Способ определения нейтрализующих антител в сыворотке крови больных рассеянным склерозом, леченных препаратами интерферона-бета

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для определения нейтрализующих антител (HAT) в сыворотке крови больных рассеянным склерозом, леченных препаратами интерферона-бета (ИФНβ). Для этого применяют цитопатический тест с использованием чувствительной к вирусу энцсфаломиокардита мышей (ЕМС) культуры клеток фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ). Определение HAT к препарату ИФНβ проводят при помощи реакции нейтрализации антивирусной активности методом титрования сыворотки рефрактерного к лечению соответствующим препаратом пациента, определением HAT к препарату ИФНβ. Проводят культивирование клеток ФЛЭЧ в условиях 37±2°С в атмосфере CO2 5,0±0,5% и 90±5% влажности в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) в течение 1 суток в ячейках плоскодонного 96-луночного планшета в количестве 20-50 тыс.кл./яч. В день постановки теста разводят контрольную ЭТС и испытуемую сыворотку пациента в 10 или в 20 раз. Затем в ячейках круглодонного планшета готовят по 100 мкл разведений препарата ИНФβ в нсобогащенной сывороткой среде RPMI-1640: 2000; 1000; 500; 250; 125; 63; 31; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0 МЕ/мл; в ячейки с двумя приготовленными разведениями препарата ИФНβ параллельно вносят по 100 мкл разведенные в 10 или 20 раз сыворотки пациента и контрольной ЭТС. Инкубируют планшет 1 час в условиях CO2-инкубатора. Далее удаляют среду из культуральных планшетов с преинкубированными клетками ФЛЭЧ и в ячейки вносят по 100 мкл приготовленных разведений препарата с сывороткой пациента. Проводят инкубацию планшетов с клетками в течение 22-24 часов, далее в необогащенную сывороткой основу среды DMEM вносят вирус-индикатор ЕМС или VSV (вирус энцефаломиокардита мышей/вирус везикулярного стоматита, штамм «Индиана») в дозе составляющей 102±0,25 ТЦД50 в 0,1 мл. Проводят инкубирование в термостате 22-24 часа. Через сутки оценивают цитопатическое действие вируса в зависимости от наличия нейтрализующей ИНФβ активности сыворотки пациента по формуле: HAT (НЕ/мл)=А (МЕ/мл)×Z, где А (МЕ/мл) - максимальная нейтрализуемая активность препарата ИНФ-бета, при которой наблюдается цитодеструктивное действие вируса на монослой чувствительной культуры ФЛЭЧ, выраженная в международных единицах на 1 мл; Z - разведение сыворотки пациента. Использование данного способа позволяет оценку эффективности лечения препаратами у пациентов, в течение длительного времени подвергавшихся лечению препаратами ИФНβ путем количественного определения ИНФβ нейтрализующих антител. 1 з.п. ф-лы, 3 пр., 2 табл.

 

Изобретение относится к иммунологии, медицине, а именно к лабораторной диагностике наличия и количественной оценки уровня нейтрализующих антител (HAT) в сыворотке крови больных рассеянным склерозом (PC), получавших терапию препаратами интерферона-бета (ИФНβ). Описанный способ исследования направлен на оценку эффективности лечения препаратами у пациентов, в течение длительного времени подвергавшихся лечению препаратами ИФНβ. Практическим результатом диагностической процедуры с использованием заявленного способа является коррекция выбранной схемы лечения по назначению/замене и количеству используемого препарата.

Рассеянный склероз (PC) - хроническое, этиологически мультифакториальное прогрессирующее демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы [1, 2]. Превентивная терапия, основанная на применении препаратов интерферона бета (ИФНβ) и используемая с 1990-х годов, позволила совершить поистине революционный переворот и изменить течение и прогноз этой болезни. Она проводится в период ремиссии и стабилизации (вне обострения PC) и нацелена на предупреждение обострений при прогрессировании инвалидизации, при ремиттирующем и вторично прогрессирующем течении болезни [1, 2, 3].

ИФНβ (1а и 1b), используемые в терапии PC, как продукты генноинженерных технологий, являются белковыми субстанциями. В этой связи они потенциально иммуногенны. HAT против ИФНβ возникают в результате нарушения иммунотолерантности, ассоциированной с процессами повторного представления антигена [2, 4]. Эффекторами иммунного ответа на введение терапевтических препаратов ИФНβ выступают т.н. нейтрализующие антитела (HAT), блокирующие активность молекул ИФН на этапе их связывания со специфическими рецепторами [5]. Сообщается, что HAT могут быть обнаружены в крови пациентов с PC, получающих ИФНβ, уже по прошествии 3-6 мес после инициации лечения [1, 4]. Частота их появления зависит от используемых препаратов ИФН-бета. Так, по данным Т.Е. Шмидт и Н.Н. Яхно (2010), HAT к ИФНβ-1b появляются у 28-45% больных, к ИФНβ-1а для подкожного введения - у 11-24%, а к ИФНβ-1a для внутримышечного введения - лишь у 2-5% пациентов [1, 2].

В различных публикациях сообщается, что у НАТ-позитивных пациентов с PC (особенно с высокими титрами) существенно снижается эффективность терапии ИФНβ [1, б].

