Быстрый способ обработки гладкомышечных клеток кишечника гемолизином ii bacillus cereus



Быстрый способ обработки гладкомышечных клеток кишечника гемолизином ii bacillus cereus
Быстрый способ обработки гладкомышечных клеток кишечника гемолизином ii bacillus cereus
Быстрый способ обработки гладкомышечных клеток кишечника гемолизином ii bacillus cereus
Быстрый способ обработки гладкомышечных клеток кишечника гемолизином ii bacillus cereus
Быстрый способ обработки гладкомышечных клеток кишечника гемолизином ii bacillus cereus

 

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2497118:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) (RU)

Изобретение относится к медицине и предназначено для повышения проницаемости мембран гладкомышечных клеток тонкого кишечника. Проводят обработку клеток в одной пробе пороформирующим гемолизином HlyII из Bacillus cereus в концентрации 3-5 мкг/мл. Способ позволяет уменьшить расход клеточного материала и сократить время обработки без снижения эффективности. 3 пр., 1 ил.

 

Описание изобретения

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, а именно, к экспериментальной гастроэнтерологии и может применяться как в исследовательской работе, так и для проведения диагностических наблюдений в практической медицине.

Уровень техники

Введение в гладкомышечные клетки низкомолекулярных соединений широко используют при изучении функционального состояния этих клеток в развитии патологии тканей, состоящих из гладкомышечных клеток, а также для оценки действия лекарственных препаратов, используемых в лечении соответствующих заболеваний.

Гладкомышечные клетки являются основным типом клеток, составляющим ткани гладкомышечной мускулатуры организма, выполняющими роль сократительного аппарата в стенках кровеносных и лимфатических сосудов, а также в различных отделах пищеварительной, репродуктивной и выделительной систем человека и животных. Эффективность транспорта низкомолекулярных соединений внутрь гладкомышечных клеток достигается путем повышения проницаемости внешних клеточных мембран гладкомышечных клеток при действии на них различных пороформирующих агентов в результате образования в цитоплазматическом мембранном слое различных по строению поровых каналов.

Из известных в настоящее время способов повышения проницаемости клеточных мембран (пермеабилизации мембран) наиболее широко применяется обработка внешних мембран гладкомышечных клеток человека и животных пороформирующим гемолизином альфа-токсином из Staphylococcus aureus [26, 49], который образует в мембранном слое клеток поровые каналы для транспорта внутрь клеток низкомолекулярных веществ с молекулярным весом менее 4 килодальтон и диаметром молекул менее 2 нанометров.

В гастроэнтерологии пермеабилизация гладкомышечных клеток альфа-токсином используется в исследовании патологии сократительных свойств и кровоснабжения различных отделов пищеварительной и выделительной систем, в частности сократимости мышечных клеток желудка [3], дисфункции кишечника при колитах [18, 24]. На пермеабилизованных фрагментах тканей желудка и кишечника изучали механизмы регуляции их тонуса и сокращения препаратами омепразола, карбахола, селеретрина и другими фармпрепаратами. [12, 14, 31, 37, 38, 44, 51, 52,]. С применением обработки альфа-токсином исследовали чувствительность к ионам кальция пермеабилизованных брыжеечных лимфатических мышц и артерий [10]. С использованием пермеабилизации гладкомышечных клеток изучали патологию органов выделительной системы, в частности уточняли механизмы релаксации соответствующих интактных и пермеабилизованных мышц под действием монензина, фосфоколина и NaCN [20]. Было установлено, что терапевтический эффект широко используемого при цистите ДМСО вызывается уменьшением чувствительности к кальцию соответствующих гладкомышечных миофибрилл [39], кроме того, показано ослабление сократительных свойств обработанных альфа-токсином соответствующих гладкомышечных фрагментов выделительной системы при развитии сахарного диабета [43].

Известны многочисленные работы по использованию обработки альфа-токсином гладкомышечных клеток сосудов, являющихся основным сократительным компонентом артерий, артериол, вен и венул организма животных и человека. На обработанных альфа-токсином гладкомышечных клетках артерий мозга показаны различия в расслаблении гладкомышечных клеток базиларной и средней мозговых артерий при применении доноров оксида азота и вазодилататорного действия на них цикломонофосфатов [33, 63], а также исследованы некоторые условия и последствия гемаррогического инсульта мозга и миогенной реактивности артерий мозга. На пермеабилизованных фрагментах коронарных сосудов показано, что одной из причин развития сердечной недостаточности является падение сердечно-сосудистого тонуса, вызываемое изменением фосфорилирования миозиновой фосфатазы, что предполагает лечение этой патологии препаратами Y27632 или ML7 [58,59]. Обработку альфа-токсином гладкомышечных клеток сосудов, обеспечивающих кровоснабжение различных отделов дыхательных путей, использовали при изучении причин возникновения таких патологий легких, как легочная гипертония, гипоксия, бронхиальная астма, а также воспалительные процессы, возникающие при курении. В частности, были уточнены механизмы регуляции гипертензии пермеабилизованных легочных артерий и вен [9, 35, 42, 61]. На пермеабилизованных фрагментах гладкомышечных тканей сосудов изучали причины развития других широко распространенных типов гипертензии, таких, как почечная и портальная [25, 62], а также гипертензивные состояния, развивающиеся в периферийных частях кровеносной системы [6, 26, 27, 50].

