Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации днк бокавируса человека



Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации днк бокавируса человека
Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации днк бокавируса человека
Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации днк бокавируса человека
Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации днк бокавируса человека
Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации днк бокавируса человека

 


Владельцы патента RU 2541772:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"" (ФГБУН ГНЦ ВБ "Вектор") (RU)

Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для детекции ДНК бокавируса человека. Указанный набор содержит прямой праймер 5'-ATCCWCTTGADAACGGTRAACC-3', обратный праймер 5'-RGGRATAAAGAGMGAGCYCAA-3' и флуоресцентно-меченый ДНК-зонд 5'-Cy5-CGCCGTGGCTCCTGCTC-BHQ2-3'. Изобретение обеспечивает надежную и достоверную детекцию бокавируса человека в клинических образцах и других биологических материалах методом ПЦР. 2 ил., 3 табл.

 

Изобретение относится к наборам праймеров и флуоресцентно-меченного зонда для выявления генетического материала (ДНК) бокавируса человека в клинических образцах, секционных пробах, образцах окружающей среды, культуральных вируссодержащих жидкостях и прочих биопрепаратах с целью постановки диагноза, коррекции лечения, эпидемиологического расследования, а также для решения научно-исследовательских задач по мониторингу и изучению свойств коронавируса, созданию диагностических, профилактических и лечебных препаратов и может быть использовано в медицине, биотехнологии и эпидемиологии.

При помощи разработанных диагностических праймеров и флуоресцентно-меченных зондов возможно выявление генетического материала (ДНК) бокавируса человека.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) является наиболее распространенным методом, используемым в лабораторной практике для дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний. В ПЦР происходит многократное избирательное удвоение целевого участка ДНК (амплификация). Амплифицируемый участок ДНК является маркерным, так как строго ограничен последовательностями ДНК-затравок (праймеров) без которых невозможно протекание ПЦР. Для детекции накопления продуктов амплификации в режиме реального времени помимо пары праймеров необходим также флуоресцентно-меченый ДНК-зонд. Сложность выбора праймеров и зонда обусловлена требованием их строгой видоспецифичности. В случае если выбранные олигонуклеотиды не обладают видовой специфичностью к целевому объекту, либо не обладают достаточной гомологией к целевой нуклеотидной последовательности, возможны ложноотрицательные результаты исследования. В случае если выбранные праймеры и зонды демонстрируют сродство к нецелевым последовательностям ДНК, то возможны ложноположительные результаты исследования. Правильный выбор сочетания пары праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет осуществить строго специфическую амплификацию целевого фрагмента кДНК и провести детекцию накопления продуктов ПЦР в режиме реального времени.

Известны зарубежные аналоги, представляющие собой наборы праймеров, обеспечивающих специфичный синтез фрагментов на матрице геномной ДНК бокавируса. В патенте Китая № CN 102329887, опубл. 2012 г.) опубликованы олигонуклеотиды для ПЦР в реальном времени, дизайн которых проводился на основе двух геномных последовательностей бокавируса человека (номера в GenBank: NC 007455, EF 441262).

В патентах Китая № CN 101550452, опубл. 2009 г., Кореи № KR 20080111661, опубл. 2008 г., заявке США № US 20120178079, опубл. 2012 г. опубликованы наборы реагентов для детекции бокавируса человека методом ПЦР в реальном времени.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является набор праймеров для детекции ДНК бокавируса человека методом ПЦР "АмплиСенс®ОРВИ-скрин-FL" (http://www.pacxodka39.ru/product_3056.html ЦНИИ Эпидемиологии, г.Москва). Набор реагентов предназначен для выявления возбудителей острых респираторных вирусных инфекций человека (ОРВИ): РНК респираторно-синцитиального вируса, метапневмовируса, вирусов парагриппа 1-4 типов, коронавирусов, риновирусов, ДНК аденовирусов групп В, С и Е и бокавируса в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Бокавирус был открыт недавно, в 2005 г., в Швеции и в международной базе данных имеется сравнительно немного секвенированных последовательностей генома бокавируса человека. С разработкой и широким внедрением в практику так называемого неспецифического секвинирования в международной базе данных GenBank каждый день появляются новые нуклеотидные последовательности геномов бокавируса человека, отличающиеся друг от друга по наличию полиморфизма (точечных мутаций).

Однако номенклатура известных праймеров и зондов для ПЦР-диагностики всех циркулирующих в настоящее время бокавирусов человека в природе явно недостаточно, чтобы решить проблемы диагностики указанных вирусных инфекций.

