Способ выявления металлоконцентрирующих микроорганизмов в природных субстратах

 

Изобретение относится к биогеот1вхнологии и охране окружающей среды и мЪжет быть использовано для выделения из природных субстратов металлокрнцентрирук>&-щих микроорганизмов, являющихся активными агентами в процессах микробиологического обогащения и переработки металлов и биоочистке токсичных металлосодержащих стоков. Целью изобретения является сокращение времени выделения металлоконцентрирующих микроорганизмов. Изобретение заключается в том, что в пределах геохимические аномалий биогенной природы отбирают пробы рыхлых обра-. зований, производят их ртмучивание дистиллированной водой с последующей фильтрацией надосадочной жидкости, доб^йвляют последовательно в образцы полученной устойчивой водной суспензии срли металлов, присутствующих в высоких содержаниях в аномалии, и по коагуляции суспензии солью конкретного металла с образованием хлопьевидного осадка, состоящего из видимых в световой микроскоп агрегатов из десятков-Сотен микроорганизмов, судят о наличии в отобранных пробах концентрирующих данный металл (металлы) микроорганизмов.•^ •^юIИзобретение относится к биргеотехнологии и охране окружающей среды^ а именно к способам выявления металлркбнг центрирующих микроорганизмов, которые могут быть использованы в процессах Мйкг робиологического обогащения и nepepafiot- ки металлов из природных и техногенных пульп и рассолов и биоочистке токсичных металлосодержащих стоков химической и металлургической промышленности, а так* же для индикации повышенного соде|!жа-ния тяже/1ых металлов в объектах окружающей среды.Известен способ получения золотоконцентрирующих микроорганизмов путем адаптации лабораторных штаммов бактерий к коллоидному золоту при их многократных пересевах в присутствии металла, в результате чего-они приобретают золотоконцентрирующую способность.Недостатком этого способа является его длительность, так как адаптация может

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 1/20. С 12 0 1/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4712479! 13 (22) 29.06.90 (46) 15.02.92., Бюл. ¹ 6 (71) Институт минералогии, геохимии и кристаллохимии редких элементов АН СССР (72) Б.С.Коган, В.В.Демидов и Э.B.ÁYðåíêîà (53) 631.427.2 (088.8) (56) Овчаренко Ф.Д., Перцов H.B., Ульберг

3.Р, и др-. Исследование взаимодействия:

В,subtltls с частицами коллоидного золота методом ИК-спектроскопии. — Коллоидный журнал, 1987, т. 49, № 15, с. 898 — 902.

Авторское свидетельство СССР № 1253999, кл. С 12 0 1/00, 1984.

Каравайко I;VL и др. Микробиологиче-. ское выщелачивание металлов из руд. Наука, 1972. (54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МЕТАЛЛОКОНЦЕНТРИРУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ

В ПРИРОДНЫХ СУБСТРАТАХ (57) Изобретение относится к биогеотехнологии и охране окружающей среды и может быть использовано для выделения из природных субстратов металлоконцентрирую-.

Изобретение относится к биогеотехн©логии и охране окружающей среды, а именно к способам выявления металлоконг центрирующих микроорганизмов, которые могут быть использованы в процессах микробиологического обогащения и переработки металлов из природных и техногенных пульп и рассолов и биоочистке токсичймх металлосодержащих стоков химической и металлургической промышленности, а также для индикации повышенного содержа„„Я „„1712404 А1 щих микроорганизмов, являющихся активными агентами в процессах микробиологического обогащения и переработки металлов и биоочистке токсичных металлосодержащих стоков. Целью изобретения является сокращение времени выделения металлоконцентрирующих микроорганизмов, Изобретение заключается в том, что в пределах геохимических аномалий биогенной природы отбирают пробы рыхлых образований, производят их отмучивание дистиллированной водой с последующей фильтрацией надосадочной жидкости, добавляют последовательно в образцы полученной устойчивой водной суспензии соли металлов, присутствующих в высоких содержаниях в аномалии, и по коагуляции суспензии солью конкретного металла с образованием хлопьевидного осадка, состоящего из видимых в световой микроскоп агрегатов из десятков-сотен микроорганизмов, судят о наличии в отобранных пробах концентрирующих данный металл (металлы) микроорганизмов. ния тяжелых металлов в объектах. окружающей среды.

