@ (11 @ ,17 @ )-11,17-дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21- ил @ тио @ уксусная кислота как промежуточный продукт в синтезе биоспецифического сорбента и способ ее получения (его варианты)

 

1.. C

СОЮЭ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТ 4ЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) O(), 4(5!) С 07 J 31/00 В 01 9 15 08

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И О-ГКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ : :"::а, Н AB TOPCROMV CBNQETEAbCTB Y (54) Я(11 f3, 17 oc )-11, 17-ДИГИДРОКСИ-3,20-ДИОКСОПРЕГН-4-ЕН-21--ИЛ3 ТИО

УКСУСНАЯ КИСЛОТА КАК ПРОИЮКУТОЧНЫИ

ПРОДУКТ В СИНТЕЗЕ БИОСПЕЦИФИЧЕСКОГО

СОРБЕНТА И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ (ЕГО

ВАРИАНТЫ). (57) 1.. (((1111, 17of)-11,17-дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21-ил тиоД уксусная кислота формулы -s-сн - соон

С=О

-OH

2. Способ получения ((11, 17,)-11, 17-дигидрокси-3,20-диоксопрегн—.4-ен-21-ихтио уксусной кислоты, заключающийся в том, что 21-производное кортизола Формулы х

С=О

° ОН где Х вЂ” -0$0 СН, -ОЯО С Н СН, -С1, -Br

У повергают взаимодействию с динатриевым производным тиогликолевой кисло(21) 3626597/23-04 .(22) 22.07 83 (46) 15.06.85. Бюл. Ф 22 (72)-А.А.Ахрем, О.В.Гулякевич, А.Л.Михальчук, В.Н.Пшеничный, Я.И.Сурвило и В.А.Хрипач (71) Институт биоорганической химии АН БССР (53) 547.689.6(088.8) (56) 1.:81щопз S.S. Pons M., Johnson D.J. of, -Кего mesylate: а reactiv thiol- specific functional фгoup. — "The Journal of Îrganic Chemistry" >:45 (15),1980,3082-3088.

2. Chan D.M . Sharma И., Slaunwhite M.R. The Chemistry of

Human Transcortin Improved аГЯЫгу

Майr ices for the . Pur i f icat ion of

Тгапзсоггiп., -"АгсЬ чез of Biochemistry end Biophysics", 182, 1977, 197-202.

3. Rosner М., ВгасНоч К.L. Isolation and Purification of corticosthroid binding globulin from

human plasma Ъу affinity chromatography. — "Method in Enzymology", New York, Academic Press, 36, 1975, 104-109.

4. Gaillard F., Han K.Ê., Dautrevaux M, Caracterization et

properties physico-chimiques de la

transcortine humaine. — "Biochemistry", 57 (5), 1975, 559-568.

5. Ахрем А.А., Кукушкина И.И., Свиридов О.В., Стрельченок О.А., Сурвило Л.И., Чащин В.А. Выделение транскортина из сыворотки ретроплацентарной крови методом аффинной хроматографии. — "Известия АН БССР", Сер. хим., 6, 1977, 111-113. как промежуточный продукт в синтезе С биоспецифического сорбента.

1161512

<х с-о он ты в смеси ацетона и низшего алифатического спирта с последующим выделением целевого продукта подкислением реакционной массы и высаживанием водой.

3. Способ получения((11(3, 17<6)-11,17-дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21-ил1 тио) уксусной кислоты, заключающийся в том, что 21-галоидпроизводное кортизола формулы

Изобретение относится к органической химии,. конкретно к синтезу аффинного биоспецифического сорбента для выделения транспортных белков крови.

