Способ элюции патогена с иммобилизованной магнитной матрицы


 


Владельцы патента RU 2535070:

Федеральное казённое учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Изобретение относится к медицине, в частности к элюированию сконцентрированного на магнитной матрице патогена. Способ элюции осуществляется следующим образом: 0,1 мл 10% взвеси магнитно-иммунного сорбента (МИС) туляремийного, чумного или бруцеллезного инкубируют с микробными взвесями возбудителей туляремии, бруцеллеза или чумы в течение 30 мин, удаляют надосадок, далее МИС инкубируют с 0,5 мл элюирующего раствора в течение 10 мин, pH элюата возвращают к физиологическому значению, проводят постановку реакции непрямой гемагглютинации или реакции агглютинации латекса. Технический результат: способ позволяет качественно элюировать патоген с магнитной иммобилизованной матрицы для последующего исследования в серологических реакциях и сохранять функциональную активность антитела на магнитной матрице для повторного использования. 3 пр., 1 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для элюирования сконцентрированного на магнитной матрице патогена из объектов окружающей среды с последующим его исследованием серологическими методами: реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и реакции агглютинации латекса (РАЛ).

Существуют разнообразные способы элюции микробных клеток с иммобилизованной матрицы. Например, использование буфера DETAC HaBEAD® и наборов CELLection. DETACHaBEAD® - буфер, содержащий поликлональные антитела, специфичные к Fab-фрагментам моноклональных антител, конъюгированных на Dynabeads (http://www.biochemmack.ru/product/magnetic/micro/). После инкубации с буфером DETACHaBEAD® частицы оказываются связанными с поликлональными антителами, а клетки высвобождаются. Они остаются жизнеспособными и экспрессия поверхностных маркеров не нарушается. Набор CELLection включает CELLection Dynabeads®, имеющие специфические антитела, конъюгированные с микрочастицами через нуклеиновую кислоту, и ферментативный буфер, расщепляющий ДНК-мостик. Использование набора CELLection позволяет удалить микрочастицы. Целевые клетки, выделенные с помощью набора CELLection, пригодны для цитометрического анализа и культивирования. Но данные элюирующие растворы подходят только для частиц, выпускаемых компанией Invitrogen (Dynal) (Норвегия).

Известен способ элюции, предложенный Матвеевой И.Н. с соавт. (2010). Разработчики данного способа рекомендуют использовать в качестве элюирующего буфера 0,1 М глицин HCl, pH 2,4 с последующей немедленной нейтрализацией 1 М раствором NaOH. Данный способ подходит только для хроматографического метода элюирования специфических антител с колонки с иммуносорбентом.

Для элюции белков-мишеней с микрочастиц могут быть использованы мягкие методы элюции. Так, белки можно элюировать буферами с низкими pH, такими как 0,12 М цитрат натрия (pH 2-3) в течение 2-х мин. Это обеспечит целостность белка при возвращении к физиологическим значениям pH. Ионная сила (концентрация солей), выбор элюирующего раствора и pH буфера для лизиса могут сильно повлиять на целостность антигена-мишени. Главную роль играет выбор элюента. Он зависит от многих факторов, таких как локализация активных центров антигена, необходимость сохранить ассоциацию субъединиц и другие белок-белковые взаимодействия. Так, например, буферы со слегка щелочным pH и низкой ионной силой обычно способствуют солюбилизации белков, а высокие концентрации солей и низкий pH могут вызвать денатурацию антигена и выпадение его в осадок из раствора. Неионные детергенты (например, Твин, Тритон Х-100, NP-40) обычно сохраняют нековалентные белок-белковые взаимодействия, а ионные детергенты (например, SDS или дезоксихолат натрия) обычно имеют денатурирующий эффект на белок-белковые взаимодействия и могут также повлиять на способность антител распознавать белок-мишень.

Для сохранения целостности антигена при подборе элюирующих растворов и условий элюции необходимо исследовать и оптимизировать большое количество параметров: состав и свойства самой матрицы, pH, молярность, объем элюирующих растворов, температурные и временные параметры инкубации.