Определение HAT является чрезвычайно трудоемким процессом, поскольку использование скрининг-исследований на основе методы ELISA, белкового иммуноблота, радиоиммунопреципитации или аффинной хроматографии не позволяет дифференцировать обнаруженную активность связывания ИФНβ между связывающими антителами (CAT) и HAT [1]. Поэтому выявление HAT основано на специфических функциональных клеточных тестах.

При исследовании HAT in vitro D. Hess и соавт. (2007, 2009) использовали тест, получивший название «индукции МхА» [1, 7, 8]. Этот метод позволяет определить способность HAT, присутствующих в сыворотке крови пациентов, к снижению ИФНβ-индуцированной экспрессии специфического маркера ИФН - МхА (в форме мРНК или на белковом уровне). МхА - это белок резистентности к миксовирусам. Предполагается, что мРНК маркера МхА является наиболее чувствительным показателем при исследовании HAT; он получает все большее распространение [1,4].

В настоящее время перспективным методом исследования является так называемое люциферазное исследование, основанное на использовании клеток фибросаркомы человека с внесенной люциферазной кассетой гена-репортера (при наличии HAT связывания молекулы ИФНβ с соответствующим рецептором и активации трансклеточного сигнального механизма с последующей транкрипцией гена люциферазы не происходит) [1,9].

К традиционным методам определения активности HAT к ИФНα, β и γ относится биологическое тестирование путем титрования сыворотки пациента с ИФН-содержащим препаратом на газоне культуры клеток с последующей обработкой тест-вирусом и исследования эффектов цитопатических свойств патогена [10]. Практическое применение данного метода основано на владении основами техники культивирования клеток эукариот и вирусологических исследований.

Из уровня техники известны патенты с описанием лечебного эффекта ИФН-НАТ при системных заболеваниях аутоимунной природы.

Патент RU 2431638 «Моноклональные антитела против интерферона-альфа» описывает разработку фармакологического препарата HAT, которые избирательно нейтрализуют биоактивность по крайней мере двух подтипов белка интерферона-альфа (ИФНα). Антитела согласно изобретению эффективны для выявления подтипов ИФНα в образце или ткани и/или для терапевтического применения, включающего в себя лечение и/или улучшение состояния при связанных с ИФНα заболеваниях, таких как системная красная волчанка, диабет типа I, псориаз, СПИД и реакция "трансплантат против хозяина".

Аналогичное по направлению применения и способу реализации изобретение описано в патенте RU 2314317 «АНТИТЕЛА ПРОТИВ ИНТЕРФЕРОНА-АЛЬФА». Использование изобретения позволяет одновременно подавлять биологическую активность, по крайней мере, семи подтипов ИФНα человека, а именно ИФНα1, ИФНα2, ИФНα4, ИФНα5, ИФНα8, ИФНα10, ИФНα21, что может найти применение в диагностике и терапии различных заболеваний человека, опосредуемых ИФНα, таких как инсулинозависимый сахарный диабет или системная красная волчанка.

Наиболее близкий к заявленному способу определения ИФНβ-НАТ с использованием постоянной линии клеток фибросаркомы трансфецированных репортерной системой активности ИФНβ основан на измерении индуцированной экспрессии гена люциферазы и требует наличия специальных реактивов и оборудования [Lallemand С, Meritet J.F., Erickson R., et al., Quantification of neutralizing antibodies to human type I interferons using division-arrested frozen cells carrying an interferon-regulated reporter-gene, J. Interferon Cytokine Res., V. 28, N 6, 393-404, 2008].

Несмотря на возрастающую актуальность проблемы, в доступной базе данных отсутствуют патенты, связанные с описанием системам обнаружения HAT против лекарственных субстанций, обладающих потенциальной иммуногенностью.

Задача изобретения: своевременное выявление и количественное определение интерферон-нейтрализующих антител (ИФН-НАТ).

Технический результат изобретения: обеспечивается качественное и количественное определения ИНФβ нейтрализующих антител, основанное на оценке индуцированного тест-вирусом цитопатического эффекта в отношении чувствительных культур прикрепляемых клеток фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ) и бессывороточной линии клеток эпителия почечных канальцев зеленой мартышки (Vero-SF).

