Способ диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии и диагностикум определения мужского бесплодия


 


Владельцы патента RU 2582914:

Общество с ограниченной ответственностью Испытательный Лабораторный Центр "УНИВЕРСАЛ" (RU)

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к области вспомогательных репродуктивных технологий, в частности для увеличения частоты наступления беременности, и может быть использовано при лечении бесплодия в программах экстракорпорального оплодотворения и гомологичной инсеминации. Изобретение представляет собой способ диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии. При реализации способа согласно изобретению для определения количества сперматозоидов аликвоту эякулята вносят в пробирку с крышкой, осаждают сперматозоиды центрифугированием, промывают осадок однократным натрий-фосфатным буфером, центрифугированием отделяют осадок, подкисляют его действием разбавленной хлорной кислоты, кипятят на водяной бане и осаждают материал центрифугированием с последующим определением в осадке концентрации ДНК. Технический результат, достигаемый при реализации разработанного изобретения, состоит в повышении точности определения аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии. 1 з.п. ф-лы.

 

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к области вспомогательных репродуктивных технологий, в частности для увеличения частоты наступления беременности, и может быть использовано при лечении бесплодия в программах экстракорпорального оплодотворения и гомологичной инсеминации за счет отбраковки образцов спермы, содержащих клетки с нарушенной упаковкой хроматина, и диагностики необходимости специфической терапии или восстановительных процедур при неблагоприятном прогнозе относительно эффективности вспомогательных репродуктивных технологий.

Известно, что снижение качества спермы обуславливает мужское бесплодие. В последние пятьдесят лет в большинстве развитых стран мира отмечено снижение качества спермы у мужчин фертильного возраста. Бесплодие мужчин приводит к росту бесплодных браков, малодетных семей, разводов и, в конечном итоге, к ухудшению демографических показателей. Удельный вес бесплодных браков в мире достигает 15%. При этом мужское бесплодие в структуре бесплодных супружеских пар составляет от 30% до 50%.

Основным способом диагностики мужского бесплодия является (Лабораторная диагностика мужского бесплодия: Метод, рекомендации. - М., 1979. - 20 с.) макро- и микроскопическое исследования спермы. Этот способ позволяет провести подсчет сперматозоидов в 1 мл во всем эякуляте, определить количество подвижных сперматозоидов, процент морфологически измененных форм сперматозоидов и концентрацию лейкоцитов. Данный способ позволяет сделать вывод о видимой патологии спермы - наличии повышенного содержания лейкоцитов и эритроцитов, указывающих на воспалительные и инфекционные заболевания половых путей; наличии малого количества сперматозоидов или их полного отсутствия; наличии аномальных (патологических, дегенеративных) форм сперматозоидов; снижении процента подвижных сперматозоидов.

При использовании данного способа причины патологических изменений в сперме выявить не удается, следовательно, провести назначение адекватного лечения мужского бесплодия крайне затруднено.

Известен (RU, патент 2118822, опубл. 1998) способ диагностики мужского бесплодия путем проточно-цитофлуориметрического анализа состояния хроматина сперматозоидов, причем состояние хроматина оценивают по интенсивности флуоресценции ядер клеток, окрашенных бромистым этидием до и после обработки гепарином, и при наличии образца спермы, в котором интенсивность флуоресценции повышена исходно более чем у 30% клеток, либо она возрастает более чем в 2 раза у более 50% клеток после обработки гепарином, диагностируют мужское бесплодие.

Недостатком известного способа следует признать его недостаточную точность.

Известен (RU, патент 2437100, опубл. 2011) способ диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии, включающий исследование состояния хроматина с использованием флуоресцентного микроскопа и красителя. При реализации способа определяют количество сперматозоидов в 1 мл раствора, концентрацию сперматозоидов доводят до 10-50 млн/мл буфером PBS, покровные стекла покрывают слоем полилизина, проводят иммобилизацию сперматозоидов на подготовленных покровных стеклах площадью около 3×5 мм2, фиксируют и окрашивают ядра иммобилизированных сперматозоидов ДНК-связывающим флуорохромом DAPI с получением контрольных образцов, вторую часть иммобилизированных сперматозоидов обрабатывают микрококковой нуклеазой, проводят фиксацию и окрашивание ядер сперматозоидов, обработанных микрококковой нуклеазой, ДНК-связывающим флуорохромом DAPI, окрашенные препараты контрольных сперматозоидов и сперматозоидов, обработанных микрококковой нуклеазой, фотографируют с использованием микроскопа и анализируют полученные изображения путем сравнения яркости изображений сперматозоидов, причем об аномалии упаковки хроматина сперматозоида судят по количеству ДНК, расщепленной нуклеазой, относительно общего количества ДНК в контроле.