Цель изобретения - разработать способ элюции патогена после его селективного концентрирования на магноиммуносорбенте (МИС) для последующего исследования серологическими методами и возможности повторного применения МИС (с сохранением его функциональной активности).

Первоначально была применена элюция раствором свободного лиганда с такой же степенью сродства к веществу, как у лиганда на сорбенте. Данная элюция может быть успешно осуществлена за счет многократного превышения концентрации свободного лиганда по сравнению с иммобилизованным. Для элюции использовались иммуноглобулины, выделенные из гипериммунных туляремийных, бруцеллезных и чумных сывороток, но в концентрации, в два раза превышающей концентрацию иммуноглобулинов, используемую для иммобилизации магнитной матрицы. В результате получен положительный эффект, но метод конкурентной элюции дорог, поскольку он связан со значительным расходом очищенного биологического препарата иммуноглобулинов.

Для реализации эксперимента применяли различные группы элюирующих реагентов (ферменты, детергенты, кислоты, щелочи, буферные растворы и прочие компоненты), отобрав те из них, которые отвечали определенным исследователями требованиям:

- отсутствие ложноположительных реакций с самим элюирующим реагентом;

- качественная элюция (максимальная чувствительность РНГА с элюированным патогеном);

- возможность многократного использования МИС после элюирования.

Из ферментов лучшие результаты получены при применении 1% пепсина, чувствительность в РНГА и РАЛ, при работе с МИС туляремийным, бруцеллезным и чумным, составила 1,25×106 - 6,25×105 м.к./мл. Из детергентов наилучшие результаты получены с 2% раствором Твин 20, чувствительность РНГА и РАЛ составила 1,25×106 - 3,125×105 м.к./мл. При использовании щелочей наилучшие результаты получены с 0,03 М раствором калия едкого, при этом чувствительность реакций составила 1,25×106 - 3,125×105 м.к./мл. Получены хорошие результаты с 60% раствором ацетонитрила, pH 8,5 и ТРИС-ЭДТА буфером, pH 8,9 и 0,1 М Трис (оксиметиламинометан).

Технический результат изобретения достигается тем, что в качестве эффективного элюирующего раствора, позволяющего проводить качественную элюцию (максимальная чувствительность РНГА с элюированным патогеном) и многократно использовать МИС после элюирования с отсутствием ложноположительных реакций с самим реактивом, используют 0,1 М Трис (оксиметиламинометан).

Способ осуществляется следующим образом. 0,1 мл 10% взвеси МИС туляремийного, чумного или бруцеллезного инкубируют с микробными взвесями возбудителей туляремии, бруцеллеза или чумы в концентрации 1×107 м.к./мл в течение 30 мин, удаляют надосадок, далее МИС инкубируют с 0,5 мл элюирующего раствора в течение 10 мин, pH элюата возвращают к физиологическому значению, проводят постановку РНГА и РАЛ. В таблице 1 представлены показатели элюции.

Таблица 1
Показатели элюции патогенов после инкубации с МИС
Элюент МИС pH Ложно-положительные результаты Чувствит. в РНГА, м.к./мл, после элюции Чувствит. в РАЛ, м.к./мл, после элюции Воспроизводимость Возможность многократного использования Воспроизводимость
1% пепсин туляремийный 4 нет 1,25×106 6,25×105 85% да 87%
бруцеллезный 6,25×105 1,25×106 84% 85%
чумной 1,25×106 6,25×105 82% 80%
2% раствор Твин 20 туляремийный 5,6 нет 1,25×106 1,25×106 89% да 90%
бруцеллезный 3,125×105 1,25×106 88% 89%
чумной 1,25×106 3,125×105 86% 87%
0,03 М КОН туляремийный 11,4 нет 3,125×105 6,25×105 90% да 92%
бруцеллезный 6,25×105 1,25×106 89% 90%
чумной 6,25×105 6,25×105 88% 89%
60% раствор ацетонитрила туляремийный 8,5 нет 1,25×106 1,25×106 93% да 91%
бруцеллезный 6,25×105 1,56×105 91% 90%
чумной 1,25×106 1,25×106 89% 89%
ТРИС-ЭДТА буфер туляремийный 8,9 нет 6,25×105 6,25×105 90% да 92%
бруцеллезный 1,25×106 1,25×106 90% 91%
чумной 6,25×105 1,25×106 90% 90%
0,1 М Трис (оксиметиламинометан) туляремийный 9,7 нет 3,125×105 6,25×105 94% да 95%
бруцеллезный 1,25×106 1,25×106 92% 94%
чумной 1,25×106 6,25×105 91% 92%