Известен способ получения золотоконцентрирующих микроорганизмов путем адаптации лабораторных штаммов бактерий к коллоидному золоту при их многократных пересевах в присутствии металла, в результате чего они приобретают золотоконцентрирующую способ ность.

Недостатком этого способа является его длительность, так как адаптация может

1712404 занять неопределенно долгое время и к конкретному металлу у конкретного микроорганизма не обязательно достижима. . Известен способ выделения микроорганизмов, обладающих определенными биохимическими свойствами из природных субстратов, основанный на направленном поиске. Он заключается в применении среды накопления, на которой через 10-14 дней. визуально наблюдаются изменения цвета среды, что впоследствие после дополнительных пересевов позволяет выявить микроорганизмы, обладающие полиредуктазными свойствами. Недостатками способа являются длительность его осуществления и невозможность применения для выявления металлоконцентрирующих микроорганизмов.

Наиболее близким по технической сущности является способ выявления металлоконцентрирующих микроорганизмов, например, концентрирующих железо, марганец и др., основанный на применении злективных питательных сред.

Недостатком способа явЛяется необходимость проведения длительного инкубирования на питательных средах.

- Целью изобретения является сокращение времени выделения металлоконцентрирующих микроорганизмов.

Способ заключается в том. что в пределах геохимических аномалий биогенной природы отбирают пробы рыхлых образований, производят их отмучивание дистиллированной водой с последующей фильтрацией надосадочной жидкости, добавляют последовательно в образцы полученной устойчивой водной суспензии соли металлов, присутствующих в. высоких содержаниях в аномалии, и по коагуляции суспензии солью конкретного металла с образованием хлопьевидного осадка, состоящего из видимых в световой микроскоп агрегатов из десятков-сотен микроорганизмов, судят о наличии в отобранных пробах концентрирующих данный металл (металлы) микроорганизмов, Изобретение основано на установленной жестко детерминированной взаимосвязи в системе "металл — микробная клетка", возникающей в условиях повышенного содержания металлов на естественных биогеохимических барьерах и приводящей к образованию специфических металлофильных биогеоценозов с металлоконцентрирующими функциями микроорганизмов.

Способ осуществляют, соблюдая следующую последовательность операций;

1. Для выделения микроорганизмовконцентраторов той или иной формы заданного металла (металлов) выбирают их геохимические аномалии биогенной природы.

2. В пределах выбранной зоны берут пробы рыхлых микробиокосных образова5 ний (илы, почвы, коры выветривания и т.n,) и производят их отмучивание дистиллированной водой с последующей фильтрацией надосадочной жидкости, достигая содержания автохтонных микроорганизмов в пол10 учаемой суспензии 10 — 10 кл/мл.

В

3. В образцы полученной устойчивой водной суспензии последовательно добавляют в конечной концентрации не менее 1 мМ/л соляно- и (или) сернокислые соли ме15 таллов, присутствующих в высоких содержаниях в опробуемой аномалии.

4. После выдерживания реагентов в течение не более 30 мин по коагуляции суспензии солью конкретного металла c ..

20 образованием хлопьевидного осадка, состоящего из видимых в световой микроскоп агрегатов из.десятков-сотен микроорганизмов размерами около 100 мкм судят о наличии в отобранных пробах концентрирующих

25 данный металл (металлы) микроорганизмов.

Стерильно отобранные пробы рыхлых образований с металлоконцентрирующими .микроорганизмами можно использовать, далее в качестве посевного микробиологического

30 материала и по той или иной микробиологической методике получить накопительную ассоциативную культуру(и при необходимости отдельные штаммы) микроорганизмов, которые затем тестируют на способность к

35 концентрированию данного металла (металлов) в той или иной форме (ионная, коллоидная и т.n.).

П р и м-е р 1. С целью получения технологичных специализированных ассоциатов

40 микроорганизмов, способных концентрировать ряд цветных и благородных металлов в различных формах, при анализе структуры многомерного геохимического поля путем обработки данных геохимического картиро45 вания на 3ВМ выбрана зона биогенного концентрирования металлов в комплексной геохимической аномалии одной из морских бухт дальневосточного шельфа с высоким уровнем техногенного загрязнения. Анома50 лия сформирована в разлагающемся зостерном иле с содержанием Copr до 70 и в биогенной зоне характеризуется повышенными содержаниями марганца, кобальта, никеля, меди, цинка и.золота.