Указанный технический результат достигается за счет того, что заявлен способ определения нейтрализующих антител (HAT) в сыворотке крови больных рассеянным склерозом, леченных препаратами интерферона-бета (ИФНβ), характеризующийся применением цитопатического теста с использованием чувствительной к вирусу энцсфаломиокардита мышей (ЕМС) культуры клеток фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ), причем определение HAT к препарату ИФНβ проводят при помощи реакции нейтрализации антивирусной активности методом титрования сыворотки рефрактерного к лечению соответствующим препаратом пациента, определением HAT к препарату ИФНβ путем культивирования клеток ФЛЭЧ в условиях 37±2°С в атмосфере CO2 5,0±0,5% и 90±5% влажности в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) в течение 1 суток в ячейках плоскодонного 96-луночного планшета в количестве 20-50 тыс.кл./яч., а в день постановки теста разводят контрольную ЭТС и испытуемую сыворотку пациента в 10 или в 20 раз; затем в ячейках круглодонного планшета готовят по 100 мкл разведений препарата ИНФβ в нсобогащенной сывороткой среде RPMI-1640: 2000; 1000; 500; 250; 125; 63; 31; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0 МЕ/мл; в ячейки с двумя приготовленными разведениями препарата ИФНβ параллельно вносят по 100 мкл разведенные в 10 или 20 раз сыворотки пациента и контрольной ЭТС; инкубируют планшет 1 час в условиях СО2-инкубатора; удаляют среду из культуральных планшетов с преинкубированными клетками ФЛЭЧ и в ячейки вносят по 100 мкл приготовленных разведений препарата с сывороткой пациента; проводят инкубацию планшетов с клетками в течение 22-24 часов, далее в необогащенную сывороткой основу среды DMEM вносят вирус-индикатор ЕМС или VSV (вирус энцефаломиокардита мышей/вирус везикулярного стоматита, штамм «Индиана») в дозе, составляющей 102±0,25 ТЦД50 в 0,1 мл; проводят инкубирование в термостате 22-24 часа; через сутки оценивают цитопатическое действие вируса в зависимости от наличия нейтрализующей ИНФβ активности сыворотки пациента по формуле: HAT (НЕ/мл)=А (МЕ/мл)×Z, где: А (МЕ/мл) - максимальная нейтрализуемая активность препарата ИНФ-бета, при которой наблюдается цитодеструктивное действие вируса на монослой чувствительной культуры ФЛЭЧ, выраженная в международных единицах на 1 мл; Z - разведение сыворотки пациента.

Способ может отличаться использованием чувствительных к вирусу везикулярного стоматита (VSV) клеток бессывороточной линии Vero-SF, причем в качестве среды культивирования клеток и последующего внесения вируса используют бессывороточную среду для прикрепляемых клеток Гибрис-1-П.

Осуществление изобретения

Изобретение реализуется за счет комбинированного введения сыворотки пациентов с ИФНβ в сосуды с чувствительными к ИФН клеточными культурами и последующей обработкой тест-вирусом. Наличие HAT в сыворотке блокирует активность ИФН и способствует цитодеструктивному поражению монослоя тест-культуры клеток. Таким образом, определение HAT к препарату ИФНβ связано с реакцией нейтрализации индуцируемой антивирусной активности методом биологического титрования с сывороткой рефрактерного к лечению соответствующим препаратом пациента. В целом заявленный способ определения нейтрализующих антител (HAT) в сыворотке крови больных рассеянным склерозом, леченных препаратами интерферона-бета (ИФНβ), основан на применении цитопатического теста с использованием чувствительной к вирусу энцефаломиокардита мышей (ЕМС) культуры псеадолинии клеток фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ). Проведенные авторами исследования показали, что использование чувствительных к вирусу везикулярного стоматита (VSV) клеток бессывороточной линии Vero-SF демонстрирует более точные и стабильные результаты теста при определении активности HAT.

С целью проведения теста определения HAT к препарату ИФНβ получают газон клеток тест-культуры (ФЛЭЧ, Vero-SF) путем посева и инкубации в течение 1 суток в ячейках плоскодонного 96-луночного планшета 20-50 тыс.кл./яч в условиях (37±2)°С, атмосфере С02 (5,0±0,5)% и (90±5)% влажности, в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) для клеток ФЛЭЧ или Гибрис-1-П для клеток Vero-SF. В день постановки теста разводят контрольную (эмбриональную телячью - ЭТС) и испытуемую сыворотку пациента в 10 или в 20 раз; затем в ячейках круглодонного планшета готовят по 100 мкл разведений препарата ИНФβ в необогащенной сывороткой среде RPMI-1640: 2000; 1000; 500; 250; 125; 63; 31; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0 МЕ/мл; в ячейки с двумя приготовленными разведениями препарата ИФНβ параллельно вносят по 100 мкл разведенных в 10 или 20 раз сыворотки пациента и контрольной ЭТС; инкубируют планшет 1 час в условиях СО2-инкубатора; удаляют среду из культуральных планшетов с преинкубированными клетками ФЛЭЧ и в ячейки вносят по 100 мкл приготовленных разведений препарата с сывороткой пациента; проводят инкубацию планшетов с клетками в течение 22-24 часов. Для выявления/количественного определения ИФНβ-НАТ, в необогащенной сывороткой основе среды DMEM или бессывороточной среде Гибрис-1-П, вносят рабочую дозу тест-вируса или вируса-индикатора EMC/VSV (вирус энцефаломиокардита мышей/вирус везикулярного стоматита, штамм «Индиана»), составляющую 10(2±0,25) ТЦД50 в 0,1 мл; проводят инкубирование в термостате 22-24 ч; через сутки оценивают цитопатическое действие вируса в зависимости от наличия нейтрализующей ИНФβ активности в сыворотке пациента; при этом определяется максимальная концентрация препарата, при которой наблюдается цитодеструктивное действие вируса на монослой чувствительной культуры в соответствие со схемой, представленной в Примере 1.

Пример 1

Определение HAT к препарату ИФНβ проводят при помощи реакции нейтрализации антивирусной активности методом биологического титрования с сывороткой рефрактерного к лечению соотв. препаратом пациента, с использованием культуры клеток псевдолинии ФЛЭЧ (фибробласты легких эмбриона человека). Для этого клетки ФЛЭЧ культивируют в условиях (37±2)°С в атмосфере СО2 (5,0±0,5)% и (90±5)% влажности в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) течение 1 сут в ячейках плоскодонного 96-луночного планшета в количестве 20-50 тыс./яч. В день постановки теста разводят контрольную (эмбриональную телячью - ЭТС) и испытуемую сыворотку пациента в 10 или в 20 раз.