Пермеабилизация гладкомышечных клеток представляет особый интерес в изучении регуляции женской сосудистой и репродуктивной систем во время беременности, что важно для понимания основ адаптации репродуктивных органов матери при развитии плода. При обработке альфа-токсином показано, что сокращение сосудов плаценты беременных женщин происходит из-за повышения их чувствительности к кальцию во время беременности и может ослабевать под действием оксида азота [16, 17]. Также установлены различия в действии препаратов каликулина, киназных ингибиторов и тромбоксан-миметиков на пермеабилизованные и интактные гладкомышечные клетки сосудов беременных женщин [60]. Показано действие препаратов нейропептида нейрокинина, дилтиозема на сократимость интактных и пермеализованных гладкомышечных клеток миометриума беременных и небеременных женщин и экспериментальных животных [34, 40]. В данном направлении на пермеабилизованных образцах мышц из беременных и небеременных женщин выяснены различия в действии препаратов активатора протеинкиназы, ингибиторов типа Go 6850, LY333531 и изменения соотношений активности изоформ регуляторной протеин киназы С [34]. Пермеабилизованные альфа-токсином и нативные гладкомышечные клетки исследовали при патологиях мужской репродуктивной системы, в частности при функционировании мышечных тканей простаты и нарушении сокращений соответствующих мышц при гиперплазии простаты человека [47, 48]. На пермеабилизованных фрагментах соответствующих мышц экспериментальных животных изучали причины эректильной дисфункции и пути ее устранения фармпрепаратами фенилефрина, нейрокинина, нифедипина, фосфорамидона, нифедрина [45, 46, 56, 57], а также другие аспекты поддержания тонуса гладкомышечной мускулатуры [55].

Пермеабилизация гладкомышечных клеток позволяет оценивать эффективность действия на эти клетки различных лекарственных препаратов и оптимизировать лечение патологий в функционировании гладкомышечных тканей организма человека. В связи с широким применением методов пермеабилизации клеток гладкомышечной мускулатуры в молекулярной медицине дальнейшая разработка способов их пермеабилизации является актуальной.

Известный способ пермеабилизации гладкомышечных клеток препаратом альфа-токсина применяется наряду с другими способами пермеабилизации клеток препаратами сапонина, эсцина и тритона Х-100 [6].

Основной недостаток при применении этих детергентных препаратов заключается в неконтролируемом размере образуемых при пермеабилизации поровых каналов, поэтому данные способы считаются недостаточно воспроизводимыми и точными.

Принятый за прототип способ пермеабилизации клеточных мембран пороформирующим альфа-токсином не имеет этого недостатка, так как образует в мембране строго фиксированные по размеру 2 нм поровые каналы. Данный способ состоит в обработке проб различными концентрациями альфа-токсина, и последующем введении в обработанные токсином и отмытые от него пробы изучаемых низкомолекулярных веществ. Примером способа пермеабилизации, принятого за прототип, является обработка клеток различными концентрациями альфа-токсина для последующего транспорта через клеточные мембраны красителя пропидиум иодида и различных ионов, как описано [19].

При данном способе пермеабилизации каждая проба клеток обрабатывается одной концентрацией альфа-токсина. Приготовление проб для пермеабилизации часто является трудоемким и дорогостоящим процессом, связанными с малым количеством выделяемого в клинических условиях биопсийного материала. Примерами являются эксперименты по лечению глаукомы и устранению непроизвольного сокращения глазных мышц, приводящих к нежелательным рефлекторным сокращениям зрачка при контакте с хирургическим инструментом во время глазных операций, а также к ослаблению развития послеоперационных воспалительных процессов. В данной работе эксперименты проводились на изолированной и пермеабилизованной альфа-токсином мышце радужной оболочки глаза в комбинации с ингибиторами Y27632, GF109203X и вазодилататором карбахолом [15]. Также на ограниченном количестве биопсийно изолированных фрагментов мышц из опухолеобразований легочных путей человека и в опытах на лабораторных животных, при пермеабилизации образцов альфа-токсином исследовали особенности сокращения трахей [32], бронхов и действия бронходилататоров [7, 8, 11, 36] при курении. Типичным примером обработки биопсийных проб альфа-токсином является пермеабилизация гладкомышечных клеток сосудов мозга, проводимая при исследовании механизмов регуляции кровяного давления в сосудах мозга и выяснения причин спазма церебральных артерий, вызывающих кровоизлияние в мозг, в частности для оценки амплитуды мозговых вазоспазмов при изменении чувствительности к кальцию пермеабилизованной мозговой артерии [13, 22, 23, 28, 29]. В данном аспекте изучали механизмы возникновения вазоспазмов с целью расширения просветов пораженных сосудов мозга, обработанных альфа-токсином, препаратами эндотелина, фенилэфрина, никардипина, папаверина, цитохалазина, и кальциевыми ионофорами [22, 23, 28, 29].

Для получения эффективной пермеабилизации образцов клеток в описанных примерах предварительно подбираются необходимые для этого оптимальные концентрации препарата альфа-токсина. Причем при выборе оптимальной концентрации используемого альфа-токсина каждая концентрация препарата этого токсина тестируется на отдельно приготовленном образце клеток.