Близким по структуре к предлагаемому соединению является метиловый эфир ((3,20-диоксопрегн-4-ен-.21-ил)тио) уксусной кислоты (1)

Однако использование его как. производного аффинанта невозможно в силу того, что аминолиз сложноэфирной связи с образованием амида протекает в присутствии (5-15)кратного избытка амина, необходимого как для создания рН среды от

10 до 12, так и для конкуренции с реакцией переэтерификации. Тем.не менее, количество концевых аминогрупп, являющихся действующим началом в данном процессе, на модифицированной поверхности полисахарида в тысячи раз меньше количества гидроксильных групп. Искусственное поддержание рН среды введением основания ведет к предпочтительности реакций переэтерификации или омыления, что нежелательно.

Известным полупродуктом в синтезе используемых в настоящее время биоспецифических аффинных сорбентов является 21-гемисукцинат кортизола (2) .

Однако использование последнего в качестве аффинанта неудовлетворительно в силу легко протекающего как химического (устойчив в пределах рН 5-7), так и биохимического где Х - -Cl -Br, подвергают взаимодействию в среде низшего амида или смеси низших амидов с тиогликолевой кислотой о при 60-90 С с последующим выделением целевого продукта высаживанием водой.

2 (требует дезактивации или удаления эстеразных ферментов) расщепления сложноэфирной связи (3) и f4) .

Известен способ получения ряда

21-сульфидных производных прогестерона и дексаметазона (1), заключающийся в обработке 21-хлорида

;или мезилата дезоксикортикостеро на (10-15}-эквивалентными избытка- щ ми метилового эфира тиогликолевой кислоты и триэтиламина в среде о ацетона при 0 С, Одним из существенных недостатков известного способа является использование больших избытков как осS нования, так и тиола, что вызывает трансформацию стероидного скелета (в приложении способа к кортикостероидам, обладающим 17ос, 21-дигидроксиацетоновой группировкой) и усложняет выделение целевого продукта, который необходимо подвергать хроматографической очистке. Кроме того, по известному способу может быть получен только метиловый эфир(11/3, 17ж)-11,17-дигидрокси-3,20-диоксопрегн-.4-ен-21-ил)тио) уксусной кислоты, который непригоден для получения аффинного сорбента, так как недостаточно специфичен и избирателен.

Цель изобретения — (((11/3, 17с )-11,l7-дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21-Hsi)vnoj уксусная кислота как промежуточный продукт в синтезе биоспецифической матрицы и способы ее получения.! Поставленная цель достигается соединением — l((11P, 17<)-11, 17-ди

1161512

Г-S-СН-СООН

С=О

° ОН (Т) 10

ОН

3 гидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21-Hn)тио) уксусной кислотой формулы которая является полупродуктом в синтезе новой биоспецифической матрицы формулы

gS-CHgC0NH (CHg)ggHCHgCH(ОНЖИ2-О-P

0 где P -, остаток сефарозы 4В., применяемой для выделения транспортных белков крови. Синтез матрицы проI водят по следующей схеме: гель модифицированной сефарозы, полученный последовательной обработкой сефарозы эпихлоргидрином и гексаметилендиамином в присутствии гидроокиси нат-. рия, подвергают взаимодействию в водно-диоксановой среде с ангидридом ((11 3, 17е6)-11, 17-дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21-ил)тио) уксусной кислоты с последующей отмывкой

:водным диоксаном, раствором бикарбо35 ната натрия и дистиллированнои водои.

Полученная таким образом биоспецифическая матрица (II) показала

;при сравнении с используемой в нас40 тоящее время матрицей Я формулы

5-СН СОМН(СН2)dHHCHgCH(OH)CH -0-P

«О

° ° ОН,где P - остаток сефарозы 4В, что при взаимодействии с сывороткой 50 крови потеря активной части матрицы составляет в среднем 20Х в случае использования как аффинанта 21-гемисукцоната кортизола и только около 1Х в случае (((11, 17с6)-11ь17 .55

-дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21-HsigTHo) уксусной кислоты за каждую экспозицию.

CE (11P, 17д )-11, 17-Дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21-ил тио) уксусная кислота при сравнении с

21-гемисукцинатом кортизола и кортизолом имеет следующее сродство к сывороточному транскортину, Х:

Кортизол 100

21-Гемисукцинат кортизола 63,6 ((Кортизол-21-ил)тио) уксусная кислота 81,8 т.е. не уступает кортизолу и превосходит используемый в качестве аффинанта 21-гемисукцинат кортизола.

