Штамм бактерий bacillus liснеnifоrмis, используемый для контроля эффективности воздушной стерилизации

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается штамма бактерий спорообразующёго "микроорганизма для контроля эффективности стерилизации изделий медицинского назначения термическим методом,' а именно стерилизации сухим горячим воздухом. Целью изобретения является повышение надежности бактериологического контроля эффективности стерилизации воздушным методом. Штамм Bacillus llchenlformis выделен с чашки Петри, подвергнутой стерилизации горячим воздухом, и депонирован под номером ВКМ В-171 ID. Штамм обладает характерными морфологическими, биохимическими и куяьтуральными свойствами и может быть рекомендован для бактериологического контроля эффективности воздушной стерилизации, оценки новых типов воздушных стерилизаторов и разработки новых режимов стерилизации сухим горячим воздухом. 3 табл.уё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si>s С 12 N.1/20, С 12 Q 1/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ть рекоческого и стериздушных

ix режиоздухом. Б

3 табл.

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ, (21) 4693565/13, (22) 18.05.89 (46) 15,02,92. Бюл, Nò 6 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт дезинфекции и стерилизации (72) Р.Л.Гутерман (53) 576,8.093 (088.8) (56) Russell А.D. The Destruction of Bacterial

spores. London, Academic Press, 1982, (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS

LICHENIF0RMIS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ

КОНТРОЛЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВОЗДУШ

НОЙ СТЕРИЛИЗАЦИИ (57) Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается штамма бактерий спорообразующего микроорганизма для . контроля эффективности стерилизации из-!

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается штамма бактерий спорообразующего микроорганизма для контроля эффективности стерилизации изделий медицинского назначения термическим методом, а именно стерилизации сухим горячим воздухом.

Известны штаммы микрооргайизмов., например спорообразующих бактерий

Bacillus subtilis, В. subtilis var. niger (B.

globlgii), нетоксигенный штамм Clostridluw

tetanl, которые используют для бактериологического контроля эффективности стерйли- зации воздушным методом, Однако эти штаммы обладают низкой устойчивостью к действию сухого горячего воздуха. Так, например, штамм В. зиЫПз

„„ „„1712403 А1 делий медицинского назначения термическим методом, а именно стерилизации сухим горячим воздухом, Целью изобретения является повышение надежности бактериологического контроля эффективности стерилизации воздушным методом. Штамм

Bacillus lichenlformis выделен с чашки Петри, подвергнутой стерилизации горячим воздухом, и депонирован под номером ВКМ

В-17110. Штамм обладает характерными морфологическими, биохимическими и культуральными свойствами и может бы мендован для бактериологи контроля эффективности воздушно лизации, оценки новых типов во стерилизаторов и разработки новь мов стерилизации сухим горячим в

° е Ф

var. niger имеет показатель устойчивости

Д16о о = 18 с.

Целью изобретения является повышение надежности бактериологического контроля эффективности стерилизации ф воздушным методом.

Штамм спорообразующего термоустой- (p3 чивого микроорганизма выделен с чашки, подвергнутой стерилизации сухим горячим воздухом, при инкубации чашек Петри для контроля стерильности, Микроорганизмы давали сливной рост на дне чашки Петри под слоем агара в виде крупных колоний в . диаметре 10 мм со светлым центром и неровным краем, Штамм характеризуется следующими признаками.

1712403

Культурал ь но-морфологические и ризнаки.

Вегетативные клетки прямые, палочковидные, расположены единично, Граммположительные. Подвижные. 5

На пшеничном агаре образует эндоспоры эллиптической формы, расположенные центрально, раздутость спорангия отсутствует.

На мясопептонном бульоне (рН 7,3 0,1) 10 штамм через 48 ч инкубации при 37+1 С образует помутнение питательной среды,. на поверхности образует пленку.

На мясопептонном агаре (рН 7,3M,1) через 48 ч инкубации при 37 1 С образует 15 слабо выпуклые сухие. колонии вытянутой звездчатой формы с неровными краями диаметром 4 — 6 мм, врастающие в среду.