В ячейках круглодонного 96-луночного планшета готовят по 100 мкл разведений препарата ИНФβ в необогащенной сывороткой среде RPMI-1640: 2000; 1000; 500; 250; 125; 63; 31; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0 МЕ/мл.

В ячейки с двумя приготовленными разведениями препарата ИФНβ параллельно вносят по 100 мкл разведенных в 10 или 20 раз сыворотки пациента и контрольной ЭТС. Инкубируют планшет 1 час в условиях СО2-инкубатора. Удаляют среду из культуральных планшетов с преинкубированными клетками ФЛЭЧ и в ячейки вносят по 100 мкл приготовленных разведений препарата с сывороткой пациента. Проводят инкубацию планшетов с клетками в течение 22-24 часов.

Для выявления/количественного определения ИФНβ-НАТ, в необогащенной сывороткой основе среды DMEM вносится рабочая доза тест-вируса или вируса-индикатора EMC/VSV (вирус энцефаломиокардита мышей/вирус везикулярного стоматита, штамм «Индиана»), составляющая 10(2±0,25) ТЦД50 в 0,1 мл. Проводится инкубирование в термостате 22-24 ч. Через сутки оценивают цитопатическое действие вируса в зависимости от наличия нейтрализующей ИНФβ активности в сыворотке пациента. При этом определяется максимальная концентрация препарата, при которой наблюдается цитодеструктивное действие вируса на монослой чувствительной культуры ФЛЭЧ.

Общая схема титрования препарата ИФНβ с исследуемой сывороткой крови пациента представлена в Табл. 1.

Активность нейтрализующих антител в сыворотке пациента выражается ее нейтрализующей активностью (НА), выраженной в нейтрализующих единицах:

где А (МЕ/мл) - максимальная нейтрализуемая активность препарата ИНФ-бета, выраженная в международных единицах на 1 мл; Z - разведение сыворотки пациента (10 или 20-кратное).

Пример 2

Отличается использованием адаптированной бессывороточной линии клеток Vero-SF (ООО НПП «ПанЭко»). Поддержание линии и все манипуляции при исследовании проводят в специальной бессывороточной среде для прикрепляемых клеток «Гибрис-1-П» (ООО НПП «ПанЭко»). Использование постоянной линии Vero-SF позволяет максимально стандартизовать метод «цитопатического теста» в условиях контролируемого роста клеток в бессывороточной среде, а также отсутствия дополнительных интерферирующих и связывающих сывороточных субстанций ксеногенного происхождения. Наиболее близкий к заявленному способу определения ИНФ-бета-НАТ с использованием постоянной линии клеток фибросаркомы трансфецированных репортерной системой активности ИНФ-бета основан на измерении индуцированной экспрессии гена люциферазы и требует наличия специальных реактивов и оборудования [11].

В качестве тест-вируса для заражения клеток Vero-SF в бессывороточной среде «Гибрис-1-П» эффективен вирус везикулярного стоматита VSV (штамм «Индиана»).

Все манипуляции по нейтрализации препарата ИФНβ, индукции противовирусной резистентности клеток, инфекции тест-вирусом, учета результатов исследования проводят аналогично описанным в Примере 1.

Пример 3

Проводили исследование статуса ИФНβ-НАТ в сыворотке крови 28 больных PC, получавших длительное лечение препаратами ИНФ-бета.

У всех пациентов был поставлен диагноз PC, согласно обновленным критериям W.J. MacDonald в модификации 2010 г., (ремиттирующее течение у 23 пациентов, вторично-прогредиентное течение (ВПТ), у 5 в стадии неполной ремиссии заболевания. Все пациенты проходили лечение в неврологическом отделении Моники.

Результаты объективного неврологического обследования оценивались по общепринятой шкале клинической оценки функционального состояния проводящих систем при этом заболевании, предложенной J.Kurtzke, и шкале инвалидизации EDSS (Expanded Disability Status Scale). Пациенты: женщины n=16, мужчины n=12, с продолжительностью болезни 7,63±4,87 лет, легкой и в основном средней степени тяжести ремиттирующего течения (EDSS в ремиссии в среднем составила 2,96±1,14 баллов); тяжелой степени при ВПТ (EDSS 6,2±0,27 баллов).

Пациенты получали препараты рекомбинантного ИФНβ-1b в дозе 8-9 млн ME. Все пациенты были разделены на 3 группы в зависимости от продолжительности приема препарата: 1 группа - 0.5-1 год; 2 группа - 1-2 года; 3 группа - более 2 лет.

Проведено определение содержания HAT в сыворотках пациентов по результатам реакции нейтрализации антивирусной активности препарата ИФНβ методом цитопатического теста. Оценку анти-ИФНβ нейтрализующей активности (НА) в сыворотках пациентов проводили параллельно на клеточных культурах ФЛЭЧ и Vero-SF и измеряли в нейтрализующих единицах (НЕ/мл) (см. Пример 1). Результаты определения статуса ИНФβ-НАТ у пациентов всех 3 групп представлены в Табл. 2.