Таким образом, в результате проведенных исследований разработан способ элюции сконцентрированного на магнитной иммобилизованной матрице патогена с целью эффективной индикации возбудителей туляремии, бруцеллеза или чумы в РНГА и РАЛ и возможности повторного применения МИС.

Возможность практического применения заявляемого способа иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Элюция возбудителя туляремии с МИС и его контроль в РНГА и РАЛ

Для элюции 0,1 мл 10% взвеси МИС туляремийного инкубировали со взвесью туляремийного микроба в концентрации 1×107 м.к./мл в течение 30 мин, удаляли надосадок, далее МИС инкубировали с 0,5 мл элюирующего раствора (0,1 М Трис) в течение 10 мин, pH элюата возвращали к физиологическому значению, проводили постановку РНГА и РАЛ. Чувствительность в РНГА и РАЛ после элюции составила 3,125×105 м.к./мл и 6,25×105 м.к./мл, соответственно. Апробирована возможность повторного применения МИС туляремийного после элюции и отмывки. Получены положительные результаты, т.е. иммуноглобулины с магнитной матрицы не десорбировались.

Пример 2. Элюция возбудителя чумы с МИС и его контроль в РНГА и РАЛ

Получали аналогично примеру 1, используя, вместо туляремийного МИС чумной и соответствующий антиген. Чувствительность в РНГА и РАЛ после элюции составила 1,25×106 м.к./мл и 6,25×105 м.к./мл, соответственно.

Пример 3. Элюция возбудителя бруцеллеза с МИС и его контроль в РНГА и РАЛ

Получали аналогично примеру 1, используя вместо туляремийного МИС бруцеллезный и соответствующий антиген. Чувствительность в РНГА и РАЛ после элюции составила 1,25×106 м.к./мл.

Литература

1. http://www.biochemmack.ru/product/magnetic/micro/).

2. Матвеева, И.Н. Способ получения стандартной положительной панели сывороток крови для контроля качества иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям в биологических жидкостях организма крупного рогатого скота / И.Н. Матвеева, И.И. Кочиш, Н.А. Бондарева, С.В. Кузнецова, Н.К. Еремец, Л.С. Люлькова, И.А. Бараковский, Д.А. Салов, Е.В. Рахманина // Патент РФ №2392331, опубликован 20.06.2010, Бюл. №17.

Способ элюции патогена с иммобилизованной магнитной матрицы, заключающийся в том, что в качестве элюента используют 0,1 М трис (оксиметиламинометан), при этом 0,1 мл магноиммуносорбента (МИС) инкубируют с патогеном в течение 30 мин, удаляют надосадок, далее МИС инкубируют с 0,5 мл элюирующего раствора в течение 10 мин, pH элюата возвращают к физиологическому значению, проводят постановку реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) или реакции агглютинации латекса (РАЛ) и обеспечивают возможность повторного применения МИС.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционной иммунологии. Способ предусматривает использование для сенсибилизации твердой фазы противогриппозной вакцины, при том что визуализацию сформировавшихся в ходе инкубации сенсибилизированной поверхности иммуносорбента с тестируемой сывороткой, содержащей антитела к вирусу гриппа, комплексов антиген-антитело проводят при помощи оптически контрастного конъюгата G белок-углерод в течение 10-15 минут.
Изобретение относится к медицине, в частности к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития инфекционно-воспалительных осложнений у женщин с внутриматочной патологией после гистероскопии.
Изобретение относится к области вирусологии и касается штамма вируса гриппа H10N7-cyбтипа. Охарактеризованный штамм вируса гриппа A/pochard/Siberia/249/08-МА H10N7-субтипа выделен из клоакального смыва красноголового нырка и адаптирован к линии BALB/c мышей.