Техническим результатом заявляемого изобретения является расширения спектра импортозамещающих олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченных зондов, позволяющих идентифицировать бокавирус человека, методом ПЦР в реальном времени.

Указанный результат достигается разработкой набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для детекции ДНК бокавируса человека, содержащего пару олигонуклеотидных полимеров, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также флуоресцентно-меченый ДНК-зонд. Указанные олигонуклеотиды имеют следующую структуру:

В рамках заявляемого технического решения разработанные праймеры и ДНК-зонды обладают высокой степенью гомологии ко всем известным нуклеотидным последовательностям геномов изолятов бокавируса человека, доступным в международной базе данных биотехнологической информации GenBank.

Апробация олигонуклеотидов была осуществлена с использованием назофарингеальных смывов от пациентов с симптомами ОРВИ (порядок проведения исследования одобрен этическим комитетом ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (IRB 00001360)). Экспериментально было показано, что выбранные праймеры и ДНК-зонд обеспечивают надежный синтез целевых ДНК-фрагментов. Специфичность амплификации дополнительно подтверждали секвенированием.

Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной ДНК. Предлагаемые к патентованию праймеры фланкируют участок гена, кодирующего вирусный гликопротеин 1 (VP41-ген). В ПЦР амплифицируется фрагмент генома с 3123 по 3362 нуклеотид (239 п.н.). Использование в комплекте с диагностическими праймерами флуоресцентно-меченного ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени.

Важно отметить, что оптимизация условий проведения ПЦР осуществлялась с использованием наборов коммерчески доступных реагентов, приборов и ферментов, предназначенных для массового использования в лабораторной практике, что позволяет быстрое и надежное применение данного изобретения в медицинских и научно-исследовательских лабораториях.

Перечень графических материалов

На фиг.1 представлены графики оптимизации ПЦР-РВ по концентрации флуоресцентно-меченого ДНК-зонда в реакционной смеси с использованием плазмидной конструкции pBoV.

На фиг.2 приведены графики исследования назофарингеальных смывов от людей с симптомами ОРВИ. В образце №2 обнаружена ДНК бокавируса человека.

Методика конструирования набора диагностических праймеров и флуоресцентно-меченных зондов

На основе теоретического изучения структуры генома бокавируса человека, на консервативную область гена вирусного гликопротеина 1 (VP1-ген) были рассчитаны и синтезированы праймеры и флуоресцентно-меченый ДНК-зонд для проведения полимеразной цепной реакции (таблица 1). В ходе работы было проанализировано 1356 имеющихся в базе данных нуклеотидных последовательностей генома бокавируса человека.

Таблица 1
Праймеры и зонды для детекции бокавируса человека
Вирус Последовательность в GenBank Локализация Нуклеотидная последовательность 5'-3' Tm, °C ПЦР-продукт, п.н.
BoV NC_007455.1 3123-3144 ATCCWCTTGADAACGGTRAACC 50.6 239
3362-3341 RGGRATAAAGAGMGAGCYCAA 50.1
3322-3338 Cy5-CGCCGTGGCTCCTGCTC-BHQ2 57.4

Методика получения положительных контрольных образцов

Положительные контрольные образцы были получены методом TOPO-T/A клонирования. После чего компетентные клетки Е. coli линии TOP 10 (Invitrogen, США) были трансформированы полученными плазмидами pCR2.1 (Invitrogen, США), несущими вирусспецифическую вставку синтезированных фрагментов ДНК. В ходе проделанной работы была сконструирована рекомбинантная плазмида: pBoV. Наличие специфической к вирусному геному ДНК-вставки подтверждали секвенированием.

Анализ эффективности проведенной трансформации осуществляли проведением ПЦР в режиме реального времени в соответствии с протоколом, описанным ниже, где в реакционную смесь в качестве положительного образца добавляли 1×TE-буфер, содержащий рекомбинантную плазмиду pBoV, со встройкой вирусспецифического синтезированного ДНК-дуплекса. В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь добавляли 1×TE-буфер.

Экстракция вирусной ДНК

Вирусную ДНК выделяли из 100 мкл назофарингеального смыва с использованием набора «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИЭ, г.Москва) согласно инструкции производителя.