Недостатком известного способа следует признать его недостаточную точность.

Наиболее близким аналогом разработанного способа можно признать (RU, патент 2426993, опубл. 2011) способ диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии, характеризуемый тем, что образец спермы очищают от сопутствующих соматических и недифференцированных клеток, очищенные сперматозоиды осаждают центрифугированием, промывают в буферном растворе с рН 7,6÷8,0, осадок ресуспендируют в буферном растворе с рН 7,8÷8,2 в присутствии 10÷15 мМ Трис-HCl, инкубируют при охлаждении, клетки осаждают центрифугированием с последующим промыванием осадка, промытый осадок ресуспендируют в растворе с рН 7,8-8,2 в присутствии 8,0-12 мМ Трис-HCl, к полученной суспензии добавляют микрококковую нуклеазу, образцы инкубируют при температуре от 10 до 40°С, останавливают гидролиз, с последующей гомогенизацией и повторным центрифугированием образцов с получением осадка, содержащего нерастворимый хроматин, и супернатанта, содержащего растворимый хроматин, и по процентному содержанию растворимого хроматина не менее 18,4% и нерастворимого хроматина не выше 81,4% диагностируют наличие аномалии упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии.

В данном случае критерием при определения мужского бесплодия является упаковка хроматин, хотя и измеренный со значительной ошибкой.

Недостатком ближайшего аналога следует признать его невысокую точность из-за малой точности определения количества сперматозоидов в исходной нативной сперме.

Техническая задача, решаемая посредством разработанного способа, состоит в создании диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии.

Технический результат, достигаемый при реализации разработанного изобретения, состоит в повышении точности определения аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии.

Для достижения указанного технического результата предложено в известном способе определения аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии использовать разработанный метод точного определения концентрации ДНК в эякуляте.

Реакция гидролиза ДНК экзогенной нуклеазой концентрационно зависима и изначально требует выбора соотношении ДНК : фермент, удовлетворяющего ряду условии: достоверность отбора пробы для гидролиза, достаточность количества ДНК (сперматозоидов) для корректного определения фракций после гидролиза и достаточного количества ДНК для спектрофотометрического определения. К сожалению, зачастую точность определения количества сперматозоидов в рутинных спермаграммах низкая. При подсчете концентрации клеток в микроскопической камере (типа камеры Горяева) велика ошибка при подсчете образцов с высоким содержанием клеток, что затрудняет подсчет подвижность сперматозоидов в нативной (не фиксированной) сперме.

Разработанный способ определения концентрации ДНК в эякуляте реализуют следующим образом.

В коническую микроцентрифужную пробирку с крышкой вносят 50 мкл эякулята и осаждают сперматозоиды в микроцентрифуге в течение 30 с при скорости вращения 3000-5000 об/мин, осадок промывают 1 раз однократным натрий-фосфатным буфером (1xPBS), затем повторно центрифугируют на микроцентрифуге в течение 30 с при скорости вращения 3000-5000 об/мин, удаляют супернатант, к осадку добавляют 1 мл 5% хлорной кислоты, кипятят на водяной бане в течение 9-11 мин с последующим осаждением материала на микроцентрифуге при скорости вращения 3000-5000 об/мин в течение 30 с. В отделенном супернатанте спектрофотометрически определяют концентрацию ДНК.

В дальнейшем диагностику аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии проводят известным из ближайшего аналога образом.

Аликвоту эякулята(10-20×106 сперматозоидов, 30-60 мкг по ДНК) переносим в коническую микроцентрифужную пробирку с крышкой, центрифугируем в микроцентрифуге 30 с при скорости 5000 об/мин. Осадок ресуспендируют в фосфатном буфере (PBS) с 5 мМ фенилметилсульфанилфторида (PMSF) и 1% Тритоном Х-100, инкубируют 5-10 мин на льду, клетки осаждают центрифугированием, осадок промывают 2 раза PBS с 5 мМ PMSF без Тритона Х-100. Полученный осадок ресуспендируют в растворе 20 мМ Трис-HCl (рН 8), 2 мМ CaCl2, 2 мМ MgCl2. Можно использовать 10 мМ Трис-HCl, однако в этом случае концентрация CaCl2, и MgCl2 должна составлять 1 мМ. К полученной суспензии добавляют микрококковую нуклеазу в диапазоне концентраций от 10 ед./мг до 50 ед./мг. Образцы инкубируют 3 мин при температуре не ниже 10 и не выше 40°С. Реакцию гидролиза останавливают добавлением ЭДТА до 10 мМ во льду, образцы гомогенизируют энергичным встряхиванием или в приборе «Вортекс» и затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5-10 мин. Полученный осадок (фракция 1) содержит нерастворимый хроматин, супернатант (фракция 2) содержит растворимый хроматин, содержание нерастворимого хроматина и растворимого хроматина определяют известными методами.

