Способ получения -аминокислот

 

патам.„с. н о иe e,. ь1 г „

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

«»784761

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (51) М. Н,. (22) Заявлено 12. 05. 76 (21) 2356810/23-04 (23) Приоритет — (32) 12.05.75 (31), 2 3 2 0 2-А/7 5 (33) Италия

Опубликовано 3011.80.Бюллетень Но 44

Дата опубликования описания 013.2,80

С 07 С 101/00

t осударствеиный комитет

СССР ио делам изобретений и открытий (53) УДК 547. 466. .07(088.8) Иностранцы

Франческо Чечере, Джулиано Гилли„ Джино Делла Пенна и Бруно Раппуоли (Италия) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Снампрогетти С. и. А" (Италия) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 0-АМИНОКИСЛОТ, eo — зн

CH

Х

% — СО

Изобретение относится к новому способу получения D-аминокислот, используемых в качестве промежуточных продуктов в синтезе биохимических препаратов.

Химические способы, известные до настоящего времени для разделения оптических антиподов или энантиомеров, основаны на использовании камфосульфокислоты.

Известен способ получения R-аминокислот, заключающийся в гидролиэе эамещенного гидантоина в присутствии дигидропиримидиназы при рН 6-11 до 15

R-карбамиламинокислоты с последующим ее гидролизом в водной среде при кипячении до соответствующей R-аминокислоты (11.

Известен также наиболее близкий 20 по технической сущности к предлагаемому способ получения 0-аминокислот путем ферментативного расщепления рацематов на оптические антиподы в буферном растворе при 35 С 12). 25

Недостатком этого способа является его многостадийность, эаключакхцаяся в необходимости предварительного получения рацематов аминокислот и последующего их расщепления. 30

Цель изобретения — упрощение процесса.

Поставленная цель достигается тем, что гидантоины формулы где Х вЂ” ОН, Н или С113, подвергают ферментативному гидролизу гидропиримидингидролазой иэ телячей печени при рН 8-9 и полученную карбамиламинокислоту гидролизуют при кипячении, предпочтительно процесс проводят при 10-70 С.

Требуемое значение рН поддерживают добавлением по мере протекания реакции щелочи.

Пример 1. 176 г (1 моль)

0L-5-фенилгидантоина размешивают в

7,5 л 0,1 М раствора вуфера фосфата калия при рН 8,5 и 30 С.

К суспензии добавляют 125 мл раствора гидропиримидингидролаэы из печени (общая активность 1875 мкмоль/мин при 30 С, рН 8,5, протеины — 2,75 r).

Через 6 ч для поддержания постоянного рН добавляют 250 мл 4М NaOH, при этом реакция прекращается и затем

784761 смесь охлаждают до 4ОС и доводят рН до 5,5 путем добавления 6 н HCk., В процессе операции образуется слизистый осадок денатурированных протеинов, который отделяют центрифугированием.

Плавающий слой снова охлаждают до 4 С и доводят РН до 2,5 путем доо бавления 6 í. HCR. В процессе операции происходит осаждение кристаллов, которые промывают примерно 1 л хо подной воды и высушивают до постоянНого веса. Продукт перекристаллизовывают из ..леси этанол — вода 70 30 (по объему) при нагревании.

Процукт (189 г, выход 97Ъ) хроматографически гомогенный, а на основании анализа ИК-, ЯМР-масс-спектра, а также элементарного анализа было установлено, что он представляет собой полученный D-й-карбамилфенилглицин (189 r, выход 97Ъ),хроматографически однороден.

Удельная оптическая способность вращения (k j = 137 (c = 1Ъ в

МН4ОН, 1 н) .

Пример 2. В реактор, снабжен-25 ный термостатическим кожухом с входом для азота, электродом рН-метра и вводом для добавления соды, добавляли 10 л 0,1 N раствора фосфатного буфера, который содержит гидропири- ЗО мидингидролазу из печени (общая активность 7500 мкмоль/мин, протеины

11 r). После барботирования азота о в течение 30 мин в раствор при 30 С добавляют 192 г (1 моль) DL-5-и гид- З5 роксифенилгидантоина при поддержании постоянного рН путем добавления

4 М NaOH.

Через 20 ч после израсходования соды в количестве 250 мл проводят отделение О(-) -Й-карбамил-и-оксифенилглицина по методике примера 1.

Полученный продукт перекристаллизовывают из смеси этанол (н-гексан).

Получают 152 г (выход 72Ъ) продукта со следующими свойствами: т.пл. 4$

170 С;(с(3 = -170О(c = О 5Ъ в воде).

Пример 3. 206 г (1 моль)

DL 5-и-метоксифенилгидрантоина перемешивают в 10 л 0,1 М буфера фосфата калия при рН 8,5 и 30 С, содержащем $g гидропиримидингидролазу из печени (обща:т активность 7500 мкмоль/мин, протеины — 11 г).