Основным недостатком, присущим для данного способа прототипа, является трудность предварительного подбора условий по пермеабилизации образцов, возникающая из-за малого числа получаемых биопсийных образцов и сложности их подготовки для пермеабилизации, поскольку подбираемые условия пермеабилизации варьируют в зависимости от источника биопсии клеток, их жизнеспособности, выбранного способа приготовления образцов, включающего состав буферов, ферментативную обработку мембран клеток и качество используемых реактивов.

Заявляемый способ пермеабилизации не имеет этого недостатка, присущего для способа, принятого за прототип. Заявляемый способ состоит в том, что предварительный подбор условий эффективной пермеабилизации с использованием различных концентраций пороформирующего токсина проводится только на одном образце клеток с использованием бактериального пороформирующего гемолизина II (HlyII) Bacillus cereus в присутствии красителя пропидиум иодида. Данный гемолизин HlyII имеет высокую пороформирующую активность, образуя стабильные поровые каналы диаметром 1,4-1,6 нанометров в мембранах различных типов клеток [4, 5, 21, 41, 53, 54].

Несмотря на высокую гомологию с альфа-токсином (31% идентичности), гемолизин II отличается от него значительно меньшей стабильностью белка в растворе. Вместе с тем, как описано ранее, препарат HlyII после быстрого, в течение нескольких минут, связывания с клеточными мембранами, стабилизируется и сохраняет высокую пороформирующую активность на мембранах [1,2]. При этом активность HlyII не уступает, а на некоторых типах клеток, например, эритроцитах человека, превышает пороформирующую активность альфа-токсина [4, 30]. Оба описанных свойства HlyII, отличающих его от альфа-токсина, позволяют использовать заявляемый способ последовательного добавления в одну пробу увеличивающихся аликвот HlyII для предварительного подбора оптимальных концентраций этого токсина. Данная модификация, значительно ускоряющая подбор условий пермеабилизации клеток препаратом HlyII по сравнению с альфа-токсином, является основой заявляемого способа обработки образцов гладкомышечных клеток.

В настоящее время нет сообщений, описывающих действие HlyII на мембраны гладкомышечных клеток кишечника. Также отсутствует описание методики для тестирования пермеабилизации гладкомышечных клеток с использованием этого токсина в различных концентрациях, при последовательной обработке клеток в одном образце.

Сущность изобретения

Заявляемый способ применяется с целью более эффективного предварительного определения оптимальных условий пермеабилизации образцов гладкомышечных клеток.

Сущность изобретения состоит в использовании для тестирования уровня пермеабилизации вместо нескольких проб только одной пробы гладкомышечных клеток. Осуществление заявляемого способа основано на свойствах используемого токсина HlyII, отличных от свойств альфа-токсина, применяемого в способе пермеабилизации, принятым за прототип. Способ осуществляется при добавлении в пробу возрастающих концентраций HlyII в присутствии в этой пробе флуоресцентного красителя пропидиум иодида.

Технической задачей предлагаемого изобретения является повышение проницаемости внешних мембран гладкомышечных клеток для низкомолекулярных соединений при обработке их препаратом HlyII, получаемым из условно патогенных почвенных бактерий Bacillus cereus, обладающим высокой мембранной пороформирующей активностью и сохраняющим стабильность после связывания с мембранами обрабатываемых клеток.

Поставленная цель достигается тем, что высокоочищенный препарат гемолизина II имеет следующие свойства, обеспечивающие реализацию заявляемого способа: во-первых, HlyII инактивируется в течение короткого времени инкубации в растворе и во-вторых, HlyII стабилизируется и сохраняет высокую активность после связывания с мембранами гладкомышечных клеток как в отсутствие, так и в присутствии красителя пропидиум иодида.

Препарат HlyII в минимальной концентрации инкубируется с образцом гладкомышечных клеток из тонкого кишечника мыши, содержащем краситель пропидиум иодид, после чего этот же образец частично пермеабилизованных и окрашенных гладкомышечных клеток инкубируется с последовательно возрастающими концентрациями HlyII в присутствии пропидиум иодида, после чего на основе полученных результатов определяются оптимальные условия повышения проницаемости мембран обработанных гемолизином гладкомышечных клеток, составляющих данный образец.

Заявляемый способ пермеабилизации мембран гладкомышечных клеток при обработке их HlyII осуществляется следующим образом: 1) из стенок тонкого кишечника лабораторных животных выделяются гладкомышечные клетки, которые инкубируются в течение 10 минут с пропидиум иодидом в концентрации 3 мкг/мл при 20°С в растворе фосфатно-солевого буфера состава: 015 М хлорида натрия, 0,01 М фосфата калия, рН. 7.2; 2) после определения фонового уровня флуоресценции образца гладкомышечных клеток к тестируемой пробе добавляется препарат HlyII в минимальной концентрации 1 мкг/мл и инкубируется еще в течение 10 минут с пропидиум иодидом в концентрации 3 мкг/мл при 20°С в растворе фосфатно-солевого буфера; 3) проводится повышение уровня пермеабилизации образца гладкомышечных клеток с последовательным увеличением концентрации HlyII от 1 до 10 мкг/мл при обработке образца с каждой новой концентрацией HlyII также в течение 10 минут с пропидиум иодидом в концентрации 3 мкг/мл при 20°С в том же буфере. Относительно максимального уровня пермеабилизации, получаемого при концентрации HlyII в 10 мкг/мл, расчитываются условия, необходимые для достижения желательного уровня проницаемости мембран данного образца гладкомышечных клеток.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Пример 1. Определение активности препарата HlyII при обработке проб в присутствии пропидиум иодида.