В супернатанте можно дополнительно выделить кислоторастворимый хроматин путем добавления к супернатанту, содержащему растворимый хроматин, 5% HClO4. Полученную суспензию кипятят 15 мин и центрифугируют. Можно кипятить суспензию 10 мин. После центрифугирования концентрацию ДНК, характеризующую кислоторастворимый хроматин, определяют на спектрофотометре.

Используемый при реализации способа эякулят должен быть или свежим, или быть замороженным с криопротектором, или хранимый в холодильнике непосредственно после забора не свыше одних суток.

При наличии в семенной жидкости соматических клеток более 5% желательно предварительно провести очистку эякулята. Эта операция может быть проведена с использованием буфера, содержащего 0,5% SDS.

Экспериментально установлено, что использование нового приема определения концентрации сперматозоидов позволяет повысить точность разработанного способа примерно на 30-40%.

1. Способ диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии, включающий осаждение сперматозоидов центрифугированием, промывку их в буферном растворе с рН 7,6÷8,0, ресуспендирование осадка в буферном растворе с рН 7,8÷8,2 в присутствии 10÷15 мМ Трис-HCl, инкубирование при охлаждении, осаждение клеток центрифугированием с последующим промыванием осадка, ресуспендированием промытого осадка в растворе с рН 7,8÷8,2 в присутствии 8,0÷12 мМ Трис-HCl, добавление к полученной суспензии микрококковой нуклеазы, инкубирование образцов при температуре от 10 до 40°С, остановку гидролиза с последующей гомогенизацией и повторным центрифугированием образцов с получением осадка, содержащего нерастворимый хроматин, и супернатанта, содержащего растворимый хроматин, и по процентному содержанию растворимого хроматина не менее 18,4% и растворимого хроматина не выше 81,4% диагностируют наличие аномалии упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии, отличающийся тем, что для определения количества сперматозоидов в эякуляте предварительно аликвоту эякулята вносят в пробирку с крышкой, осаждают сперматозоиды центрифугированием, промывают осадок однократным натрий-фосфатным буфером, центрифугированием отделяют осадок, подкисляют его действием разбавленной хлорной кислоты, кипятят на водяной бане и осаждают материал центрифугированием с последующим определением в осадке концентрации ДНК, при этом для диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии используют аликвоту эякулята, содержащую 10-20×106 сперматозоидов, 30-60 мкг по ДНК.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно в аликвоте эякулята измеряют спектрофотометрически концентрацию ДНК, характеризующую содержание кислоторастворимой фракции хроматина.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области нанотехнологий и молекулярной биологии. Предложен способ детекции проникновения углеродных нанотрубок (УНТ) в биологическую ткань, геном клеток которой содержит промотор гена теплового шока, сшитый с кодирующей областью дрожжевого транскрипционного фактора Gal4, и генетическую репортерную конструкцию UAS-GFP.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной хирургии, и может быть использовано для прогнозирования течения энтеральной недостаточности при остром перитоните в эксперименте.

Изобретение относится к клинической биохимии и представляет собой способ экспресс-определения резистентности к окислению липопротеинов низкой плотности сыворотки крови путем обработки буфером, содержащим поливинилпирролидон (ПВП) с последующей турбидиметрической регистрацией смеси, отличающийся тем, что обработку сыворотки или плазмы крови человека ведут 15% раствором ПВП-12600 в 0,01М Трис-HCl-буфере, pH 7,4, содержащем 0,15М NaCl, при объемном соотношении сыворотка : ПВП (1 : 6), инкубируют 10 и 20 мин при комнатной температуре, измеряют светопоглощение спектрофотометрически при длине волны 450 нм в опытной и контрольной пробах, вычисляют разность между ними и при отсутствии разницы констатируют нормальную резистентность к окислению ЛНП в сыворотке крови человека.

Изобретение относится к клинической биохимии и представляет собой способ определения литической активности множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности (ммЛНП) путем обработки сыворотки крови 20% раствором поливинилпирролидона с молекулярной массой 35000 (ПВП-35000) при объемном соотношении сыворотка: ПВП (1:0,84), инкубируют 10 мин при комнатной температуре, агрегаты ммЛНП осаждают центрифугированием, декантируют, осадок ммЛНП растворяют в буфере без ПВП, добавляют аутологичные отмытые стандартизованные эритроциты человека, инкубируют в течение 48 часов при комнатной температуре, измеряют оптическую плотность на фотометре при длине волны 620 нм, по калибровочному графику определяют степень лизиса и при лизисе более 10% констатируют повышенную литическую активность ммЛНП.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для неинвазивного определения сахара в крови. Для этого осуществляют подготовку рабочего прибора для определения сахара в крови, в котором используют пробу и реагент, при этом в качестве пробы применяют дозу слюны пациента, а в качестве реагента используют первичный конгломерат монореактива Глюкоза-Ново, где глюкозооксидаза дополнительно содержит мутаротазу.