Проведение полимеразной цепной реакции

Условия проведения амплификации оптимизировали по концентрации ионов магния, концентрации праймеров и зонда (фиг.1) в реакционной смеси, температуре отжига праймеров. На фиг.1 представлена оптимизация ПЦР-РВ по концентрации ДНК-зонда в реакционной смеси с использованием плазмидной конструкции pBoV. Оптимальная концентрация флуоресцентно-меченного ДНК-зонда подобрана в реакционных смесях для ПЦР №1 и 2 (8 пМ и 7 пМ в реакции).

Реакцию амплификации проводили в 30 мкл смеси для ПЦР (таблица 2), содержащей 1×Taq буфер для амплификации, 2.5 мМ MgCl2, 0.17 мМ каждого из нуклеозидтрифосфатов, 1.5 активных единиц Smart Taq ДНК-полимеразы (все компоненты ООО «Лаборатория МЕДИГЕН»), 20 пМ прямого и обратного праймеров, 8 пМ флуоресцентного ДНК-зонда.

Таблица 2
ПЦР-смесь (из расчета на одну пробирку)
Компонент Объем, мкл
ПЦР-буфер × 10 3
дНТФ (5 мМ) 1
MgCl2 (50 мМ) 1.5
Hot Start Taq ДНК-полимераза (5 а.е./мкл) 0.3
Прямой праймер - F (10 нМ) 2
Обратный праймер - R (10 нМ) 2
ДНК-зонд - Z(15 нМ) 0.5
Образец 3
diH2O 16.7

ПЦР в режиме реального времени проводили согласно программе амплификации таблица 3. Детекцию интенсивности флуоресценции проводили по каналу - Red 625/660 нм (краситель Cy5). Измерение флуоресценции проводили на приборах "Rotor Gene 6000" (Corbet Research, Австралия) и iQ5 (BioRad, США). Результаты оценивали по наличию флюоресценции до 30 цикла (фиг.2). На фиг.2 приведены графики исследования назофарингеальных смывов от людей с симптомами ОРВИ. В образце №2 обнаружена ДНК бокавируса человека.

Примечание: 1 - положительный контрольный образец (плазмида со вставкой вирусспецифического фрагмента pBoV);

2 - исследуемый образец (назофарингеальный смыв от человека);

3 - отрицательный контрольный образец (1×ТЕ буфер);

Предлагаемые нами к патентованию праймеры и зонд были апробированы в эпидемиологическом исследовании по изучению видового разнообразия вирусных агентов, вызывавших ОРВИ у жителей г. Новосибирска и Новосибирской области в октябре-апреле 2011-2012 гг. Нами было исследовано 164 образца назофарингеальных смывов от пациентов с симптомами острой респираторной вирусной инфекции. Этиологический агент заболевания был нами установлен в 43% случаев (69 образцов). Бокавирус в исследуемых образцах был выявлен в 2% случаев (3 образца). В структуре сочетанных инфекций бокавирус был выявлен нами в 21,7% случаев (5 образцов из 11). Специфичность ПЦР-исследования дополнительно подтверждали секвенированием.

Таким образом, заявляемый набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда обеспечивает наравне с известными аналогами надежную и достоверную детекцию бокавируса человека в клинических образцах и других биологических материалах.

Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для детекции ДНК бокавируса человека, содержащего пару олигонуклеотидных полимеров, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также флуоресцентно-меченый ДНК-зонд:
- прямой праймер (forward primer) 5'→3'

F: 5'-ATCCWCTTGADAACGGTRAACC-3' (22 н.)

- обратный праймер (reverse primer) 5'→3'
R: 5'-RGGRATAAAGAGMGAGCYCAA-3' (21 н.)

- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (probe) 5'→3'
Z: 5'-Cy5-CGCCGTGGCTCCTGCTC-BHQ2-3' (17 н.)



 

Похожие патенты:

Изобретение касается способа определения биологической активности эмбрионированных яиц Trichuris. Охарактеризованный способ включает осуществление по меньшей мере 3-х анализов, выбранных из: - оценки и/или подтверждения стадии эмбрионального развития яиц с помощью метода количественной ПЦР с использованием пригодных маркерных последовательностей для определения количества копий геномной ДНК, - оценки метаболической активности эмбрионированных яиц с помощью биохимических и/или молекулярно-биологических методов, - оценки индуцибельности генной экспрессии в эмбрионированных яйцах, - оценки подвижности личинок Trichurs с помощью микроскопа в течение продолжительных периодов наблюдения после предварительной инкубации при повышенных температурах и/или - оценки коэффициента вылупляемости личинок Trichuris в организме лабораторного животного.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии. Описан способ выявления геномной РНК вируса болезни Ибараки (ВБИ) с помощью ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени с использованием олигонуклеотидных праймеров и зонда, комплементарных участку 10 сегмента генома ВБИ, кодирующему неструктурные белки NS3 и NS3a.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу пренатальной и постнатальной ДНК-диагностики синдрома Дауна, Эдвардса и Патау, мутации delF508 в гене муковисцидоза и резус-фактора плода методом количественной флюоресцентной полимеразной цепной реакции.

