набора реагентов «Рибо-ПРЕП» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией по применению.

ПЦР в режиме реального времени проводили в реакционной смеси следующего состава (на 1 исследование):

кДНК 5 мкл
10×Taq буфер без Mg2+ 3 мкл
100 mM раствор MgCl2 1 мкл
5 mM раствор dNTP 1 мкл
Смесь праймеров и зондов (по 2 о.е. каждого) по 1 мкл каждого
Smart Taq DNA-Полимераза 5 ед./ мкл 0,3 мкл
Вода для ПЦР до 30 мкл общего объема

ПЦР в режиме реального времени и регистрацию результатов проводили в приборе DT-lite («ДНК-Технология», Россия) по следующей программе, представленной в таблице 3.

Таблица 3. Программа проведения ПЦР

Температура (°С) Время (минуты:секунды) Количество циклов
95 05:00 1
95 00:15 40
60 00:20
72 00:20

Измерение флуоресценции осуществляли при температуре 60°С на канале ROX (поглощение λ=585 нм; флуоресценция λ=610 нм).

Результаты интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов. Результат считали положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имела характерную «сигмовидную» форму и пересекала пороговую линию.

По результатам исследования уровень зараженности риккетсиями клещей видов Ix. persulcatus и Ix. pavlovskyi в Новосибирской области составил 13,1±2,2 %; клещей рода Dermacentor 38,2±5,4%. Все положительные образцы были генотипированы путем секвенирования/определения нуклеотидной последовательности фрагмента гена цитратсинтазы. Показано, что предлагаемый набор праймеров позволяет надежно выявлять различные генетические варианты как минимум четырех видов риккетсий, распространенных на территории России (R. sibirica, R. raoultii, R. helvetica и R. tarasevichiae).

Таким образом, вышеизложенные материалы подтверждают достижение заявленного технического результата, связанного с созданием набора специфичных олигонуклеотидных праймеров и зонда для выявления генетического материала риккетсий, в том числе R. tarasevichiae и R. raoultii, в гомогенатах клещей, клинических образцах и биологических жидкостях, распространенных на территории Российской Федерации методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации генетического материала риккетсий методом ПЦР в реальном времени, содержащий последовательности олигонуклеотидов, видоспецифичных к риккетсиям:
- прямой праймер (PrF_gltA) 5`→3`:

5'-GGCTTCGGTCATCGTGT-3' (17 н)

- обратный праймер (PrR_gltA) 5`→3`:
5'-TTGCTATTTGTAAGAGCGGATTG-3' (23 н)

- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд Z(ROX)_gltA 5`→3`:
ROX-CCACGTGCCGCAGTACTTAAAGAAAC-BHQ2' (26 н)



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики и молекулярной биологии. Предложен набор, содержащий два олигодезоксирибонуклеотидных праймера и флуоресцентно-меченый ДНК-зонд.

Изобретение относится к области медицины, в частности к хирургии, и может быть использовано для прогнозирования эндогенной интоксикации у больных острым перитонитом.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу определения типа энтеровируса, явившегося причиной развития менингита у детей. В крови заболевших детей в период с 1 по 7-й день болезни определяют X- значение уровня лимфоцитов, на поверхности которых находятся СD3+IL4+ маркеры, рассчитывают значение Y по формуле 1,12+9,32*X.

Изобретение относится к медицине и предназначено для диагностики рака желудка. В сыворотке крови определяют концентрации фактора роста эндотелия сосудов, раково-эмбрионального антигена и пепсиногена-1.
Изобретение относится к медицине и представляет собой способ оценки эффективности процедуры радиочастотной симпатической денервации почечных артерий у пациентов с медикаментозно-резистентной артериальной гипертензией, характеризующийся тем, что пациенту в условиях стационара проводят измерение β-адренореактивности эритроцитарных мембран периферической крови до и через 7 дней после процедуры, и при снижении значения β-адренореактивности мембран на 10 условных единиц и более процедуру оценивают как эффективную.
Изобретение относится к медицине и представляет собой способ прогнозирования риска развития осложнений ХИЭ у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья РФ, отличающийся тем, что способ включает выделение ДНК из периферической венозной крови, анализ генетического полиморфизма лимфотоксина α(+250A/G Ltα) в сочетании с такими предикторами, как наличие очагов хронической инфекции и уровень лейкоцитов, прогноз риска развития осложнений по уравнениям линейной дискриминантной функции следующего вида: у1=-114,015+108,475x1+1,267x2+2,743x3 у2=-114,720+103,793x1+2,370x2+3,399x3, где x1 - наличие очагов хронической инфекции (да - 1; нет - 2), x2 - уровень лейкоцитов (1012/л), x3 - генетический вариант по локусу+250 A/G Ltα: AA - x3=1; AG - x3=2; GG - x3=3.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу прогнозирования вероятности риска возникновения преэклампсии у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрально-Черноземного региона России.

