Способ лечения бронхиальных свищей, возникших после резекционных операций на легких
Владельцы патента RU 2691323:
Гилевич Ирина Валериевна (RU)
Коломийцева Елена Анатольевна (RU)
Коваленко Алексей Львович (RU)
Мунтян Ирина Николаевна (RU)
Поляков Игорь Станиславович (RU)
Порханов Владимир Алексеевич (RU)
Федоренко Татьяна Владимировна (RU)
Государственное бюджетное учреждения здравоохранения "Научно-исследовательский институт - Краевая клиническая больница N 1 имени профессора С.В. Очаповского" Министерства здравоохранения Краснодарского края (ГБУЗ "НИИ-ККБ N 1 им. проф. С.В. Очаповского") (RU)
Изобретение относится к медицине, а именно к торакальной хирургии, и может быть использовано при лечении бронхиальных свищей. Для этого в послеоперационном периоде после выявления методом фибробронхоскопии бронхиального свища размером более 5 мм размораживают дермальные аллофибробласты и ресуспендируют в 2 мл 0,9% физиологического раствора NaCl до конечной концентрации клеток 2,0×106 в дозе. Одновременно выполняют температурный лизис обогащенной тромбоцитами аутологичной плазмы с исходным содержанием в ней тромбоцитов 1,85×109/л для получения 2 мл аутологичного лизата тромбоцитов. Затем полученные компоненты смешивают в шприце. Подсоединяют шприц к эндоскопическому инъектору и производят 4-6 инъекций по периметру свища в подслизистый слой, отступив 1-2 мм от края свища на глубину 1 мм на одинаковом расстоянии друг от друга. Процедуру повторяют на 3-й и 5-й дни лечения с последующим цитологическим и гистологическим контролем результатов лечения. Способ обеспечивает устранение послеоперационных дефектов бронхов размером более 5 мм за счет раннего начала терапии активированными дермальными аллофибробластами. 5 ил., 2 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к торакальной хирургии, регенеративной медицине, и может быть использовано для лечения бронхиальных свищей.
Бронхиальные свищи (БС) дыхательных путей остаются одним из распространенных и опасных осложнений лечения патологии органов грудной клетки. Частота БС после пневмонэктомии составляет примерно 2-15% (Panagopoulos ND, Apostolakis Е, Koletsis Е et al. Low incidence of broncho-pleural fistula after pneumonectomy for lung cancer. Interact Cardiovasc Thorac Surg 2009;9:571-575). Существующие консервативные и хирургические способы лечения характеризуются длительностью и малой эффективностью. Операции, выполняемые для закрытия БС, отличаются травматичностью, сопряжены с высоким риском фатальных осложнений, высокой частотой повторной несостоятельности культи бронха и летальностью, достигающей 71% (Cardillo G, Carbone L, Carleo F et al. The rationale for treatment of postresectional bronchopleural fistula: analysis of 52 patients. Ann Thorac Surg 2015;100:251-257).
В настоящее время распространены малоинвазивные эндобронхиальные и торакоскопические вмешательства (Lois М, Noppen М. Bronchopleural fistulas: an overview of the problem with special focus on endoscopic management. Chest. 2005;128:3955-65). Эти методы подходят для пациентов, имеющих небольшие размеры БС (менее 0,5 см в диаметре) и/или высокие хирургические риски. Для закрытия БС применяются различные материалы, например: клеи на основе цианокрилатов, на основе соединений фибрина; рассасывающиеся желатиновые губки; химическое прижигание (этанолом, трихлоруксусной кислотой, тетрациклином и нитратом серебра); эмболизация сосудов, субмукозные инъекции полидоканола.
Аналогом данной заявки является способ бронхоскопического лечения трахеомедиастинальных свищей с использованием аутологичных мезенхимальных стромальных клеток (МСК) из жировой ткани (Diaz-Agero Alvarez Р, Garcia-Arranz М, Georgiev-Hristov Т, Garcia-Olmo D. A new bronchoscopic treatment of tracheomediastinal fistula using autologous adipose-derived stem cells. Thorax 2008; 63:374-376). Способ включает в себя выделение МСК из аутолипоаспирата по стандартному протоколу в конечной концентрации клеток 9,8×106 в дозе. Половину клеток ресуспендировали в растворе тромбинового компонента фибринового клея до объединения с раствором тиссукола. МСК-содержащий фибриновый клей вводили в полость свища через бронхоскоп. Контрольную бронхоскопию проводили первые 3 месяца после операции, а затем каждые 3 месяца. Цитологические исследование мазков, взятых при браш-биопсии, проводили после каждой бронхоскопии. Полное закрытие свища наблюдалось через 3 месяца.