Изобретение относится к поглощающему изделию, выполненному с возможностью определения ионной силы мочи. Изделие включает непроницаемый для жидкости слой; проницаемый для жидкости слой; поглощающий внутренний слой, расположенный между непроницаемым для жидкости слоем и проницаемым для жидкости слоем; устройство с латеральным потоком, интегрированное в изделие и расположенное таким образом, что оно находится в жидкостном соединении с потоком мочи, выделяемой пользователем изделия.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и представляет собой бактериальную клетку, способную реплицироваться в среде, содержащей по меньшей мере один тяжелый металл, выбранный из ртути, кадмия, цинка и свинца.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для определения кислотной устойчивости эритроцитов. Способ заключается в том, что в пробирку с кровью добавляют антикоагулянт (трилон Б) из расчета 10 мкл на 2 мл крови.

Группа изобретений относится к медицине и описывает композицию реактивов для измерения количества лития в биологических образцах, отличающуюся тем, что указанная композиция реактивов для измерения количества лития представляет собой водный раствор, содержащий соединение, которое имеет структуру, представленную формулой (I), смешиваемый с водой органический растворитель, выбранный из диметилсульфоксида (DMSO), диметилформамида (DMF) и диметилацетамида (DMA), и модификатор pH для доведения pH до значения в диапазоне от pH 5 до pH 12, концентрация соединения формулы (I) составляет от 0,1 до 1,0 г/л.

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии, и предназначено для выявления риска развития преэклампсии у женщин с неотягощенной наследственностью.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики аномалий дифференцировки сперматозоидов при мужском бесплодии. Сущность способа состоит в том, что проводят количественное определение в ядрах сперматозоидов тиоловых групп. При окрашивании 25-30% ядер живых сперматозоидов путем обработки пробы спермы реагентом MitoTrackerRed диагностируют наличие аномалии дифференцировки сперматозоидов при мужском бесплодии. Использование заявленного способа позволяет повысить эффективность диагностики аномалии дифференцировки сперматозоидов. 1 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной фармакологии, и может быть использовано для количественного определения карнозина в тканях и физиологических жидкостях. Определение карнозина в биологических материалах осуществляют высокоселективным методом масс-спектрометрии с применением электроспрейной ионизации. При этом предварительно осуществляют депротеинизацию плазмы крови с помощью 10% водного раствора трихлоруксусной кислоты. Затем к депротеинизированному образцу добавляют аликвоту раствора внутреннего стандарта L-аланил-карнозина. А разделение продуктов экстракции проводят на обращенно-фазной хроматографической колонке 4,6×150 мм с температурой разделения 35°C и скоростью подачи элюента 0,7 мл/мин. Причем в качестве элюента применяют 10 мМ ацетат аммония, подкисленный ледяной уксусной кислотой до pH 3.7, и смесь ацетонитрила с 10 мМ ацетатом аммония в соотношении 90:10, взятые в процентном соотношении 10:90 соответственно. Детектирование карнозина проводят по четырем дочерним ионам с m/z 110.0, 156.1, 180.0, 210.1, образующимся в результате распада молекулярного иона карнозина с m/z 227.1. А концентрацию карнозина рассчитывают по отношению площади хроматографического пика карнозина к площади пика внутреннего стандарта - L-аланил-карнозина. Изобретение обеспечивает высокоселективный и чувствительный хроматомасс-спектрометрический метод количественного определения карнозина в биологических субстратах. 6 ил., 2 табл., 1 пр.

Группа изобретений относится к молекулярной биологии, биофизике, биохимии и биотехнологии и касается способа анализа взаимодействий между молекулами, флуоресцирующими в ультрафиолетовой (УФ) области спектра, включая белки, пептиды, гликопротеины, протеогликаны и другие соединения, последовательность которых содержит один или более аминокислотных остатков триптофана (Trp), и биологическими молекулами, иммобилизованными в ячейках биологического микрочипа (биочипа), при котором анализ взаимодействий производится на основе измерения интенсивности УФ-флуоресценции аминокислотных остатков триптофана. Группа изобретений также касается устройства для осуществления указанного способа анализа в УФ области спектра. Группа изобретений обеспечивает возможность исключения применения флуоресцентных меток для регистрации связывания и обеспечивает анализ взаимодействия биологических молекул с молекулами на биочипе по УФ-флуоресценции природного флуорофора - аминокислотного остатка триптофана. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 2 пр., 8 ил.
Наверх