Данные нашего исследования показывают, что вероятность образования специфических HAT и их содержание в сыворотке периферической крови пациентов увеличивается в течение более длительного применения ИФНβ препаратов. В связи с этим определение статуса ИФНβ-НАТ является важным критерием оценки эффективности ИФН-терапии при PC.

С точки зрения патентной ценности в рамках заявки на изобретение, полученные результаты демонстрируют высокую сходимость результатов цитопатического теста для систем тестирования использующих диплоидные клетки ФЛЭЧ и бессывороточную культуру постоянной клеточной линии Vero-SF. Отмечено, что использование бессывороточной системы тестирования обеспечивает более высокие показатели нейтрализующей активности сыворотки пациентов при низких титрах лекарственного препарата ИФНβ. Это, очевидно, связано с увеличенным временем репликации вируса в клетках бессывороточной культуры Vero-SF. Вместе с тем линия клеток приматов Vero-SF является наиболее удобным инструментом вследствие неограниченной способности к пассированию в контролируемых условиях бессывороточного культивирования.

Источники информации

1. Б.И. Бурсагова, и др., Проблема нейтрализующих антител в терапии рассеянного склероза, Педиатрическая фармакология, т. 8, №5, 61-64, 2011.

2. Шмидт Т.Е., Яхно Н.Н. Рассеянный склероз: руководство для врачей. 2-е изд. - М.: МЕДпресс-информ, 2010. - 272 с.

3. Damal К., Stoker Е., Foley J.F. Optimizing therapeutics in the management of patients with multiple sclerosis: a review of drug efficacy, dosing, and mechanisms of action. Biologies, V. 7, 247-258, 2013.

4. Sorensen P.S. Neutralizing antibodies against interferon-beta, Ther. Adv. Neurol. Disord. - 2008; 1: 62-78.

5. Noronha A., Neutralizing antibodies to interferon, Neurology, V. 68, N 12, 16-22, 2007.

6. Bertolotto A., Capobianco M, Amato MP, et al., Guidelines on the clinical use for the detection of neutralizing antibodies (NAbs) to IFN beta in multiple sclerosis therapy: report from the Italian Multiple Sclerosis Study group, Neurol. Sci., V. 35, N 2, 307-16, 2014.

7. Hesse D., Sorensen P. S. Using measurements of neutralizing antibodies: the challenge of IFN-beta therapy, Eur. J. Neurol., V. 14, 850-859, 2007.

8. Hesse D., Sellebjerg F., Sorensen P.S. Absence of MxA induction by interferon beta in patients with MS reflects complete loss of bioavailability, Neurology, V. 73, 372-377, 2009.

9. Farrell, R., Espasandin, M., Lakdawala, et al., Incorporation of an interferon-beta neutralizing antibody assay into routine clinical practice. Mult. Scler., V. 17, 1333-1340, 2011.

10. Massart C, Gibassier J., Oger J., et al., Neutralizing antibodies to interferon beta in multiple sclerosis: analytical evaluation for validation of a cytopathic effect assay. Clin. Chim. Acta, V. 377, 185-191, 2006.

1. Способ определения нейтрализующих антител (HAT) в сыворотке крови больных рассеянным склерозом, леченных препаратами интерферона-бета (ИФНβ), характеризующийся применением цитопатического теста с использованием чувствительной к вирусу энцсфаломиокардита мышей (ЕМС) культуры клеток фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ), причем определение HAT к препарату ИФНβ проводят при помощи реакции нейтрализации антивирусной активности методом титрования сыворотки рефрактерного к лечению соответствующим препаратом пациента, определением HAT к препарату ИФНβ путем культивирования клеток ФЛЭЧ в условиях 37±2°С в атмосфере CO2 5,0±0,5% и 90±5% влажности в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) в течение 1 суток в ячейках плоскодонного 96-луночного планшета в количестве 20-50 тыс.кл./яч., а в день постановки теста разводят контрольную ЭТС и испытуемую сыворотку пациента в 10 или в 20 раз; затем в ячейках круглодонного планшета готовят по 100 мкл разведений препарата ИНФβ в нсобогащенной сывороткой среде RPMI-1640: 2000; 1000; 500; 250; 125; 63; 31; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0 МЕ/мл; в ячейки с двумя приготовленными разведениями препарата ИФНβ параллельно вносят по 100 мкл разведенные в 10 или 20 раз сыворотки пациента и контрольной ЭТС; инкубируют планшет 1 час в условиях CO2-инкубатора; удаляют среду из культуральных планшетов с преинкубированными клетками ФЛЭЧ и в ячейки вносят по 100 мкл приготовленных разведений препарата с сывороткой пациента; проводят инкубацию планшетов с клетками в течение 22-24 часов, далее в необогащенную сывороткой основу среды DMEM вносят вирус-индикатор ЕМС или VSV (вирус энцефаломиокардита мышей/вирус везикулярного стоматита, штамм «Индиана») в дозе, составляющей 102±0,25 ТЦД50 в 0,1 мл; проводят инкубирование в термостате 22-24 часа; через сутки оценивают цитопатическое действие вируса в зависимости от наличия нейтрализующей ИНФβ активности сыворотки пациента по формуле HAT (НЕ/мл)=А (МЕ/мл)×Z, где А (МЕ/мл) - максимальная нейтрализуемая активность препарата ИНФ-бета, при которой наблюдается цитодеструктивное действие вируса на монослой чувствительной культуры ФЛЭЧ, выраженная в международных единицах на 1 мл; Z - разведение сыворотки пациента.