55 Отмучиванием иловых проб биогенной зоны дистиллированной водой с последующей .фильтрацией надосадочной жидкости получены образцы устойчивой водной суспензии с содержанием автохтонных микроI 7 организмов 10 кл/мл, что определялось

1712404 микроскопически с помощью камеры Горяева: в поле зрения микроскопа при тысячекратном увеличении наряду с минеральными частицами отчетливо видны бактериальные

° клетки.. В присутствии хлоридов кобальта, 5 никеля и золота и сульфатов меди и цинка конечной концентрации 10 мМ/л большинство образцов водной суспензии коагулирует за 20 мин с образованием хлопьевидного осадка; в присутствии хлорида марганца и 10 сульфата, магния коагуляции суспензии не происходит. Микроскопирование полученных осадков показывает, что они содержат агрегаты из десятков-сотен микроорганизмов размерами около 100 мкм, в то время 15 как исходная суспензия представлена восновном одиночными бациллами, На, этом основании сделан вывод о наличии в отобранных пробах илов метэллоконцентрирующих микроорганизмов, а ктивных к 20 соединениям кобальта, никеля, меди, цинка и золота. Вне выбранной зоны биогеннаго концентрирования металлов коагуляционная активность иловых суспензий в:йрисут-. ствии солей не выражена. -.- ....:: i 25

Действительно, испол ьзованйе иловой болтушки из нескольких стерильно отобранных донных проб выбранной зоны биогенного концентрирования мвтэллов в качестве посевного микробиологического ЗО материала дает через сутки при росте в мясопептонном бульоне накопительную ассоциативную культуру металлоконцентрирующих микроорганизмов, представленную, главным образом, бактериями 35 родов Bacillus u Pseudomonas c содержанием до 3 10 кл/мл. Детальная идентификация металлоконцентрирующих форм не проводилась. Металлоконцентрирующую способность выделенной морской ассоциэ- 40 тивной культуры микроорганизмов по отношению к растворимым формам цветных и благородных металлов onðåäåëëëè по их аккумуляции микроорганизмами иэ растворов сульфатов цинка и меди и хлоридов никеля, 45 кобальта и золота. Приливание получейной ростом в МПБ жидкой ассоциативной культуры микроорганизмов при их конечном содержании в растворах l0 кл/мл приводит

7 через 15-20 мин к помутнению исследуемых 50 растворов с постепенным их просветлением за счет образования хлопьевидного осадка. При этом содержание металлов в растворе падает с одновременной аккумуляцией до 100 кг металла на 1 г сухого осад- 55 ка, что сравнимо с металлосорбционной емкостью искусственных и природных . ионитов. Контрольный опыт показал, что стерильная культуральная жидкость коагуляционной способностью в отношении металлов не обладает.

Полученная ассоциативная культура микроорганизмов концентрирует не только растворимые формы металлов. Так, устойчивая водная дисперсия коллоидного золота с содержанием 10 мг/л коагулирует в присутствии выделенных микроорганизмов за

15 — 20 мин с образованием. осадка при од-. новременном просветлении и обесцвечивании водной дисперсии золота исходно фиолетового цвета, Это свидетельствует о практически полном переходе золота в осадок в результате его аккумуляции микроорганизмами. Отметим, что музейный штамм

B.subtilts, представляющий собой доминантный вид в выделенной ассоциативной культуре клеток, сорбционной способностью к сульфату цинка, хлориду никеля и коллоидному золоту не обладает.

Проведенные эксперименты позволяют заключить, что выделенная способом направленного геохимического поиска ассоциативная культура микроорганизмов эффективно концентрирует коллоидные и ионные формы ряда цветных и благородных металлов, накапливающихся на выбранном биогеохимическом барьере.

Металлоконцентрирующая способ ность выделенного природного ассоциата металлоконцентрирующих микроорганизмов отличается стабильностью и сохраняется длительное время без видимых изменений, так как пересев культуры или повторное ее выделение из отобранных ранее иловых проб через несколько месяцев не позволяет заметить существейных различий в металлоконцентрирующей активности по сравнению с ассоциатом, полученным в день отбора проб.

Способ позволяет направленно за два — три дня осуществить выделение микроорганизмов со стабильными металлоконцентрирующими свойствами, что значительно снижает затраты времени и

3 средств.

Пример 2, Способ выявления металлокон центрирующих микроорганизмов из природных субстратов позволяет также диагностировать повышенное содержание тяжелых металлов в объектах окружающей среды, что дает возможность использовать его при поиске руд и локализации источников загрязнения.