LE(»P, 17Ы)-11,17-Дигидрокси-3, 20-диоксопрегн-4-ен-21-ил) тио) уксусную кислоту получают двумя способами.

Вариант А. Раствор 21-X-производного кортизола (где Х вЂ” OSO СН,, -0$О С Н СН, -Cl, -Br) обрабатывают раствором динатриевого производного тиогликолевой кислоты. Затем реакционную смесь подкисляют до рН 4-5, разрушая образующуюся натриевую соль кислоты, удаляют 1/2-"

2/3 растворителя и высаждают целевой продукт водой. Обработка маточника дает дополнительное количество целевого продукта. Суммарный выход достигает 90-95Х от теоретического.

Предпочтительно осуществление процесса в атмосфере инертного газа.

Предлагаемый способ позволяет осуществлять процесс в условиях контролируемого основного катализа . и представляет возможность введения полифункциональных (в частйости бифункционального) заместителей избирательным присоединением последних через простую сульфидную связь.

Вариант Б: 21-Галоидпроизводное кортизола в среде низшего амида или смеси низших амидов подвергают взаимодействию с тиогликолевой кислотой при 60-90 С в течение 1,5-4,5 ч.

За ходом реакции следят хроматографически. Целевой продукт выделяют последовательным высаждением спиртом — водой. Выход достигает 84-89Х.

Предпочтительно осуществление процесса в атмосфере инертного газа.

Способ позволяет осуществлять процесс в нейтральной среде (отсутствие оснований), что очень сущест- венно в приложении его к кортикосте1161512 роидам, обладающим 17,21-дигидроксиацетоновой группировкой. Выделяющийся в процессе галоидводород связы- . вается Н-незамещенным амидом, позволяя поддерживать рН среды, равное 6 5-7,0.

Отличительными особенностями предлагаемого способа является использование динатриевого производного тиогликолевой кислоты, которое избирательно .взаимодействует с 21- мезилатом, тозилатом, хлоридом ипи бромицом кортизола. Целевым продуктом в этом случае является кортизол-21-ил-21--тиоуксусная кислота, которая не может быть получена по известному спосрбу.

Hp и м е р 1. Получение jf(11), 17 а)-11,17-дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21-HajvHo) уксусной кислоты (способ А), К раствору 1,292 г (2,5 ммоль)

Ф

21-Й-толуолсульфоната кортизола в

30 мл ацетона в токе аргона прибавляют свежеприготовленный раствор динатриевого производного тиогликолевой кислоты, полученный из

0,188 мл (2,7 ммоль) тиогликолевой кислоты в 8 мл спирта и 4,15 мл спиртового этилата натрия, содержа щего 0,0013 г-атом активного натрия в 1 мл раствора. 3а ходом реакции следят хроматографически (окись алюминия, хлороформ:метанол:вода—

188:12:1, 1 ) и по изменению рН среды. По окончании реакции реакционную смесь подкисляют до рН 4-5, прибавляя 10Х-ный раствор соляной кислоты, упаривают при пониженном о давлении при 20-30 С до 15-20 мл и прибавляют в течение 0,5-1 ч

100-120 мл воды, Выделившуюся

t.t. (11(, 17с )-11,17-дигидроксивЂ, 3,20-диоксопрегн-4-ен-21-ил1тио) уксусную кислоту отфильтровывают, промывают на фильтре водой, сушат в вакуум-эксикаторе над ангидроном.

Получают 1,00 r кислоты с Тд„ 182185 С. Иаточник упаривают на 1/5 объема и оставляют на холоду на ночь, получая дополнительно 0,108 г кислоты с Т и„ 182-185 С. Общий выход составляет 1 108 г 21-S-уксус) ной кислоты кортизола в виде кристаллогидрата с 1 моль воды или

97,57Х от теоретического в пересчете на 21-S-уксусную кислоту кортизола. Кристаллизация из хлороформа дает аналитический образец с

Тп, 184,5-185,5 С.