Группа изобретений относится к области генетики, молекулярной биологии, судебной медицины и криминалистики и касается инструмента для определения гаплогрупп Y-хромосомы человека.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ предсказания ответа субъекта на терапевтическое средство для лечения ревматоидного артрита (RA).

Изобретение относится к области биохимии. Предложен олигонуклеотидный зонд с комплементарными концевыми последовательностями по типу "молекулярного маяка", обеспечивающий флуоресцентную детекцию при идентификации возбудителя кокцидиоидомикоза Coccidioides posadasii методом ПЦР с олигонуклеотидными праймерами CpSOW82s/CpSOWS2as, комплементарными фрагменту гена SOWgp82 С.

Группа изобретений относится к области генной инженерии. Копии секвенируемой молекулы ДНК помещают в четыре раствора, каждый из которых характеризуется сниженной концентрацией одного из нуклеотидов, по сравнению с остальными тремя нуклеотидами, во время проведения полимеризации ДНК в каждом из растворов регистрируют факты выделения ионов с помощью сенсоров на основе МДП-структур.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биохимии, иммунологии и генетической инженерии. Предложена композиция для определения разнообразия CDR3 последовательностей TCRB или IGH в образце.

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим исследованиям биологических объектов. Набор состоит из лизирующего буфера на основе 3-10 М раствора мочевины, связывающего буфера на основе 2,5-5 М хлористого натрия, элюирующего буфера на основе раствора 10 мМ Трис-HCl и 1 мМ Трилона Б с pH 8 и 80% этилового спирта в качестве отмывочного буфера.

Представлены наборы олигонуклеотидных зондов и праймеров, биологический микрочип и тест-система для идентификации и типирования вируса гриппа А и В. Охарактеризованная тест-система содержит: набор реагентов для выделения РНК вируса гриппа из биологического материала человека; набор реагентов для проведения ПЦР-амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией, с образованием флуоресцентно-меченных фрагментов генома вируса гриппа, содержащий описанные олигонуклеотиды-праймеры; набор реагентов для проведения гибридизации фрагментов ДНК, полученных после проведения амплификации на биочипе, содержащем элементы с иммобилизованными описанными олигонуклеотидными зондами; и при необходимости, отрицательный и положительный контрольные образцы.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации РНК респираторно-синцитиального вируса человека. Указанный набор содержит две пары олигонуклеотидных праймеров и два флуоресцентно-меченых ДНК-зонда, а именно внешний прямой праймер 5'-AGRCARCARAGTTAYTCYATYATGTC-3', внешний обратный праймер 5'-AATTTATTATWGGTTYMCCYTTTACATA-3', прямой праймер 5'-GACACHATGAAYAGYTTRACATTACC-3', обратный праймер 5'-AAATGTYTTTATDATYCCRCGATTT-3', зонды 5'-FAM-TCTCTAGGAGCCATTGTGTCATGCTATGG-BHQ1-3' и 5'-FAM-TCTCTWGGAGCYATAGTGTCATGYTATGG-BHQ1-3'. Изобретение обеспечивает надежную и достоверную детекцию респираторно-синцитиального вируса человека в клинических образцах и других биологических материалах методом ПЦР. 1 ил., 5 табл.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биохимии. Предложена димерная наноструктура, способ её конструирования, способ детектирования аналита и набор для детектирования аналита. Изобретение позволяет повысить чувствительность и точность детектирования единичных молекул. 4 н. и 19 з.п. ф-лы, 6 ил., 4 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору реагентов и способу для выявления ДНК возбудителей чумы, сибирской язвы и туляремии. Набор содержит шесть видоспецифичных олигонуклеотидных праймеров и три зонда, комплементарных фрагментам ДНК генов Yersinia pestis, Bacillus anthracis и Francisella tularensis. ДНК-мишенями для специфической амплификации являются фрагмент хромосомного гена уро2088 метилтрансферазы Yersinia pestis, фрагмент хромосомного гена sspE Bacillus anthracis и фрагмент хромосомной ДНК элемента вставки ISFtu5 Francisella tularensis. Изобретение позволяет быстро и высокоспецифично выявлять штаммы видов Y. pestis, B. anthracis и F. tularensis, независимо от плазмидного профиля штаммов. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 5 табл., 2 пр.