С целью демонстрации возможностей способа для выявления зон естественного повышенного содержания металлов при поиске скрытых оруденений был проведен отбор почвенных проб гумусового горизонта над жильными рудопроявлениями золото7

1712404 полиметаллической формации, не выходящими на поверхность, но выявляемых в нижних зонах скальных береговых обнажений. Важно отметить, что проведенный первоначально традиционный полуколичественный спектральный, анализ почвенных проб не выявил floBbllllBHHblx содержаний металлов во вторичных ореолах.

В качестве посевного материала используют почвенные болтушки соответствующих стерильно отобранных образцов почв;

Рост ассоциативных культур микроорганизмов с целью выбора среды культивирования осуществляли на сложных и простых твердых питательных средах. В качестве простой среды для роста большинства споро- и неспорообразующих микроорганизмов был выбран .мясо-пептонный агар, а в качестве элективной избирательной среды для роста неспорообразующих микроорганизмов — коли-среда

М 1 (с добавлением рибофлавина).

Через сутки полученные колонии микроорганизмов ресуспендируют до содержания 10 кл/мл и в образцы полученной водной суспензии добавляют последовательно гидрозоли металлического золота и серебра, сульфида мышьяка, гидроокисей железа и кобальта в конечной концентрации

1 — 10 мг/л.

В полученных образцах для МПА-ассоциата в первые минуты наблюдали коагуляцию с образованием,хлопьевидных флокул и постепенным их осаждением за 10 — 30 мин с просветлением золей золота, серебра, сульфида мышьяка и гидроокиси железа. В золях гидроокиси кобальта изменений не наблюдали спустя десятки часов. Для ассоциативной культуры, выращенной на колисреде hL 1, взаимодействие с указанными золями выражено значительно слабее, что свидетельствует о,связи коагуляционной активности с бациллами и, следовательно, о целесообразности использования мясопептонных сред для адекватного и информативного тестирования.

Суспензия микроорганизмов, полученная посевом образцов из заведомо фоновых областей, флокуляционной активности в отношении металлов не обнаружила, Таким образом, данные проведенного геомикробиологического опробования позволяют предположить наличие в опробуемой зоне скрытого оруденения, что корреспондирует повышенные содержания золота, серебра, мышьяка и железа в ореоле гумусового горизонта почв, Это подтвердилось и специальным лазерно-эмиссионным. спектральным анализом щелочных почвен5 ных вытяжек, Пример 3. Опробо.ванию подвергают горячие источники Малкинского и

Вилючинского гидротермальных полей и-ова Камчатка. С этой целью суспензии

10 готовят отмучиванием иловых проб из источников до содержания микроорганизмов

10 -10 кл/мл, к которым добавляют.раство6 ры солей ряда металлов в конечной концен-,. трации,1 — 10 мМ/л.

15 Обнаружилось, что иловая суспензия из

Вилючинских гидротерм коагулирует в присутствии сульфатов меди и цинка за 10-15 мин, в то время как ил из Малкинских гидротерм совершенно не активен.

20 Активность Вилючинского ила коррелирует с повышенными содержаниями меди и цинка в данных гидротермальных источниках, То, что коагуляционная активность суспензий иловых образцов гидротерм

25 обусловлена их автохтонной микрофлорой доказывается аналогичной активностью выращенных в МПБ гидротермальных ассоциатов микроорганизмов, Приведенные примеры показывают, что

30 способ позволяет с высокой степенью достоверности обнаруживать повышенные содержания тяжелых металлов естественного и искусственного происхождения в различных природных обьектах.

35 Формула изобретения

Способ выявления металлоконцентрирующих микроорганизмов в природных субстратах, предусматривающий отбор образцов грунта, его суспендирование и обна40 ружение микроорганизмов в пробах, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью сокращения времени проведения процесса, пробы отбирают в пределах геохимических аномалий, производят их отмучивание водой, фильтра45 цию получаемой суспензии, доводят концентрацию автохтонных микроорганизмов до 10 — 10 клеток/мл, добавляют до конечб 8 ной концентрации в суспензии 1 мМ/л серно- или солянокислые соли металлов, 50 присутствующих в высоких концентрациях в аномалии, и по коагуляции суспензии в течение не более 30 мин судят о наличии в образце металлоконцентрирующих микроорганизм в.