2. Способ по п. 1 отличающийся использованием чувствительных к вирусу везикулярного стоматита (VSV) клеток бессывороточной линии Vero-SF, причем в качестве среды культивирования клеток и последующего внесения вируса используют бессывороточную среду для прикрепляемых клеток Гибрис-1-П.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ прогнозирования риска развития быстрорастущей миомы матки, заключающийся в том, что исследуют ультразвуковые параметры матки с подсчетом количества миоматозных узлов, методом краевой дегидратации менструальных выделений (МВ) определяют наличие параллельных и волокнистых структур и рассчитывают коэффициент Р: где z рассчитывают по формуле:z=b1×x1+b2×x2+b3×х3+а,где b1 - коэффициент, равный 2,172; x1 - волокнистые структуры в MB: наличие «2»; отсутствие «1»; b2 - коэффициент, равный 2,238; x2 - параллельные структуры в MB: наличие «2»; отсутствие «1»; b3 - коэффициент, равный 1,568; x3 - количество узлов; а - константа, равная –10,915; и при значении Р>0,5 дополнительно методом иммуноферментного анализа исследуют уровни лигандов APRIL и TRAIL, и при значении APRIL более 11,1 нг/мл, TRAIL менее 22,5 пг/мл прогнозируют риск развития быстрорастущей миомы матки.

Изобретение относится к области медицины и биологии, в частности к исследованиям таких канцерогенных веществ, как нитрозамины, модифицирующие апоптоз у детей, проживающих в неблагоприятных условиях среды обитания.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и патоморфологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики опухолей аногенитальных маммароподобных желез.

Настоящее изобретение касается способа предварительной оценки, будет ли терапевтическое средство, выбранное из группы полипептид, антитело или иммуноадгезин, иметь необходимую скорость выведения у яванского макака, человека.
Изобретение относится к области медицины, к лабораторной диагностике в гинекологии и касается способа определения вида эндометриоза яичника. Способ включает анализ транскриптома эндометриоидной ткани очага эндометриоза яичника путем проведения исследования экспрессии гена TIMP1, при превышении экспрессии гена TIMP1 относительно гена выше 0,5 о.е.
Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии, и может быть использовано для прогнозирования течения апластической анемии после спленэктомии. Для этого после удаления селезенки определяют ее массу.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при лечении сарком мягких тканей для прогнозирования возникновения рецидива. Для этого с помощью проточной цитофлюориметрии проводят определение процентного содержания T-regs(CD3+CD4+CD25+CD127dim) лимфоцитов от количества CD3+CD4+клеток в гомогенатах образцов опухолевой ткани и в ткани линии резекции после хирургического удаления опухоли.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и касается иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики анаэробной энтеротоксемии сельскохозяйственных животных, вызываемой бактериями Clostridium perfringens (Cl.

Изобретение относится к области медицины, а именно к авиакосмической медицине, и может быть использовано для оценки оптимального уровня компенсаторно-приспособительных и адаптационных возможностей организма космонавтов в условиях космического полета.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкогинекологии, и может быть использовано для прогноза возникновения рецидива у больных раком вульвы. Для этого в ткани больных раком вульвы иммуногистохимическим методом полуколичественно оценивают экспрессию маркеров ангиогенеза - CD34, апоптоза - р53, пролиферативной активности - Ki-67.