Для пермеабилизации мембран гладкомышечных клеток используется препарат HlyII, выделенный из рекомбинантного штамма Escherihia coli Z85 (PUJ2) как описано ранее [4]. Препарат HlyII используется в концентрации 20 мкг/мл в буфере, содержащем 20 мМ К-Р04 рН 7,2, 40 мМ NaCI, 10% глицерина и имеет удельную активность около 400 ГЕ на мкг белка.

Основной особенностью используемого в заявляемом способе препарата HlyII является сохранение его высокой пороформирующей активности в присутствии флуоресцентного красителя пропидиум иодида.

Целью данной стадии заявляемого способа пермеабилизации является оценка пороформирующей активности HlyII в присутствии различных концентраций красителя пропидиум иодида.

Для достижения этого определяется значение фонового уровня флуоресценции мембран гладкомышечных клеток при окрашивании их пропидиум иодидом в отсутствии препарата HlyII.

Далее определяется величина флуоресценции гладкомышечных клеток в пробах, обрабатываемых препаратом HlyII, отмываемых от несвязавшегося HlyII и после этого окрашиваемых пропидиум иодидом.

Затем определяется величина флуоресценции гладкомышечных клеток в пробах, обрабатываемых препаратом HlyII в присутствии пропидиум иодида.

Тестирование пороформирующей активности и окрашивание пропидиум иодидом проводится на гладкомышечных клетках, изолированных из стенок тонкого кишечника 3-х месячных мышей самцов. Для определения пороформирующей HlyII активности используются пробы гладкомышечных клеток с плотностью посева 2×104 клеток/см2 в 96 луночных плашках Nunc. Перед использованием клетки инкубируются в среде DMEM модификации Дульбекко без сыворотки, с добавлением до 10 мМ Hepes (Sigma, США) рН 6,9, а также 100 мкг/мл стрептомицина и 100 мкг/мл пенициллина и промываются избытком среды DMEM в модификации Дульбекко без ЭДТА с добавлением 2 мМ CaCl2. Оценку проб проводят под микроскопом, подсчитывая число прикрепившихся клеток при увеличении ×200, с учетом прикрепления к плашке не менее 50 клеток, наблюдаемых в поле объектива микроскопа. Часть лунок используется для определения целостности мембран гладкомышечных клеток по стандартному методу определения количества жизнеспособных клеток их окрашиванием 1% раствором трипанового синего.

Окрашивание проб гладкомышечных клеток пропидиум иодидом проводится в растворе фосфатно-солевого буфера при добавлении к клеткам раствора 100 мкг/мл красителя пропидиум иодида до конечной концентрации 5 мкг/мл и инкубированием проб в течение 1 часа при 20°С. Интенсивность флуоресценции окрашенных проб с максимальным уровнем фонового окрашивания пропидиум иодидом для клеток с ненарушенными мембранами исследуется с помощью флуоресцентного микроскопа (Leica, Германия) при 200 и 800-кратном увеличении. Обработка изображений проб гладкомышечных клеток с флуоресценцией при 610 нм проводится с использованием программ Photoshop Adobe CS и Image J. Часть лунок после окрашивания пропидиум иодидом используется для повторного определения целостности мембран прикрепившихся к плашкам гладкомышечных клеток при помощи их окраски стандартным красителем трипановым синим.

После определения фонового уровня флуоресценции измеряется величина флуоресценции гладкомышечных клеток в пробах, обрабатываемых препаратом HlyII по способу прототипа. К тестируемой пробе добавляется препарат HlyII в фосфатно-солевом буфере в концентрации 5 мкг/мл и инкубируется в течение 30 минут при 20°С, пробы отмываются избытком раствора фосфатно-солевого буфера и инкубируются в течение 30 минут с пропидиум иодидом в концентрации 1, 3 и 5 мкг/мл при 20°С в 200 мкл того же буфера.

Затем измеряется величина флуоресценции гладкомышечных клеток в опытных пробах, обрабатываемых препаратом HlyII без его отмытия от пробы, в присутствии красителя пропидиум иодида. К тестируемой пробе добавляется препарат HlyII в концентрации 5 мкг/мл, а также пропидиум иодид до концентрации 1, 3 и 5 мкг/мл и опытная проба инкубируется в 200 мкл фосфатно-солевого буфера в течение 30 минут при 20°С.

При обработке HlyII, величина интенсивности флуоресценции пропидиум иодида, включенного в гладкомышечные клетки в опытных пробах, приготовленных в присутствии пропидиум иодида, не отличается от интенсивности флуоресценции в пробах, полученных способом прототипа, при используемых концентрациях красителя в 1, 3 и 5 мкг/мл пропидиум иодида.