Основными недостатками данного способа являются: использование аутологичных МСК, что увеличивает риск трансформации клеток в опухолевые у пациентов с онкопатологией; также способ предусматривает однократное введение МСК, что может быть недостаточным для заживления свищей размером более 5 мм.
За ближайший аналог выбран способ применения клеточных технологий в торакальной хирургии (Егоров В.И., Ионов П.М., Юркевич Ю.В. Первый опыт применения клеточных технологий в торакальной хирургии. Вестник Северо-Западного медицинского университета им. И.И. Мечникова, 2015; Т. 7, №2:7-13), заключающийся в том, что пациентам на 7-10 день после развития несостоятельности культи бронха (диаметры дефектов культи бронха не превышали 5 мм) вследствие резекционной операции через бронхоскоп инъекционно вводили суспензию аллогенных фибробластов человека в подслизистый слой культи бронха в зону свища. Использовались фибробласты, удовлетворяющие критериям контроля качества и помещенные на длительное криохранение с последующим субкультивированием до достижения конфлюентности 80% в среде альфа-MEM с добавлением 20% фетальной бычьей сыворотки. Зону свища обкалывали в 2-5 точках, общим объемом 1,5 мл и в конечной концентрации клеток 3×106/мл.
Основные недостатки данного способа:
1) лечение применяется при малых размерах свищей, не более 5 мм;
2) позднее начало применения методики на 7-10 день после развития несостоятельности культи бронха и однократное введение фибробластов;
3) отсутствие факторов роста и стимуляции фибробластов;
4) применение дополнительных манипуляций с фибробластами - субкультивирование после разморозки;
5) использование ксеногенной фетальной бычьей сыворотки в качестве добавки к питательной среде альфа-МЕМ;
6) отсутствие цитологического и гистологического контроля.
Задачами данного предложения являются:
1) повышение эффективности лечения бронхиальных свищей, возникших после резекционных операций на легких;
2) сокращение сроков заживления бронхиальных свищей размером более 5 мм;
3) снижение риска развития рецидива бронхиальных свищей;
4) упрощение способа и сокращение времени подготовки дермальных аллофибробластов к инъекционному введению;
5) сокращение материальных затрат;
6) совершенствование контроля эффективности лечения путем проведения цитологического и гистологического исследования.
Поставленные задачи достигаются тем, что в послеоперационном периоде после выявления методом фибробронхоскопии бронхиального свища размером более 5 мм, размораживают дермальные аллофибробласты и ресуспендируют в 2 мл 0,9% физиологического раствора NaCl до конечной концентрации клеток 2,0×106 в дозе, и одновременно выполняют температурный лизис обогащенной тромбоцитами аутологичной плазмы с исходным содержанием в ней тромбоцитов 1,85×109/л для получения 2 мл аутологичного лизата тромбоцитов,
затем полученные компоненты смешивают в шприце, подсоединяют шприц к эндоскопическому инъектору и производят 4-6 инъекций по периметру свища в подслизистый слой, отступив 1-2 мм от края свища на глубину 1 мм на одинаковом расстоянии друг от друга, с повторением вышеописанной процедуры на 3-й и 5-й дни лечения с последующим цитологическим и гистологическим контролем результатов лечения.
Технический результат способа лечения бронхиальных свищей, возникших после резекционных операций на легких, заключается в том, что введение двух компонентов: дермальных аллофибробластов, ресуспендированных в 2 мл 0,9% физиологического раствора NaCl в концентрации клеток 2,0×106 в дозе, и аутологичного лизата тромбоцитов объемом 2 мл, по периметру свища в подслизистый слой отступив 1-2 мм от края свища на глубину 1 мм на одинаковом расстоянии друг от друга позволяет устранить послеоперационные дефекты бронхов размером более 5 мм, сократить время заживления свищей на 29% по сравнению с известными аналогами, что позволяет улучшить качество жизни пациентов. Это достигается за счет раннего начала терапии и неоднократного введения дермальных аллофибробластов, а так же повышения их активности за счет аутологичного лизата тромбоцитов. Способ является недорогим и простым в исполнении, кроме того предусматривает качественную оценку и контроль формирования рубцовой ткани с помощью цитологических и гистологических исследований.
Способ осуществляется следующим образом.