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный анаэроб. Максималь- 20

/ ная температура роста 55, минимальная 15, оптимальная 37 С. Растет в бульоне с добавлением 7 Д поваренной соли, при рН 5,6.

Продуцирует каталазу. Реакция Фогес-Проскауэра положительная. Отношение к ис- 25 точникам углерода — расщепляет глюкозу с, образованием кислоты и газа (слабо), Отношение к источникам азота — редуцирует нитраты, образует газ в анаэробных условиях на среде для денитрификации. Гидролизует 30 крахмал. Утилиэирует пропионат, Расщепляет аргинин. Не образует индол, лецитиназу, кислоту в лакмусовом молоке.

Показатели термоустойчивости.

При нагревании в ультратермостате ам- 35 пул с суспензией плотностью 1 10 спор

6 в 1 мл дистиллированной воды — Д1оо о =

=1,7мин, Д1ово=1,2 мин и Д>ooo= — 0,9мин, 2 = 32 С; при действии сухого горячего воздуха на биотесты с использованием алюми- 40 ниевой фольги в качестве носителя Дыо о =

=2,8 мин, при действии сухого горячего воздуха с температурой 160 С в воздушном стерилизаторе на биотесты, содержащие

5 10-5 10 спорнаноситель(инсулиновые 45 флаконы, алюминиевая фольга), время выживания тест-культуры на носителе не ме-. нее 4 мин для каждого образца, время гибели не.превышает 30 мин для каждого образца. 50

Штамм назван Bacillus Iicheniformis G.

Штамм депонирован в Всесоюзной коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов AH СССР, коллекционный номер ВКМ В-1711 Д. 55

Штамм бактерий В. licheniformls G испольэован для планового бактериологического контроля эффективности воздушной стерилизации в лечебно-профилактических учреждениях, для испытаний новых типов воздушных стерилизаторов и разработки нового режима стерилизации изделий медицинского назначения сухим горячим воздухом, Пример 1. Контроль эффективности воздушной стерилизации проводят с использованием биотестов. Биотесты представляют инсулиновые флаконы или чашечки иэ алюминиевой фольги, содержащие высушенные споры штамма В. Ilcheniformis G в количестве

5 10 -5 10 спор на носитель в пакетах из упаковочной бумаги.

Для изготовления биотестов в асептических условиях вскрывают ампулу с лиофилизированной культурой В, llchenlformis штамм 6. Суспензию переносят в две пробирки с бульоном Хоттингера, содержащим

0,53, глюкозы (по 1 — 2 капли). Посевы инку- . бируют при 37 1 С в течение 24 ч. При росте культуры отмечают помутнение питательной среды и образование пленки.

Суточную бульонную культуру бактериологической петлей пересевают на скошенную питательную среду в пробирках (мясопептонный агар). Посевы инкубируют при 37+1 С в течение 24 ч, после чего культуру, выращенную на твердой питательной среде, смывают 5 мл стерильной дистиллированной воды.

Для получения спор производят пересев культуры во флаконы, содержащие скошенный пшеничный агар. Взвесь равномерно распределяют по поверхности среды.

Флаконы закрывают ватно-марлевыми пробками с бумажными колпачками и инкубируют при 37+1 С в течение 7 — 10 сут, в наклонном положении (под углом 45 ) агаром вверх. На 5,7 и 10 сут..культуру проверяют на интенсивность спорообразования (выборочно 2-3 флакона), После завершения споруляции культуру осторожно при помощи шпателя из проволоки смывают с поверхности агара 5 мл стерильной дистиллированной воды.

Для удаления вегетативных клеток полученную суспензию прогревают при 65—

70 С в течение 30 мин в водяной бане (экспозиция с момента достижения температуры на термометре, опущенном в контрольную емкость с водой), центрифугйруют в стерильных центрифужных пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками, с частотой вращения 33,33 с (2000 об/мин) в течение 15 мин. Далее,надосадочную жидкость осторожно удаляют, а осадок трехкратно промывают стерильной дистиллированной водой, чередуя с центрифугированием, после чего суспендируют в

1712403 небольшом объеме стерильной дистиллированной воды.