Изобретение относится к области биохимии. Заявлено антитело, специфически связывающееся с PTK7 (протеинтирозинкиназа 7) человека, а также конъюгат указанного антитела с цитотоксическим агентом. Также предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие указанное антитело, и включающие их экспрессионные векторы и клетки-хозяева. Кроме того, предложены способы применения указанного антитела, в том числе в составе конъюгата, для диагностики и лечения рака у субъекта. Изобретение обеспечивает эффективное нацеливание на опухолевые стволовые клетки, что может быть использовано для лечения пациентов, страдающих от широкого спектра злокачественных образований. 16 н. и 36 з.п. ф-лы, 42 ил., 5 табл., 16 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и найдет широкое применение в лечении пациенток с аменореей, обусловленной нервной анорексией. Сущность способа: пациенток на этапе редукции нервной анорексии с продолжающейся аменореей в сыворотке крови методом ИФА определяют уровень дофамина и ЛГ, и если уровень дофамина составляет 67,25 пг/мл и более, но менее 280 пг/мл, а показатели ЛГ 0,95 мМЕ/л и более, прогнозируют нормализацию менструальной функции. Применение данного способа прогнозирования восстановления менструальной функции позволит своевременно выбрать адекватную терапию для лечения данного заболевания, что поможет предотвратить развитие вторичного гипогонадизма, приводящего к гипоплазии матки и бесплодию в репродуктивном периоде. Способ позволяет объективизировать оценку эффективности лечения и своевременно прогнозировать дальнейшее течение заболевания. Способ имеет чувствительность – 93,9%, специфичность 93,9%, точность 88,2%. 3 пр.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для иммуногистохимического выявления антигенов в препаратах органов продуктивных и непродуктивных животных длительного хранения в фиксаторах. Для этого проводят обработку поверхности предметного стекла для наклеивания срезов адгезивом на основе яичного белка и глицерина в соотношении 2:1. Затем проводят депарафинирование и регидратацию срезов. При этом после депарафинизации и регидратации срезы опускают на 5 мин в чистую емкость с дистиллированной водой. После чего срезы помещают в Н2О2 на 10-12 мин, после работы пароварки, содержащей цитратный буфер в течение 40-45 мин. При этом стекла из пароварки не вынимают в течение 20 мин после прекращения ее работы. Промывают срезы дистиллированной водой, затем помещают в буфер Твин 20х. Для образования сухого поля срезы промакивают одноразовыми бумажными полотенцами и делают вокруг срезов гидрофобный слой маркером. Далее наносят блокировочный раствор, в качестве которого используют 5% бычий сывороточный альбумин, на 10-12 мин. Наносят первичные антитела и ставят в термостат при 27°С на 24-26 ч во «влажной камере», через 14-15 ч смывают первичные антитела буфером Твин 20х в течение 5-7 мин. При этом срезы промакивают и наносят на них вторичные антитела. Ставят в термостат на 1-2 ч во «влажной камере» при температуре 27°С. Смывают вторичные антитела, при этом используют хромоген на безбиотиновой системе детекции. Окрашивают в течение 3 мин, смывают хромоген в трех порциях дистиллированной воды по 5-7 мин. Докрашивают срезы гематоксилином Майера 5-7 мин. Затем ополаскивают стекла в дистиллированной воде и опускают в щелочную воду на 10-15 с. Изобретение позволяет выявлять антигены в гистологических препаратах, после их длительного хранения в фиксаторах. 8 ил., 4 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к ветеринарии, и может быть использовано для получения антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных. Для этого проводят экстракцию липополисахаридов бруцелл вида Brucella abortus и Brucella melitensis, для чего их берут в равном соотношении. Обрабатывают 2%-ным раствором уксусной кислоты в присутствии 10% NaCl при автоклавировании, затем отделяют экстракт центрифугированием, фракционируют супернатант спиртом с последующим диализом и выделяют О-полисахарид центрифугированием. Использование данного способа позволяет получить комплексный антиген, содержащий О-полисахаридный М- и А-антигены, при этом включение в комплекс М-компонента значительно повышает чувствительность реакции иммунодиффузии при диагностике бруцеллеза, вызываемого B. Melitensis. 1 пр.

Настоящее изобретение относится к акушерству и касается прогнозирования угрозы невынашивания инфекционного генеза на ранних сроках гестации. Сущность способа: в сыворотке крови беременных со сроком 6-11 недель гестации с помощью иммуноферментного анализа определяют уровень интерфероноподобного цитокина IL-28B. При концентрации IL-28B выше 261,4 пг/мл по сравнению с концентрацией, установленной для физиологически протекающей беременности, прогнозируют угрозу выкидыша в первом триместре гестации. Изобретение обеспечивает повышение точности прогнозирования угрозы невынашивания за счет использования в качестве количественного показателя увеличение концентрации цитокина IL-28B. Способ малоинвазивен, удобен и прост в применении, достаточно информативен и имеет высокую достоверность прогноза. Использование данного способа будет способствовать более быстрой и безопасной диагностике угрозы прерывания беременности инфекционного генеза в I триместре. 1 табл., 4 пр.

Изобретение относится к медицине и касается способа получения селективного иммуносорбента для удаления антител к десмоглеину 3 типа (Dsg3) из крови больных пузырчаткой, при котором приготавливают раствор Dsg3 в фосфатном буфере. В пустую центрифужную микроколонку добавляют сухую NHS-активированную агарозу, вносят раствор Dsg3 в микроколонку с агарозой и, перемешивая, инкубируют; по окончании инкубации микроколонку центрифугируют с охлаждением, затем получившийся фильтрат отбирают, после чего для отмывки от несвязавшегося Dsg3 в колонку добавляют фосфатный буфер, центрифугируют; повторяют процедуру отмывки, фильтраты после отмывок отбирают; далее для блокирования остаточных активных NHS-групп сорбента добавляют раствор буфера - этаноламина и, перемешивая, инкубируют; по окончании инкубации центрифугируют, фильтрат удаляют; повторяют процедуру отмывки, фильтраты после отмывок отбирают; готовый сорбент используют для выделения аутоантител к Dsg3. Изобретение обеспечивает получение селективного иммуносорбента для избирательного удаления антител к десмоглеину 3 типа из сыворотки крови у больных пузырчаткой. 4 ил., 1 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Предложено антитело к рецептору эпидермального фактора роста 2 (HER2) человека, а также включающие указанное антитело фармацевтические композиции, предназначенные для профилактики и лечения злокачественной опухоли и для индуцирования апоптоза. Кроме того, предложен набор для диагностики злокачественной опухоли, включающий указанное антитело. Изобретение позволяет уничтожать раковые клетки с существенно увеличенной цитотоксичностью при применении указанного антитела в комбинации с трастузумабом и может быть использовано в терапии рака. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 27 ил., 10 табл., 15 пр.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлен рекомбинантный ген, кодирующий белок L1 вируса папилломы человека 16 типа, с кодонами, оптимизированными для гетерологичной экспрессии в штаммах Е. coli. Представлен экспрессионный плазмидный вектор pQE-L1/16, несущий указанный рекомбинантный ген. Представлен способ получения рекомбинантного белка L1HPV16 с использованием указанного вектора, которым трансформируют штаммы Е. coli. Представлены иммуногенная композиция и вакцина для индукции специфического клеточного и гуморального иммунитета против HPV16, содержащие рекомбинантный белок L1HPV16. Группа изобретений позволяет получать устойчивый очищенный иммуногенный белок L1HPV16, а также позволяет снизить стоимость процесса его получения для применения в составе эффективных иммуногенных композиций и вакцин против вируса папилломы человека 16 типа. 6 н.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 5 пр.