После выявления БС в послеоперационном периоде и принятия решения о малоинвазивном лечении выполняют одновременно подготовку двух компонентов к использованию. Для приготовления первого компонента производят забор периферической крови с гепарином из расчета 2 Ед/мл объемом 50 мл, из которой сначала готовят обогащенную тромбоцитами плазму с исходным содержанием в ней тромбоцитов 1,85×109/мл методом двойного центрифугирования, а затем из обогащенной тромбоцитами плазмы готовят аутологичный лизат тромбоцитов методом двойного замораживания
при t -80°C и быстрого размораживания при t +37°С для лизиса тромбоцитов с последующим центрифугированием при 3000 об/мин 15 мин для осаждения фрагментов тромбоцитов. Потом супернатант, представляющий собой аутологичный лизат тромбоцитов, аликвотируют в три криопробирки по 2 мл, и помещают на хранение при t -80°С до использования. Одну криопробирку размораживают и используют в день введения.
Параллельно с первым компонентом готовят второй компонент. Из криобанка достают криопробирку с дермальными аллофибробластами объемом 2 мл, которые предварительно перед хранением были получены методом культивирования: дермальные аллофибробласты культивируют в культуральных флаконах на питательной среде, состоящей из раствора ДМЕМ / 10% карантинизированной донорской плазмы АВ группы / 100 ед/мл антибиотика-антимикотика, до плотности монослоя 80-90%, затем обрабатывают трипсин-версеном для открепления клеток от дна флакона и отмывают фосфатно-солевым буфером, замораживают с бессывороточным криопротектором. Перед хранением в криобанке проводят контроль качества, включающий вирусный и бактериологический контроль, цитогенетическое исследование на отсутствие генетических аберраций и иммуноцитохимическое исследование на онкогенность культуры дермальных аллофибробластов по экспрессии белка р53. Дермальные аллофибробласты размораживают стандартным методом и ресуспендируют в 0,9% физиологическом растворе NaCl в объеме 2 мл и конечной концентрации клеток 2×106 в дозе.
Перед введением оба компонента смешивают в шприце объемом 5 мл, который подсоединяют к эндоскопическому инъектору, и производят 4-6 инъекций по периметру свища в подслизистый слой отступив 1 -2 мм от края свища на глубину 1 мм на одинаковом расстоянии друг от друга. Процедура введения проводится трехкратно на 1-й, 3-й и 5-й день лечения под местной анестезией через канал бронхоскопа диаметром 2-2,5 мм с помощью бронхоскопического инъектора диаметром 1,8 мм.
Контроль результата проведенного лечения осуществляют методом фибробронхоскопии, цитологическими и гистологическими исследованиями через 1, 3 и 6 месяцев.
По данному способу в клинических условиях ГБУЗ «Научно-исследовательский институт - Краевая клиническая больница №1 имени профессора С.В. Очаповского» министерства здравоохранения Краснодарского края пролечено 11 человек, в возрасте 48-75 лет с патологией: 1) свищ главного бронха - 6 человек; 2) свищ долевого бронха - 4 человека и 3) дефект анастомоза - 1 человек, большинство из которых (90% пациентов) оперированы по поводу рака легкого. Выздоровление наблюдалось у 100% пациентов.
Примеры дополнительно продемонстрированы на фотографиях, смотри приложение, где 1 - свищ правого бронха, 2 - полное закрытия свища бронха на 5-й день, 3 - морфологическая картина культи бронха в зоне закрытия свища, 4 - свищ культи нижнедолевого бронха справа, 5 - полное закрытия свища культи нижнедолевого бронха справа.
Пример 1. Больной С., 59 л. поступил в отделение торакальной хирургии с диагнозом: центральный с-r правого легкого, T2aN1Mx, у/д плоскоклеточный, состояние после пневмонэктомии справа, лимфодиссекции кл. гр. IV. Свищ культи правого главного бронха. Эмпиема постпневмонэктомической полости.