Для определения числа жизнеспособных спор в полученной суспензии готовят десятикратные разведения культуры, Из трех последовательных десятикратных разведений исходной суспензии (предел разведения зависит от концентрации полученных спор (ориентировочно от 10 до 10 ) производят высев по 0,1 мл суспензии на поверхность трех чашек Петри с мясопептоиным агаром, Чашки Петри инкубируют при

37 +1 ОС в течение 48 ч, после чего производят подсчет выросших колоний. Приблизйтельную концентрацию спор в исходной суспензии определяют с учетом посевной дозы и разведений исходной суспензии.

В качестве носителей используют инсулиновые флаконы или чашечки из алюминиевой фольги, которые стерилиэуют паровым методом в упаковке из бумаги (чашечки из алюминиевой фольги раскладывают вчашки

Петри). Стерильные носители с помощью пипеточного дозатора обсеменяют суспензией спо2о В. licheniformis штамм G из расчета 5.10 -5 10 спор на носитель, что достигается нанесением на каждый:носи.тель 0,02 мл суспензии спор в дистиллированной воде плотностью 2.5..10 -2;5 10

4 . 5 спор в 1 мл.

Носители высушивают в термостате при

37+1 С или в эксикаторе над осушителем (силикагель, хлористый кальций) при комнатной температуре в течение 24 ч, помещают в пакеты из упаковочной бумати, маркируют и запаивают в полиэтИленовые пакеты. Срок хранения при 4 С 2 года.

Определение устойчивости штамма к действию сухого горячего воздуха проводят при 160 С в воздушных стерилизаторах . с принудительной циркуляцией и скоростью движения воздуха более 1 м/с (ГП-20. ГП-40, ГП-80). Показатели устойчивости биотестов. должны быть: время выживания тест-.культуры на носителе не менее 4 мин для каждого образца, время гибели не должно превышать 30 мин для каждого образца.

При -проведении. контроля биотесты размещают в контрольные. точки Стерилиэационной камеры между изделиями,, подвергающимися стерилизации.,Количе-. ство контрольных точек зависит от размера стерилизационной камеры (от 5 до15 биоте-, стов).

По окончании времени стерилиэационной выдержки биотесты вынимают из стерилизатора и доставляют в бактериоло.гическую яабораторию. где производят посев. с соблюдением асептических условий.

10

35 вательных элементов, дефекты прокладок) и

55

Для культивирования биотестов после стерилизации используют бульон Хоттингера, содержащий 0,5 глюкозы. Биотесты инкубируют при 37+1 С в течение 7 сут.

Учет результатов контроля проводят путем ежедневного визуального осмотра биотестов. Биотесты считают стерильными, если помутнение питательной среды отсутствует, что указывает на гибель спор штамма В, lichenlformis G, т.е. на эффективность проведенной стерилизации, Помутнение питательной среды и образование пленки указывает на неэффективность проведенной стерилизации. Окончательный ответ дают после выделения чистой культуры и сравнения ее с контролем.

Дезинфекционная станция г.Москвы провела бактериологический контроль эффективности воздушной стерилизации в-лечебно-профилактических учреждениях (температура стерилизации 180 С, время выдержки 60 мин). Суммированные результаты контроля приведены в табл.1, В 93 случаях (2,4%) воздушная стерилизация. признана неудовлетворительной.

Причинами неудовлетворительных результатов контроля были различные нарушения при проведении стерилизации (избыточная загрузка аппаратов, многослойная укладка стерилизуемых изделий, препятст- вующая циркуляции воздуха, использование в качестве упаковки закрытых металлических пеналов), технические неисправности аппаратов(неисправность нагреконтрольно-измерительной аппаратуры (неисправность термометров), Проведение организационно методической работы с персоналом лечебнопрофилактических учреждений и введение планового контроля позволило в 4 раза снизить неудовлетворительные результаты бакl териологического контроля эффективности воздушной стерилизации.