Найдено, Х.: С 63,27; Н 7,38;

S 7,33.

С 1Нц06 Б

Вычислено, %: С 63,27 Н 7,39;

S 7,34.

ИК-спектр (3 см ) 3540-3530, 3300-2500; 1725; 1645,,1610, 1275;

1125 (KBr).

УФ-спектр (а С НЕОН, нм) 243 (8 16034,(e) о + 142о (спирт, tXный раствор).

ПИР-спектр (CgC1 ) о : 0,81, синглет, ЗН, 1,48, синглет, ЗН, 2,76, мультиплет, 1Н; 3,32, дублет, 2,85 Гц, 2Н; 3,60, дублет, j 17 13 Гц, 1Н; 3,97, дублет, 17,13 Гц, 1Н; 4,41, мультиплет, 1Н, 4,63, синглет, 2Н, 5,68, синглет, 1Н.

Пример 2. Получение (11, 17<)-11,17-дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21-ил1тио) уксусной кислоты (способ Б).

Продуваемую аргоном смесь

1,028 r (2,7 ммоль) 21-хлорида кортизола, 0,5 мл (5,4 ммоль) тиогликолевой кислоты, 0,42 мл (5,4 ммоль) N,N-диметилформамида (ДИФА) и 0,160 r (2,7 ммоль) аце- . тамида (AA) нагревают при 80-90 С в течение 3,5 ч. 3а ходом реакции следят хроматографически (силуфол, этилацетат, УФ-облучение). Затем реакционную смесь охлаждают, разбавляют,10 мл спирта, прибавляют в течение 0 5-2 ч 100 мл воды и

S о оставляют на холоду (0-5 С) на

18-20 ч. Выделившуюся (((11/3, 17об)-11,17-дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21-ил)тио) уксусную кислоту (кристаллогндрат 1 моль воды) собирают фильтрованием, промывают на фильтре водой, сушат в вакуум-эксикаторе над ангидроном.

Получают 1,044 г 21-S-уксусной кислоты кортизола в виде кристаллогидрата с 1 моль воды или 85,1Х-ом теоретического в пересчете на

21-S-уксусную кислоту кортизола с Т„„ 181-184 С. Кристаллизация частй продукта из зтилацетата дает образец с Т „ 183-185 С, по о всем характеристикам идентичный продукту, полученному в примере 1.

Другие примеры конкретного выполнения приведены в таблице.

1161512

Способ .получения биоспецифического сорбента.

Сефарозу 4В (100 мл) промывают на фильтре 1 л дистиллированной воды, переносят в круглодонную э колбу, содержащую 80 мл 1 N NaOH и прибавляют 10 мл эпихлоргидрина.

После двухчасового перемешивания при 30-40 С гель тщательно промывают на фильтре дистиллированной 10 водой и инкубируют 2 ч с раствором

12 г гексаметилендиамина в 100 мл

0,01 N NaOH. Образовавшуюся аминоалкилсефарозу промывают дистиллированной водой до отрицательной 15 . нингидринной реакции промывных вод. К 10 мл полученного водного геля аминоалкилсефарозы прибавляют при перемешивании в течение 1-1,5 ч

180-190 мл диоксана, избыток раст- 20 ворителя удаляют, доводя объем до 10 мл. Раствор 0,425 г (0,97ммоль)

$P (11/, 17м)-11,17-дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21-ил1тио1 уксусной кислоты и 0,204 r (0,99ммоль) 25 дициклогексилкарбодиимида в 15 мл диоксана перемешивают 2-24 ч при комнатной температуре, осадок отфильтровывают, фнльтрат прибавляют к полученной водно-диоксановой 30 суспензии аминоалкилсефарозу. Смесь упаривают при пониженном давлении

0 и температуры не выше 40 С до объема 10-15 мл.