В плановом порядке ему была проведена пневмонэктомия справа, лимфодиссекция по поводу центрального с-r правого легкого T2aN1MxR0. В послеоперационном периоде у пациента на 12-е сутки по данным фибробронхоскопии была выявлена полная несостоятельность культи правого бронха, размер свища 9 мм (фото 1). В этот же день у пациента была забрана периферическая кровь с гепарином (100 Ед) объемом 50 мл и передана в лабораторию для приготовления аутологичного лизата тромбоцитов. На первом этапе была приготовлена обогащенная тромбоцитами плазма методом двойного центрифугирования с исходным содержанием в ней тромбоцитов 1,85×109/мл. Затем обогащенную тромбоцитами плазму двукратно замораживали при t -80°С и размораживали t +37°С, центрифугировали при 3000 об/мин 15 мин для осаждения фрагментов тромбоцитов. Полученный аутологичный лизат
тромбоцитов в количестве 6 мл был аликвотирован в криовиалы по 2 мл и заморожен при t -80°C. За 2 часа до манипуляции дермальные аллофибробласты были разморожены по стандартной методике и ресупендированы в 2 мл физиологического раствора в конечной концентрации клеток 2×106 в дозе. Криопробирка с аутологичным лизатом тромбоцитов была разморожена в водяной бане при t +37°С. Пробирка с аутологичным лизатом тромбоцитов и пробирка с клеточной взвесью в стерильных упаковках были доставлены в кабинет для проведения фибробронхоскопии. Непосредственно перед введением оба компонента смешивали в шприце объемом 5 мл, который подсоединяли к инъектору. Под местной анестезией был введен бронхоскоп BF-XT-40 №468, осмотрено и санировано бронхиальное дерево. Взяты посевы и биопсия зоны культи. Через бронхоскоп был введен инъектор, через который введена смесь, состоящая из взвеси дермальных аллофибробластов и раствора аутологичного лизата тромбоцитов, в подслизистый слой на глубину 1 мм по периметру свища в 6 точек на расстоянии 1-2 мм от края свища на одинаковом расстоянии друг от друга. Данную процедуру введения пациенту повторяли на 3-й и 5-й день. На 5-й день было отмечено полное закрытие свища бронха (фото 2). Пациент был выписан по месту жительства в удовлетворительном состоянии. Через 1, 3 и 6 месяцев контрольная фибробронхоскопии выявила сохранную культю правого главного бронха, отсутствие свища, что подтверждалось цитологическим и гистологическим контролем (фото 3).
Пример 2. Больной К., 72 лет, поступил в отделение торакальной хирургии с диагнозом: периферический с-r нижней доли правого легкого pT2aN2M0, состояние после нижней лобэктомии справа, II кл. гр. В плановом порядке ему была проведена нижняя лобэктомия справа. В удовлетворительном состоянии пациент был выписан по месту жительства.
Через 1,5 месяца после выписки при контрольной фибробронхоскопии был диагностирован свищ культи нижнедолевого бронха справа размером 7 мм (фото 4). В этот же день была забрана периферическая кровь в объеме 50 мл и приготовлен аутологичный лизат тромбоцитов в количестве 6 мл, аликвотирован по 2 мл и заморожен в криопробирках. В день каждой инъекции размораживали по одной пробирке с аутологичным лизатом тромбоцитов
объемом 2 мл и клеточной взвеси дермальных аллофибробластов объемом 2 мл. Размороженные дермальные аллофибробласты ресуспендировали в физиологическом растворе в объеме 2 мл и с концентрацией клеток 2×106 в дозе. Полученная суспензия клеток и аутологичный лизат тромбоцитов в стерильной упаковке были доставлены в кабинет для проведения бронхоскопии. Перед введением оба компонента смешивали в шприце, который подсоединяли к инъектору. Через бронхоскоп BF-1T-60 №052 под местной анестезией, после санации была введена смесь из суспензии клеток и аутологичного лизата тромбоцитов в общем объеме 4 мл в подслизистый слой на глубину 1 мм по периметру свища в 4 точки на расстоянии 1-2 мм от края свища на одинаковом расстоянии друг от друга. Всего было проведено 3 бронхоскопии с введением суспензии дермальных аллофибробластов и аутологичного лизата тромбоцитов: на 1-й, 3-й, 5-й день. Контрольная фибробронхоскопия на 21-й день показала отсутствие признаков осложнений со стороны культи нижнего долевого бронха, свищ не выявлен (фото 5). Пациент был выписан по месту жительства в удовлетворительном состоянии. Через 3 и 6 месяцев контрольная фибробронхоскопии выявила сохранную культю правого главного бронха, отсутствие свища, что подтверждалось цитологическим и гистологическим контролем.
Способ лечения бронхиальных свищей, возникших после резекционных операций на легких, включающий инъекционное введение культуры дермальных аллофибробластов, отличающийся тем, что в послеоперационном периоде после выявления методом фибробронхоскопии бронхиального свища размером более 5 мм размораживают дермальные аллофибробласты и ресуспендируют в 2 мл 0,9%-ного физиологического раствора NaCl до конечной концентрации клеток 2,0×106 в дозе и одновременно выполняют температурный лизис обогащенной тромбоцитами аутологичной плазмы с исходным содержанием в ней тромбоцитов 1,85×109/л для получения 2 мл аутологичного лизата тромбоцитов, затем полученные компоненты смешивают в шприце, подсоединяют шприц к эндоскопическому инъектору и производят 4-6 инъекций по периметру свища в подслизистый слой, отступив 1-2 мм от края свища на глубину 1 мм на одинаковом расстоянии друг от друга, с повторением вышеописанной процедуры на 3-й и 5-й дни лечения с последующим цитологическим и гистологическим контролем результатов лечения.