Пример 2. Определение оптимального времени обработки гладкомышечных клеток препаратом HlyII в присутствии пропидиум иодида.

Целью данной стадии заявляемого способа пермеабилизации является установление интервала времени, достаточного для эффективной пермеабилизации проб гладкомышечных клеток при их обработке препаратами HlyII при наличии в пробах красителя пропидиум иодида.

Пробы гладкомышечных клеток, приготовленные как описано в примере 1, обрабатываются препаратами HlyII с концентрациями 1, 3, 5 и 10 мкг/мл соответственно в течение 5, 10 и 30 минут в присутствии 5 мкг/мл пропидиум иодида.

При обработке проб препаратами HlyII в различных концентрациях в течение 5 минут в присутствии 5 мкг/мл пропидиум иодида, последующей отмывке проб от несвязавшегося HlyII и инкубации проб в течение еще 25 минут в фосфатно-солевом буфере, содержащем 5 мкг/мл пропидиум иодида, величина флуоресценции включенного в клетки пропидиум иодида составляет 80% максимально возможной, получаемой при инкубации проб с HlyII в течение 30 минут. При обработке проб препаратами HlyII в тех же условиях в течение 10 минут, последующей отмывке проб от HlyII и инкубации проб в течение еще 20 минут в тех же условиях, величина флуоресценции включенного в клетки пропидиум иодида, составляет более 90% максимально возможной, получаемой при инкубации проб с HlyII в течение 30 минут.

Определение времени HlyII обработки проб в присутствии пропидиум иодида показывает, что интервал в 10 минут достаточен для получения высокого уровня пермеабилизации гладкомышечных клеток препаратом HlyII.

Пример 3. Определение предварительных условий для оптимальной HlyII пермеабилизации в присутствии пропидиум иодида, проводимых в одной пробе гладкомышечных клеток.

Целью данной стадии заявляемого способа является определение эффективности пермеабилизации в одной пробе гладкомышечных клеток при ее обработке HlyII в присутствии пропидиум иодида, проводимой по заявляемому способу пермеабилизации в сравнении с пробами, обработанными по способу принятому за прототип заявляемого способа.

Величина фоновой флуоресценции пробы гладкомышечных клеток определяется окрашиванием проб пропидиум иодидом в концентрации 5 мкг/мл в отсутствие препарата HlyII, как описано в примере 1.

Флуоресценция пяти проб, приготовленных по способу, принятому за прототип, определяется следующим образом. Каждая проба, приготовленная, как описано в примере 1, отдельно обрабатывается концентрациями HlyII в 1, 2, 3, 5 и 10 мкг/мл соответственно в течение 10 минут при 20°С. Далее каждая пермеабилизованная проба отмывается от несвязавшегося с мембранами препарата HlyII. Затем каждая отмытая проба окрашивается пропидиум иодидом в концентрации 5 мкг/мл в течение 10 минут инкубации.

В сравнении с этим, флуоресценция в одной пробе, приготовленной по заявляемому способу пермеабилизации определяется следующим образом. Для определения уровня фоновой флуоресценции проба окрашивается пропидиум иодидом в концентрации 5 мкг/мл в отсутствии препарата HlyII в течение 10 минут. Далее в пробу через каждые 10 минут инкубации добавляются аликвоты препарата HlyII из исходного препарата 20 мкг/мл HlyII до конечных концентраций HlyII в 1, 2, 3, 5 и 10 мкг/мл соответственно. Фоторегистрация интенсивности флуоресценции всех тестируемых проб при 610 нм осуществляется через 2-3 минутные интервалы времени в течение 10-30 минут инкубации. Обработка изображений проб гладкомышечных клеток проводится с использованием программ Photoshop Adobe CS и Image J.

Оценка эффективности пермеабилизации гладкомышечных клеток (Пгмк) препаратами HlyII в опытной пробе, тестируемой по заявляемому способу, определяется по формуле:

Пгмк=(Фк-Ф0)/(Фм-Ф0)×100

где Ф0 - фоновое значение флуоресценции,

Фк-интенсивность флуоресценции одной пробы гладкомышечных клеток, которая обработана возрастающими концентрациями гемолизина II в 1, 2, 3 и 5 мкг/мл, Фм-интенсивность флуоресценции пробы, принятой за максимально пермеабилизованную, полученную обработкой 2×104 гладкомышечных клеток препаратом HlyII в концентрации 10 мкг/мл в объеме 1 мл ростовой среды при температуре 20°С в течение 10 минут инкубации. Статистическая обработка данных проводится с помощью пакета программ Microsoft Excel.

При обработке проб гладкомышечных клеток препаратом HlyII в концентрации 1 мкг/мл в течение 10 минут величина флуоресценции включенного в клетки пропидиум иодида в пробе, обработанной по способу прототипа и пробе, обработанной по заявляемому способу не отличается и составляет 30% максимально возможного. При обработке этих же проб в аналогичных условиях с применением препаратов HlyII в концентрации 2, 3, 5 и 10 мкг/мл величина флуоресценции в 4-х пробах, обработанных по способу прототипа и одной пробы, приготовленной по заявляемому способу, также не отличается и составляет соответственно 60, 90 и около 100% максимально возможного. При используемых в данном примере условиях оптимальный уровень пермеабилизации достигается обработкой гладкомышечных клеток препаратом HlyII в концентрации 3-5 мкг/мл.