После перемешивания в течение

18-24 ч гель отфильтровывают, промывают на фильтре 3.15 мл диоксана, содержащего 5Х воды, прибавляют

10 мл диоксана, содержащего 5Х воды, и затем при перемешивании в течение

1-1,5 ч прибавляют 180-190 мл воды.

Полученный водный гель отфильтровывают, промывают на фильтре последовательно 200-300 мл 1-2 -ным водным раствором NaHCOg и 400-500 мл дистиллированной воды. При необходимости матрицу можно привести в стандартный буфер либо сразу после приготовления, либо непосредственно перед использованием. Непрореагировавшую

lk (11/, 17М)-11,17-дигидрокси-3,20диоксопрегн-4-ен-21-ил) тио) уксусную кислоту можно использовать повторно без донолнительиой очистки.

Полученная таким образом биоспецифическая матрица содержит 3,08 мг (7,07 мкмоль) (((11/3, 17с6)-11,17дигидрокси-.3,20-диоксопрегн-4-ен-21-ил тио 1 уксусной кислоты на 1 мл уплотненного геля сорбента и имеет емкость 32Х от максимально возможной емкости модифицированной сефарозы.

Транскортин — транспортный белок крови человека является необходимым препаратом как для детального исследования белок-стероидного взаимодействия, так и для практического использования, например, в ранней диагностике нарушений гормонального баланса и обмена в организме. Однако возможности его получения ограничены, поскольку отсутствуют высокоэффективные биоспецифические матрицы. Предлагаемая в качестве промежуточного продукта в синтезе,-а соответственно, в качестве аффинанта в матрице (t(11P, 17о )-11, 17-дигидрокси-3,20-диоксопрегн-4-ен-21-mr)THof уксусная кислота- позволяет устранить основные недостатки используемых биоспецифических матриц: незначительные сроки использования (2-3 выделения); низкий коэффициент извлечения, обусловленный отщеплением аффннанта, дезактивирующего извлекаемый белок, устранение длительных операций, связанных с дезактивацией сывороточных. эстераз„ снижение материальных энергетических и финансовых затрат, так как способ отличается простотой и при этом используются доступные и относительно недорогие материалы и препараты и т.п. Срок службы биоспецифической матрицы при использовании предлагаемого производного кортизола по сравнению с известными матрицами повышается в 10-20 раз.

1П

I;

1; СС3

I . Зь

Щ

Щ

Р

CI3

30 о

I

C4 &

ФФ

М

О 03

t Ц

ClI

1. е

СЧ

00 ю

CO

СЧ

00 00

I 1

СЧ

00 00

1 и о

I ю

С Ъ л ю

Ch л л л

СЛ л л

С"1

С3\

CV л л

00 00

I

1 ь

СЧ

00

Ю. СЧ

Ю

СЧ

CO н л. 3

3 о

03

1. ео л»

° ° ° °

Ж Ю о с

f».3 о ж

С0

&» Г

0I СЧ

° ° ° à и и

О СЧ

3 е

Ц о ж

aj ь о

0I СЧ

° ° ° °

30 О о н е

С 1

СО

4Ю

4 О с3

5 "

03 и

Ю O

CA a

СЧ

03

СЧ

О л

Ю ф

Ж о О ф л

Q t

Е 1 а

1 1 л \О л

° LQ о л

СЧ

СЧ л

СЧ

00 л С Ъ

I

I

3 О

СЧ

1

I

1

I

1

1 л

0 Ф

О533

g Р,34 е л

СГ) 1 Р

3 о

I IO Ж о е

v й

О Р

1 3 03

v m

I 161512

° ° м о ai

С0 f B к е о сС3 ф е °

Ю о о

00 » Ю

I 1 сО о о О О

И р и

С4 и

I 0Ц о (6

I g e

1 Р.O.

1.,О

I 1У Д

1 Ж

В о

-е и

K ID 03 1.

Ж

03

I, I

1 Е