Изобретение относится к медицине и касается способа очистки гозерелина, включающего растворение гозерелина-сырца в водном растворе уксусной кислоты, фильтрование полученного раствора и последующую трехстадийную хроматографическую очистку: жидкостную хроматографию низкого давления на колонне с полистиролдивинилбензольным сорбентом, ионообменную хроматографию низкого давления и ВЭЖХ.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ прогнозирования у пациента с влажной возрастной дегенерацией желтого пятна (AMD) повышенной вероятности эффекта от лечения высокоаффинным антителом против VEGF, в частности, ранибизумабом.

Изобретение относится к области клинико-лабораторной диагностики и предназначено для прогнозирования вероятности получения незрелых ооцитов в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) с использованием молекулярно-генетических маркеров.

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики и молекулярной биологии. Предложен набор, содержащий два олигодезоксирибонуклеотидных праймера и флуоресцентно-меченый ДНК-зонд.

Изобретение относится к области токсикологии и может быть использовано для определения в образцах жидкости или растений токсичных веществ, а именно рибосом-инактивирующих белков II типа.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к стоматологии и медицинской генетике, и может быть использовано для прогнозирования злокачественной трансформации эрозивно-язвенной формы красного плоского лишая (КПЛ) слизистой оболочки полости рта (СОПР).

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к тест-системе для обнаружения экспрессии гена NAT2 у человека. Данная тест-система включает смесь праймеров, комплементарных концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК-матрицы для ПЦР, эндонуклеазу рестрикции с буфером и технологическую смесь для ПЦР с Taq-полимеразой.

Группа изобретений относится к области генной инженерии, в целом к трансгенным конструкциям, трансгенным животным, отличным от человека, способам количественного анализа активации GPCR лигандов неинвазивно в интактных животных, тканевых срезах или в нативных клетках, используя трансгенную модель, содержащую систему биолюминесцентного трансгена-репортера, которая является чувствительной к модуляции путей после связывания лиганда с рецепторами GPCR.

Группа изобретений относится к обоасти биохимии и биотехнологии. Представлены аптамер, связывающийся с химазой и ингибирующий активность химазы, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную как X1GAUAGAN1N2UAAX2, где X1 и X2 идентичны или не идентичны друг другу и каждый означает A или G, а N1 и N2 идентичны или не идентичны друг другу и каждый означает A, G, C, U или T; комплекс, включающий аптамер и функциональное вещество, например вещество, обладающее сродством, вещество для мечения, фермент, средство доставки лекарственного средства, лекарственное средство; лекарственное средство или реагент, содержащее аптамер или комплекс; способы детекции и очистки химазы с использованием аптамера или комплекса.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования ответа на стандартную двухкомпонентную противовирусную терапию у пациентов с хроническим гепатитом С (ХГС), генотипом 1в.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу селективного подавления амплификации в ходе ПЦР фрагментов ДНК. Добавляют в реакционную смесь блокирующий олигонуклеотид в концентрации, которая превышает концентрацию праймеров, используемых для ПЦР, не менее чем в 2 раза.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к набору последовательностей праймеров и аллель-специфических зондов для одновременной генодиагностики двух мутантных аллелей, вызывающих комплекс аномалий позвоночника (CVM) и дефицит лейкоцитарной адгезии (BLAD) у крупного рогатого скота.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ прогнозирования у пациента с влажной возрастной дегенерацией желтого пятна (AMD) повышенной вероятности эффекта от лечения высокоаффинным антителом против VEGF, в частности, ранибизумабом.

Настоящее изобретение относится к аналитической биоорганической химии. Предложенные флуоресцентно-меченные дезоксирибонуклеозидтрифосфаты и рибонуклеозидтрифосфаты имеют общую формулу H-Л-Ф, где Н - модифицированный по конечному атому фосфора природный дезоксирибонуклеозидтрифосфат или рибонуклеозидтрифосфат, Л - линкерная группа, присоединенная к конечному атому фосфора и построенная на основе вторичных диаминов, Ф - репортерная флуоресцентная группа, присоединенная к линкеру посредством вторичной аминогруппы. При этом способ синтеза флуоресцентно-меченных нуклеотидов включает присоединение линкера к флуорофору, активацию трифосфатных групп путем превращения их в циклическую ангидридную форму, взаимодействие активированных трифосфатов с красителями, содержащими линкерную группу, и очистку целевых соединений. Предложенные флуоресцентно-меченные нуклеотиды могут быть использованы в методах одномолекулярного секвенирования, расширяя диапазон возможных условий его проведения. 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 8 пр.
Наверх