Таким образом, уровень пермеабилизации в одной пробе гладкомышечных клеток, определенный при использовании заявляемого способа, соответствует по эффективности принятому за прототип способу пермеабилизации в 5 отдельных пробах гладкомышечных клеток. Следовательно, применение заявляемого способа в несколько раз уменьшает расходование выделяемого из организма клеточного материала и сокращает время обработки исследуемых клеток препаратами токсина и красителя пропидиум иодида.

Пример 4. Определение условий пороформирования HlyII в присутствии этидиум бромида, проводимое в одной пробе гладкомышечных клеток.

Заявляемый способ пермеабилизации клеток препаратом HlyII в одной пробе для подбора оптимальных условий их пермеабилизации повторяется при помощи окраски проб красителем этидиум бромидом, как описано в примерах 2-3.

Определяется флуоресценция 5 проб, приготовленных по способу прототипа, состоящему в их обработке концентрациями HlyII в 1, 2, 3, 5 и 10 мкг/мл, отмытии от HlyII и окрашивании этидиум бромидом в концентрации 5 мкг/мл. Определяется флуоресценция одной пробы, приготовленной по заявляемому способу, состоящему в обработке пробы увеличивающимися концентрациями HlyII в 1, 2, 3, 5 и 10 мкг/мл соответственно в присутствии 5 мкг/мл этидиум бромида. Величина флуоресценции в пробе, обработанной заявляемым способом, также соответствует величине флуоресценции проб, тестируемых способом, принятым за прототип. Таким образом, данные по тестированию проб в присутствии этидиум бромида подтверждают эффективность пермеабилизации проб гладкомышечных клеток препаратом HlyII с применением заявляемого способа.

В связи с тем, что использование существенных признаков заявляемого способа, включающих пермеабилизацию гладкомышечных клеток в одной пробе возрастающими концентрациями HlyII Bacillus cereus в присутствии флуоресцентных красителей в научно-технических источниках не обнаружено, можно сделать вывод, что данный способ отвечает критериям изобретения "новизна" и "существенные отличия".

Пояснение чертежа.

На чертеже представлены данные по повышению проницаемости мембран гладкомышечных клеток тонкого кишечника после обработки их препаратами с возрастающими концентрациями HlyII Bacillus cereus, при наличии в обрабатываемых пробах красителя пропидиум иодида, как описано в примерах 1-3.

Проба (0) - контрольная величина фоновой флуоресценции пробы гладкомышечных клеток в отсутствии препарата HlyII. Пробы 1, 2, 3, 5, 10 (черные столбцы) - флуоресценция 5 проб, приготовленных по способу пермеабилизации, принятому за прототип. Каждая проба обработана отдельно концентрациями HlyII в 1, 2, 3, 5 и 10 мкг/мл соответственно, каждая проба отмыта от несвязавшегося препарата HlyII и окрашена пропидиум иодидом в концентрации 5 мкг/мл. Проба 1, 2, 3, 5, 10 (светлые столбцы) - флуоресценция одной пробы, приготовленной по заявляемому способу пермеабилизации. Проба обработана увеличивающимися концентрациями HlyII в 1, 2, 3, 5 и 10 мкг/мл соответственно в присутствии 5 мкг/мл пропидиум иодида.

Способ пермеабилизации мембран гладкомышечных клеток тонкого кишечника, включающий обработку этих клеток пороформирующим гемолизином, отличающийся тем, что используют обработку гладкомышечных клеток HlyII из Bacillus cereus, при котором воздействуют на гладкомышечные клетки HlyII из Bacillus cereus в концентрации 3-5 мкг/мл.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ дифференциальной диагностики тяжелой бронхиальной астмы, включающий определение вентиляционной функции легких и исследование мононуклеаров, выделенных из венозной крови больного, с последующим расчетом индекса, характеризующего воспалительный процесс.
Изобретение относится к медицине, а именно к инфектологии, и может быть использовано для прогнозирования развития периваскулярных нарушений у больных гриппом. Сущность способа: у больных гриппом определяют возрастную группу, срок наблюдения и значение ристомицин-агрегации тромбоцитов в сыворотке крови в секундах.
Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, может быть использовано для прогнозирования развития «тлеющей» формы хронического лимфолейкоза. Сущность способа: проводят генотипирование полиморфного локуса - 248G>A гена Bcl-2 ассоциированного X белка (ВАХ - 248G>A).

Настоящее изобретение относится к медицине, в частности к медицинским, химико-токсикологическим исследованиям, и описывает способ подготовки пробы для газохроматографического определения тиодигликолевой кислоты в моче, включающий дериватизацию, извлечение тиодигликолевой кислоты из пробы этилацетатом, где дериватизацию тиодигликолевой кислоты проводят метанолом в присутствии концентрированной серной кислоты при температуре 80°C в течение 15 минут, а извлечение тиодигликолевой кислоты из пробы проводят этилацетатом путем жидкостно-жидкостной микроэкстракции в течение 5 минут, при этом все операции выполняют в одной емкости.
Изобретение относится к области медицины. Предложен способ определения инфицированности пациента вирусом клещевого энцефалита, основанный на обнаружении РНК вируса методом РТ - ПЦР.
Изобретение относится к медицине и предназначено для прогнозирования ответа на проводимую химиотерапию хронического лимфолейкоза. Проводят генотипирование полиморфного локуса 9360Т гена фактора роста эндотелия сосудов.