Настоящая группа объектов изобретения относится к области биотехнологии. Предложен рекомбинантный мультимерный скаффолд на основе 3 домена FnIII тенасцина (Tn3), который специфически связывается с рецептором 2 TRAIL (TRAIL R2). Кроме того, рассмотрена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая мультимерный скаффолд; вектор экспрессии; клетка-хозяин и способ получения рекомбинантного мультимерного скаффолда. Также описаны: фармацевтическая композиция; способ профилактики, лечения или снижения симптомов рака; способ индуцирования апоптоза в клетке и способ изменения активности TRAIL R2-экспрессирующей клетки. Мультимерный скаффолд по настоящему изобретению обладает повышенной аффинностью относительно TRAIL R2, повышенной стабильностью и пониженной иммуногенностью. В этой связи настоящее изобретение может найти дальнейшее применение в терапии и диагностике заболеваний, связанных с TRAIL R2. 9 н. и 23 з.п. ф-лы, 25 табл., 28 ил., 22 пр.

Группа изобретений относится к способу калибровки составного анализа, включающему: добавление калибровочного реагента, включающего по меньшей мере две различные связывающие молекулы, где каждая молекула обладает способностью специфичного связывания с агентом захвата и способностью связываться с детектирующей молекулой и где по меньшей мере две из связывающих молекул имеют различные специфичности и присутствуют в различных концентрациях, добавление детектирующей молекулы, детектирование связанной детектирующей молекулы, создание калибровочной кривой, включающей ряд калибровочных точек/интервалов. Также группа изобретений относится к набору реагентов и составной аналитической системе. Применение группы изобретений позволяет повысить точность результатов благодаря системной вариабельности систематических анализов в течение времени. 4 н. и 16 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 табл., 3 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для определения нейтрализующих антител в сыворотке крови больных рассеянным склерозом, леченных препаратами интерферона-бета. Для этого применяют цитопатический тест с использованием чувствительной к вирусу энцсфаломиокардита мышей культуры клеток фибробластов легкого эмбриона человека. Определение HAT к препарату ИФНβ проводят при помощи реакции нейтрализации антивирусной активности методом титрования сыворотки рефрактерного к лечению соответствующим препаратом пациента, определением HAT к препарату ИФНβ. Проводят культивирование клеток ФЛЭЧ в условиях 37±2°С в атмосфере CO2 5,0±0,5 и 90±5 влажности в среде DMEM с 10 эмбриональной телячьей сыворотки в течение 1 суток в ячейках плоскодонного 96-луночного планшета в количестве 20-50 тыс.кл.яч. В день постановки теста разводят контрольную ЭТС и испытуемую сыворотку пациента в 10 или в 20 раз. Затем в ячейках круглодонного планшета готовят по 100 мкл разведений препарата ИНФβ в нсобогащенной сывороткой среде RPMI-1640: 2000; 1000; 500; 250; 125; 63; 31; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0 МЕмл; в ячейки с двумя приготовленными разведениями препарата ИФНβ параллельно вносят по 100 мкл разведенные в 10 или 20 раз сыворотки пациента и контрольной ЭТС. Инкубируют планшет 1 час в условиях CO2-инкубатора. Далее удаляют среду из культуральных планшетов с преинкубированными клетками ФЛЭЧ и в ячейки вносят по 100 мкл приготовленных разведений препарата с сывороткой пациента. Проводят инкубацию планшетов с клетками в течение 22-24 часов, далее в необогащенную сывороткой основу среды DMEM вносят вирус-индикатор ЕМС или VSV в дозе составляющей 102±0,25 ТЦД50 в 0,1 мл. Проводят инкубирование в термостате 22-24 часа. Через сутки оценивают цитопатическое действие вируса в зависимости от наличия нейтрализующей ИНФβ активности сыворотки пациента по формуле: HAT А ×Z, где А - максимальная нейтрализуемая активность препарата ИНФ-бета, при которой наблюдается цитодеструктивное действие вируса на монослой чувствительной культуры ФЛЭЧ, выраженная в международных единицах на 1 мл; Z - разведение сыворотки пациента. Использование данного способа позволяет оценку эффективности лечения препаратами у пациентов, в течение длительного времени подвергавшихся лечению препаратами ИФНβ путем количественного определения ИНФβ нейтрализующих антител. 1 з.п. ф-лы, 3 пр., 2 табл.

Наверх