Изобретение относится к штамму вируса иммунодефицита человека, принадлежащему к субтипу B, и может быть использовано в вирусологии, медицине и биотехнологии. Представленный штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВ735 субтипа В депонирован в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им.

Изобретение относится к области фармацевтики. Создана иммуногенная композиция, способная индуцировать иммунный ответ в отношении по меньшей мере двух штаммов и/или серотипов Streptococcus uberis, включающая по меньшей мере один выделенный и/или рекомбинантный белок, имеющий определенную аминокислотную последовательность, полученный способом, включающим трансформацию прокариотической, эукариотической клеток или микроорганизма, такого как бактерия, дрожжи или грибы, конструкцией нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный протеин, рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, рекомбинантный носитель и/или их иммуногенную часть, производное и/или аналог.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ определения неспецифической устойчивости патогенных микроорганизмов к антибиотикам и факта присутствия бактериальных биопленок на основании измерения каталитической активности фосфодиэстераз, расщепляющих циклический дигуанозинмонофосфат, с пороговой чувствительностью 50 пг/мл, включающий: 1) выделение фосфодиэстеразы-мишени из лизированных бактериальных клеток; 2) связывание фосфодиэстеразы биотинилированными антителами, специфичными к некаталитическим доменам фосфодиэстеразы; 3) аффинную очистку комплексов, сформированных фосфодиэстеразой-мишенью и биотинилированным антителом при помощи парамагнитных частиц, содержащих нейтравидин или его аналоги, связывающие биотин; 4) взаимодействие комплексов фосфодиэстераза/биотинилированное антитело, иммобилизованных на парамагнитных частицах, с комплексами, содержащими с-di-GMP в форме G-квадруплексов с интеркалированным красителем, сопровождающееся падением интенсивности флуоресценции по мере разрушения комплексов интеркалирующего красителя c-di-GMP; 5) измерение падения флуоресценции при гидролизе c-di-GMP и разрушении комплекса c-di-GMP с интеркалирующим красителем с последующим количественным определением активности фосфодиэстеразы на основании калибровочных кривых, построенных с использованием известных количеств рекомбинантного фермента фосфодиэстеразы, идентичного исследуемой мишени; 6) выявление повышенного уровня фосфодиэстеразной активности, обнаруживаемого тестируемыми антибиотикоустойчивыми бактериальными штаммами, способными к формированию биопленок, по сравнению с уровнем фосфодиэстеразной активности, обнаруживаемым для контрольных штаммов бактерий того же вида, не обладающих антибиотикоустойчивостью и способностью к формированию биопленок.

Изобретение относится к штамму вируса иммунодефицита человека, принадлежащему к субтипу А, и может быть использовано в вирусологии, медицине и биотехнологии. Штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВ742 депонирован в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им.

Изобретение относится к штамму вируса иммунодефицита человека, принадлежащему к субтипу А, и может быть использовано в вирусологии, медицине и биотехнологии. Представленный штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВ710 депонирован в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им.
Изобретение относится к вирусологии и биотехнологии, в частности к культивированию клеток с целью изучения вирусов и конструирования новых антигенных препаратов.

Изобретение относится к вирусологии, в частности к области культивирования клеток и тканей для наработки и изучения вирусов. Целью изобретения является получение штамма клеток синовиальной мембраны поросенка (СМП), стабильного по биологическим характеристикам, пригодного для вирусологических и диагностических исследований, обладающего чувствительностью к вирусам-возбудителям болезням свиней, таких как африканская и классическая чума, болезнь Ауески.