Настоящее изобретение относится к способу прогнозирования клинического течения лимфопролиферативных заболеваний кожи. Заявленный способ включает проведение гистологических исследований биоптатов пораженной кожи, исследование сыворотки периферической крови, определение пола, возраста, социально-профессиональной принадлежности, а также факторов, способствующих заболеванию, оценку прогностических коэффициентов каждого из указанных факторов и суммирование полученных значений.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ прогнозирования отслойки хориона и плаценты на ранних сроках беременности.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу скрининговой диагностики инсулинорезистентности. Способ основан на определении биохимических показателей сыворотки венозной крови, в которой ферментативным методом определяют показатели липидного спектра и глюкозы.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для выбора тактики лечения деструктивной формы острого панкреатита. В сыворотке крови определяют концентрацию прокальцитонина (ПКТ) с помощью количественного иммуноферментного анализа. Дополнительно оценивают тяжесть состояния пациента по шкале SAPS. Если уровень ПКТ не превышает 2 мкг/л, а оценка по шкале SAPS не превышает 5 баллов выбирают консервативную лечебную тактику с использованием в полном объеме комплексной интенсивной терапии; если оценка по шкале SAPS превышает 5 баллов, наряду с комплексной интенсивной терапией осуществляют лечебно-диагностическую лапароскопию. Если уровень ПКТ превышает 2 мкг/л, а оценка по шкале SAPS не превышает 5 баллов выбирают в случае локального процесса инфицирования операцию мини-доступа, а в случае распространенного процесса - открытую лапаротомию; если оценка по шкале SAPS превышает 5 баллов выбирают хирургическое вмешательство, при этом в случае локального процесса инфицирования осуществляют пункционно-дренирующую операцию, затем операцию мини-доступа, а в случае распространенного процесса - пункционно-дренирующую операцию, затем открытую лапаротомию. Способ позволяет повысить точность выбора хирургической тактики при лечении пациентов со стерильной и инфицированной формами панкреонекроза. 8 пр.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ прогнозирования популяционных нарушений биотрансформации чужеродных веществ, обусловленных воздействием техногенных химических факторов среды обитания. Производят отбор группы одной этнической популяции, проживающей на территории воздействия вредных химических факторов, отбирают пробы буккального эпителия, осуществляют выделение ДНК, проводят генотипирование полиморфного варианта 9893A/G гена CYP1A1, 921А/С гена CPOX и G308A гена TNF-альфа, устанавливают одно из следующих состояний гена: гетерозиготное, нормальное гомозиготное или минорное гомозиготное, рассчитывают коэффициент распространенности минорных аллелей для изучаемых генов по формуле и прогнозируют популяционные нарушения. Изобретение позволяет точно и достоверно прогнозировать популяционные нарушения биотрансформации чужеродных веществ, обусловленных воздействием техногенных химических факторов среды обитания, и может быть использовано для профилактического обеспечения путей защиты и стабилизации генома этнической популяции в условиях возрастающего загрязнения окружающей среды. 2 табл., 1 пр.
Изобретение относится к медицине и касается способа лабораторной диагностики развития инфекции у больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) в состоянии индуцированной нейтропении. Сущность способа состоит в том, что у больных в крови определяют количество С-реактивного белка (СРБ), и при отсутствии клинических проявлений инфекции и уровне СРБ<11 мг/л делают вывод об отсутствии инфекции, а>11 мг/л - диагностируют инфекционный процесс независимо от наличия лихорадки и/или очагов инфекции. Использование заявленного способа позволяет провести более точную и раннюю диагностику инфекционных осложнений, а также более четкий контроль эффективности антимикробной терапии у пациентов с ОЛЛ в состоянии нейтропении. 1 табл., 2 пр.
Настоящее изобретение относится к медицине и описывает способ определения содержания в тканях сердечно-сосудистой системы Ti, Al, включающий помещение образца ткани в емкость с добавлением азотной кислоты и выдержкой в течение 3 час при 75°С, последующее приливание перекиси водорода с выдержкой в течение 2 часов при той же температуре, добавление новой порции азотной кислоты с выдержкой 2 часа при температуре 110°С, добавление плавиковой кислоты и выдерживание в течение 18 часов при 20°С с последующим нагревом в течение 6 часов при 75°С и помещением в микроволновую печь, выпариванием и выполнением измерений методикой масс-спектроскопии с индуктивно связанной плазмой, при следующем соотношении компонентов, мас.%: НNО3 35, Н2О2 5, HF 13,3, деионизированная вода - остальное. 1 пр., 1 таб.