Пример 2. Для установления бактериологической эффективности воздушной стерилизации в аппаратах нового типа проводят не менее трех опытов с использованием разработанных биотестов на основе штамма В. ticbeniformis 6 на каждый режим стерилизации при загруженной стерилизационной камере. Биотесты в упаковочной. бумаге размещают на загрузочных полках стерилизатора в тех же точках, где располагали датчики температуры, По окончании стерилизации биотесты вынимают и производят посев с соблюдением асептических условий. Результаты испытаний опытных образцов воздушных стерилизаторов представлены в табл.2.

1712403

Таблица 1

П р и м е ч а н и е . Числитель — число исследованных аппаратов. Знаменатель — число аппаратов, где биотесты дали рост штамма B, llcheniformis 6, Результаты бактериологического контроля эффективности воздушной стерилизации с использованием биотестов на основе штамма В. licheniformis G позволяют рекомендовать исследованные аппараты к се- 5 рийному производству.

Пример 3. Штамм бактерий В, llchenlformis 6 использован для разработки режима стерилизации изделий медицинского назначения сухим горячим воздухом при 10

160 С в воздушных стерилизаторах с принудительной циркуляцией и скоростью движения воздуха в рабочей камере более 1 м/с..

Таковыми являются выпускаемые отечественной промышленностью воздушные сте- 15 рилизаторы ВП-10. ГП-20, ГП-80, ГП-320 и

ГП-640.

При экспериментальных исследованиях в качестве имитатора загрузки используют упакованные в бумагу чашки Петри как наи- 20 более энергоемкие объекты стерилизации, которые равномерно размещают по объему камеры исследуемых сгерилизаторов.

Для определения времени стерилизационной выдержки изделий медицинского 25 назначения в качестве тест-объектов используют чашки Петри, которые обсеменяl ют суспензией споо.штамма В. licheniformis з

G из расчета 5 10 — 5 10 спор на тест-объект, Чашки Петри упаковывают и размеща- 30 ют на загрузочных полКах стерилизатора в тех же точках, где располагают датчики температуры.

По окончании времени стерилизационной выдержки тест-объекты вынимают из 35 стерилизатора, заливают агаром Хоттингера (содержание аминного азота от 140 до

160 мг ) и инкубируют при 37+1 С в течение 14 сут. В случае отсутствия роста чашки

Петри считают стерильными, При наличии 40 роста сравнивают колонии с колониями в контрольной чашке, которую не подвергают стерилизации, Идентичность колоний свидетельствует о нестерильности тест-объектов.

Результаты бактериологического контроля эффективности стерилизации сухим го-, рячим воздухом при 160 С в зависимости от времени стерилизацианной выдержки представлены в табл.3.

Анализ данных, представленных в табл.3, показывает, что стерилизация тестобъектов в стерилизаторе наибольшего объема была достигнута под воздействием сухого горячего воздуха температурой

160 С при времени стерилизационной выдержки 135 мин, На основании проведенных исследований для воздушных стерилизаторов с принудительной циркуляцией и скоростью движения воздуха более 1 м/с был предложен режим стерилизации сухим горячим воздухом при 160 С в течение 150 мин.

Штамм бактерий B. licheniformts G обладает характерными морфологическими, биохимическими и культурал ьн ыми свойствами, растет на общепринятых питательных средах, образуя термоустойчивые споры, и может быть рекомендован для бактериологического контроля эффективности воздушной стерилизации, оценки новых типов воздушных стерилизаторов и разработки режимов стерилизации сухим горячим воздухом, . Использование предлагаемого штамма обуславливает социальный эффект, так как позволяет повысить эффективность бактериологического контроля воздушной стерилизации в лечебно-профилактических учреждениях, что будет спасобствовать повышению эффективности профилактики внутрибольничных инфекций.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus licheniformis

HKM B-1711Д, используемый для контроля эффективности воздушной стерилизации.

1712403

Таблица 2

Таблица

Составитель Р, Гутерман

Техред Ю.Моргентал Корректор С. Шевкун

Редактор Ю. Середа

Заказ 510 Тираж . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 цроизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

П р и м е ч а н и е . Числитель — чйсло йсследованных тест-объектов. Знаменатель — число тест-объектов, давших рост штамма В. ПспепЫогв!з G.