Изобретение относится к медицине и касается способа проведения иммунохроматографического анализа с диссоциирующей флуоресцентной меткой, в котором на мембранной тест-полоске формируют комплексы, в состав которых входят молекулы антигена или антигенов, специфичные к ним антитела и молекулы метки.
Изобретение относится к медицине и касается способа количественного определения D-антигена полиовирусов 1-3 типов иммуноферментным анализом (ИФА). В качестве иммуносорбента используют поливалентный (к трем типам полиовируса) аффинно очищенный иммуноглобулин класса Y (IgY), полученный из яичных желтков куриц, иммунизированных полиовирусами, а в качестве детекторных антител - аффинно очищенный препарат IgG кролика против каждого из трех полиовирусов.

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использовано для оценки угрозы формирования гипоксии у беременных с обострением цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации.

Изобретение относится к области медицины, в частности к неврологии, и может быть использовано для прогноза течения ишемического инсульта у больных сахарным диабетом.
Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, и позволяет проводить морфологическую дифференциальную диагностику трофобластической, эндометриальной и смешанной формы первичной плацентарной недостаточности при самопроизвольном прерывании беременности в первом триместре.

Изобретение относится к области медицины, в частности к нейрохирургии, и касается способа диагностики опухоли мозга у пациентов. Сущность способа: в забранной крови определяют процентное количество CD25-лимфоцитов.
Изобретение относится к медицине, а именно к оториноларингологии и иммунологии, и может быть использовано для патогенетического лечения хронического тонзиллита и/или гипертрофии небных миндалин у детей дошкольного возраста с лимфопролиферативным синдромом.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу качественной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований слизистой оболочки дна полости рта.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу выделения ДНК Mycoplasma hominis (М. hominis) для дальнейшего применения в диагностическом алгоритме.
Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ прогнозирования риска развития врожденных инфекций путем определения количества специфических антител классов Ig М и Ig G в биологическом материале, отличающееся тем, что в качестве биологического материала используют мазок со слизистой оболочки цервикального канала при первичном обследовании в сроке до 12-й недели гестации, одновременно в мазках определяют количество антител Ig М и Ig G к вирусу краснухи, цитомегаловирусу, парвовирусу B19V, токсоплазмам, вирусу простого герпеса 1 и 2 типов и величины авидности специфических Ig G к этим возбудителям, дополнительно в том же мазке определяют уровень секреторного неспецифического Ig A методом РИФ к антигенам цитомегаловируса, хламидий, микоплазм, и генетического материала этих микроорганизмов методом ПЦР и в зависимости от полученных результатов прогнозируют группы высокого, умеренного или низкого риска развития врожденных инфекций.
Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской диагностике, и описывает способ качественной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований слизистой оболочки губы по содержанию биомаркеров в ротовой жидкости пациента. Способ включает забор ротовой жидкости у пациента, центрифугирование ротовой жидкости пациента при 3000 об/мин в течение 15 минут, разбавление ротовой жидкости физиологическим раствором в соотношении 1:100, повторное центрифугирование при 3000 об/мин в течение 15 минут, размещение готового для исследования материала ротовой жидкости пациента в кювету и выполнение стандартного метода иммуноферментного анализа на плашке на основе моноклональных антител. В качестве независимых биомаркеров выбирают матриксную металлопротеиназу 8/matrix metalloproteinase 8 (ММП 8/ММР 8) и матриксную металлопротеиназу 9/matrix metalloproteinase 9 (ММП 9/ММР 9). Способ характеризуется высокой точностью и чувствительностью дифференциальной экспресс-диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований слизистой оболочки губы, упрощением подготовки пациента для забора и хранения диагностического материала, возможностью получения результата в день обращения пациента, высокой вероятностью выявления доброкачественных и злокачественных новообразований в организме пациента как на ранних, так и на более поздних стадиях заболевания. Изобретение может быть использовано в дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных новообразований органов полости рта в условиях стоматологических, онкологических и хирургических лечебных заведений. 2 з.п. ф-лы, 6 пр.
Наверх