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и касается способа прогнозирования возникновения рецидивов при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ). Сущность способа состоит в том, что проводят гистологическое исследование фрагментов ткани удаленного легкого с главным, промежуточным или сегментарным бронхами, находящимися на расстоянии 4-5 см от опухоли, в респираторном эпителии бронхов определяют варианты дисрегенераторных изменений: базальноклеточную гиперплазию (БКГ), плоскоклеточную метаплазию (ПМ) и при наличии в смежном с опухолью эпителии бронхов сочетания базальноклеточной гиперплазии с плоскоклеточной метаплазией (БКГ+ПМ+) прогнозируют риск развития рецидива немелкоклеточного рака легкого. Использование заявленного способа позволяет повысить точность и информативность прогнозирования возникновения рецидивов при НМРЛ. 1 табл., 4 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для выявления высокого риска развития нарушения толерантности к глюкозе на фоне приема метопролола у больных стабильной стенокардией напряжения. Для этого до начала лечения метопрололом больному в один и тот же день проводят 2 теста с физической нагрузкой до достижения пороговой мощности нагрузки по одинаковому протоколу, исходно и через 2 часа после приема разовой дозы метопролола 50 мг. Если при выявлении при 2-й нагрузке по сравнению с 1-й нагрузкой увеличения на 120 секунд и более интервала времени от начала нагрузки до появления приступа стенокардии и/или снижения на электрокардиограмме сегмента ST ишемического типа глубиной не менее 1 мм, риск развития нарушения толерантности к глюкозе считают высоким. В таком случае через 4-5 недель регулярного приема метопролола проводят тест на толерантность к глюкозе. При выявлении нарушения толерантности к глюкозе лечение метопрололом прекращают. Если при 2-й нагрузке по сравнению с 1-й нагрузкой интервал времени до появления приступа стенокардии и/или снижения на электрокардиограмме сегмента ST ишемического типа глубиной не менее 1 мм увеличивается менее чем на 120 секунд, риск развития нарушения толерантности к глюкозе считают незначительным. В таком случае лечение метопрололом продолжают без дополнительного проведения теста на толерантность к глюкозе. Способ обеспечивает профилактику нарушений углеводного обмена у заявленной группы больных на фоне приема метопролола и возможность своевременной коррекции терапии за счет выявления компенсаторного увеличения использования глюкозы в условиях инсулинорезистентности и сниженной доступности свободных жирных кислот для обеспечения энергетических потребностей миокарда. 4 пр.

Изобретение применяют для оценки влияния цитомегаловирусной инфекции на содержание метгемоглобина в эритроцитах периферической крови беременной на третьем триместре гестации. Сущность способа: в периферической крови беременных с цитомегаловирусной инфекцией на третьем триместре гестации определяют количество эритроцитов, окрашенных 0,1% раствором метиленового синего, выполняющего роль переносчика электронов, и содержание метгемоглобина в эритроцитах. Если при титре антител к цитомегаловирусу 1:1600 будет наблюдаться увеличение числа окрашенных эритроцитов до 12,0±0,9%, а увеличение метгемоглобина до 1,5±0,42%, то оценивают нарушение восстановления метгемоглобина и угрозу насыщения гемоглобина эритроцитов кислородом. 2 ил.

Изобретение относится к медицине и касается способа персонифицированного подбора антиагрегантых препаратов больным, нуждающимся в подобном лечении, включающего забор крови больного, получение богатой тромбоцитами плазмы с помощью центрифугирования крови, разделение ее на пробы и введение в них антиагрегантных препаратов, имеющих различные механизмы антиагрегационного действия на тромбоциты с последующей инкубацией проб плазмы с препаратами при температуре 36,5-37,5°C и с индуктором агрегации тромбоцитов. Изобретение обеспечивает повышение точности подбора антиагрегантных препаратов больным, нуждающимся в подобном лечении. 2 пр., 5 ил.

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной диагностике. Предложен способ определения чувствительности опухоли легкого к терапии ингибиторами тирозинкиназ у пациентов с раком легкого в цитологическом опухолевом материале методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени при помощи праймеров для выявления 8 делеций в 19 экзоне гена EGFR и замены L858R гена EGFR в 21 экзоне. При выявлении любой из этих мутаций определяют чувствительность опухоли легкого к терапии ингибиторами тирозинкиназ как положительную и назначают терапию гефитинибом или эрлотинибом. Способ обладает высокой информативностью и чувствительностью, прост в исполнении и интерпретации результата. 2 ил., 2 табл., 1 пр.

Изобретение относится к медицине, в частности к педиатрии, а именно к способу дифференциальной диагностики гнойных и серозных менингитов у детей. Способ состоит в определении показателей микробицидной активности нейтрофильных лейкоцитов: ферментов миелопероксидазы, цитохромоксидазы, кислой фосфатазы в ликворе больных гнойным и серозным менингитами с помощью спектрофотометрического анализа. При значениях миелопероксидазы в пределах 0,18-0,2 усл.ед. диагностируют гнойный менингит, а при значениях 0,059-0,061 усл.ед. - серозный менингит. Показатель активности цитохромоксидазы в пределах 0,49-0,57 усл.ед. свидетельствует о гнойном менингите, в пределах 0,186-0,174 усл.ед. - о серозном менингите. Показатель активности кислой фосфатазы в ликворе в пределах 0,14-0,18 усл.ед. следует расценивать как гнойный менингит, а в пределах 0,069-0,071 усл.ед. - как серозный менингит. Использование заявленного способа позволяет повысить точность диагностики гнойных и серозных менингитов у детей. 1 табл., 2 пр.
Наверх