Постоянное значение рН поддерживают путем добавления 4 М ИаОН.

Через 20 ч после израсходования

250 мл соды, реакцию прекращают и восстанавливают О(-)-N-карбамил-и-метоксифенилглицин по методике примера 1 с выходом 90Ъ.

Пример 4. 230 мл раствора 60 гидропиримидингицролазы из печени с активностью 10800 мкмоль/мин и

3,45 г протеинов добавляют к 2,1 кг раствора 150 r триацетата целлюлозы в метилен..лориде и тщательно пере- . 65 мешивают. Получают эмульсию, которую центрифугируют.

Полученное волокно (300 г) вводят в виде мотка в стеклянную колонку с кожухом (диаметр 8 см, высота 60 см) и закрепляют оба конца двумя скобами из нержавеющей стали. Волокно промывают рециркулированием 4 л 0,.1 М буфера фосфата калия (рН 8,5) до исчезновения энзиматической активности в растворе (4 промывания, всего в течение 6 ч), Колонку с волокном затем помещают в контур, содержащий перистальтический насос для рециркулирования реакционной смеси, при этом сосуд с двойными стенками должен иметь электрод для постоянной проверки рН и ввод для добавления 4 М NaOH, действующий при постоянном рН. В систему вводят

5 л 0,02 М буфера фосфата калия при рН 8,5 и 176 г (1 моль) DL-5-фенилгидантоина и насос включают для рециркулирования реакционной смеси.

Через 6 ч после добавления 4 М йаОН в количестве 250 мл реакцию прекращают. Реакционную смесь выгружают. Волокно промывают 4 л воды. Смесь воды и волокна концентрируют в вакууме до 3 л, охлаждают до 2 С и обрабатывают 6 н. НС E до рН 2,5. Через

30 мин вываривания собирают осадок на фильтре и сушат до постоянного веса.

Полученный продукт 180 г (93Ъ-ный выход) является Э-(-)-й-карбамилфенилглиценом (т.пл. 200 С,(.о.3>=

-135 (с = 1Ъ в 1 н. МН. ОН) .

Пример 5. Поступают аналогично примеру 4 с получением D (-)-N-карбамил-и-оксифенилглицина из

DL-5-п-оксифенилгидантоина, но двойной сосуд закрыт и добавлен ввод для азота.

Из 192 г (1 моль) 0L-5-оксифенилгидантоина через 60 ч получают как описано выше 160 г (выход 76Ъ) D-(-)-й-карбамил-и-оксифенилглицина (т.пл.

200 С,.(с(.3 0 = -175 (с = 0,6Ъ в спирте — воде 50:50 об/об).

Пример 6. Поступают аналогично примеру 4.

Из 206 г (1 моль) DL-5-и-метоксифенилгидантоина получают 200 r (выход 89Ъ) О(-)-М-карбамил-и-метоксифенилглицина.

Пример 7. 194 г (1 моль)

0{-)-N-карбамилфенилглицина, полученного по примеру 4, смешивают с 5 л воды. Суспензию доводят до рН 4 при помощи насыщенного раствора Na .

Суспензию кипятят в течение 8 ч.

Затем горячии раствор отделяют от смолы, подвергают концентрации в вакууме до 1 л, охлаждают и обрабатывают 6 н. НС В до рН 2. Полученный продукт собирают на фильтре, промывают водой и сушат в вакууме до постоянного веса.

784761

Составитель А. Анисимов

Редактор T. Никольская Тех д М. Петко .Корректор С. Шекмар

Подписное

Заказ 8593/66 Тираж 495

BHHHHH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб. филиал ПНП Пдте т", г. ужгород, ул. Проектная, 4

Таким образом, получают 88 г (0,045 моль ) 0(-)-N-карбамилфенилглицинаГЫ1 = -136,9 . Из маточника с рН 6 и концентрированного в вакууме получают 70 r (0,46 моль) О(-)-фенилглицина. fd Jg= -154 (с = 1% в 1 н °

НС f).

Пример 8. Аналогично примеру 7, но при проведении реакции в атмосфере азота, из 210 г (1 моль)

О(-)-N-карбамил-п-оксифенилглицина через 9 ч кипения получают 67 r lO (40% выход) О(-)=и-гидроксифенилглицина (Ы31у -154 (с = 0,5% в 1 н. НС () .

Формула изобретения

1. Способ получения 0-аминокислот, отличающийся тем, 1э что, с целью упрощения процесса, соединейие формулы где Х - ОН, Н или СН>, подвергают ферментативному гидролизу гидропирнмидингидролазой из телячей печени при рН 8-9 и получейную карбамиламинокислоту гидролизуют при кипячении.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что процесс проводят при 10-70 С.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент СССР по заявке

Р 2025314/23-04, кл. С 07 С 101/04, 08.05.74.

2. Патент Японии Р 7015433, кл. 36 Ь 25, 29.05.70. С. A., 73, 65041 (прототип).