Группа изобретений относится к области биотехнологии, в частности к автоматическому устройству и способу очистки и выделения целевой нуклеиновой кислоты из биологического образца, причем устройство обеспечивает возможность предотвратить загрязнение выделенной целевой нуклеиновой кислоты от аэрозоля и которое может быть применено ко всем видам оборудования выделения и очистки нуклеиновых кислот из множества биологических образцов, использующего магнитный стержень или мультипипеточный блок, движущийся в двух или трех осевых направлениях. Группа изобретений обеспечивает повышение качества очистки выделенных из биологического образца целевых нуклеиновых кислот от загрязнения их аэрозолем, образующимся из биологического образца, содержащего целевую нуклеиновую кислоту в высокой концентрации, для обеспечения более точных результатов последующих исследований выделенных целевых нуклеиновых кислот. 2 н. и 17 з.п. ф-лы, 19 ил.

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологии. Предложен способ количественного определения видового состава пропионовых бактерий, обитающих на коже человека. Способ предусматривает получение образца, выделение из него ДНК и проводение количественной ПЦР-реакции. Реакцию осуществляют с праймерами GCG TGA GTG ACG GTA ATG GGT A, TTC CGA CGC GAT САА ССА, FAM-AGC GTT GTC CGG АТТ TAT TGG GCG-BHQ1, АСА TGG АТС CGG GAG СТТ С, АСС САА CAT CTC ACG АСА CG, R6G-CGG TTC АСА GGT GGT GCA TTG GC-BHQ2, GTC TGC AAC TCG АСС ССА Т, AGT ССТ ААТ ТАС CAG ТСС САС, ROX-ACC TGT GTG GGG GAG CCG TCG AAG-BHQ2, AGA ACT CTG AGC GCT AGC TGT AG, CGT AGA ACT AGC TGT AGC GCA, Cy5-AG CGG CTC СТА СТТ CTG CAG GGG-BHQ2. Способ позволяет сократить время исследований и дать количественную оценку видового разнообразия пропионовых бактерий, присутствующих на коже человека. Изобретение может быть использовано в медицине. 2 табл.

Группа изобретений касается дискриминирующего мишень зонда (TD-зонду), способа его конструирования и способов детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени с его использованием. TD-зонд гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью как через 5'-концевой второй участок гибридизации, так и 3'-концевой первый участок гибридизации. Когда TD-зонд гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью, не являющейся мишенью, тогда и 5'-концевой второй участок гибридизации, и разделительный участок оба не гибридизуются с нуклеиновокислотной последовательностью, не являющейся мишенью, так что оба участка образуют одиночную цепь вследствие низкой величины своей Тпл. Представленные изобретения позволяют повысить специфичность гибридизации и могут быть использованы в области клинической диагностики и генетических исследований. 7 н. и 32 з.п. ф-лы, 14 ил., 9 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологи. Предложен набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых ДНК-зондов для идентификации РНК энтеровирусов, риновирусов, вирусов гепатита А и Е в образцах воды из окружающей среды методом мультиплексной ПЦР. Изобретение может быть использовано в вирусологии и эпидемиологии. 4 ил., 2 табл.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации РНК метапневмовируса человека методом ПЦР в реальном времени, содержащему четыре прямых олигодезоксирибонуклеотидных праймера и два обратных олигодезоксирибонуклеотидных праймера, а также два флуоресцентно-меченых ДНК-зонда. Изобретение позволяет наравне с известными аналогами провести надежную и достоверную детекцию метапневмовируса человека в клинических образцах и других биологических материалах. 1 ил., 3 табл.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации риновирусов человека видов А, В и С, методом ПЦР в реальном времени, содержащему два прямых и два обратных олигодезоксирибонуклеотидных праймера и два флуоресцентно-меченых ДНК-зонда. Изобретение позволяет наравне с известными аналогами провести надежную и достоверную детекцию риновируса человека в клинических образцах и других биологических материалах. 2 ил., 3 табл.

Изобретение относится к генетике, медицине и молекулярной биологии. Предложен способ неинвазивной диагностики анеуплоидий плода на основе использования геномных библиотек. Изобретение позволяет повысить чувствительность и селективность определения анеуплоидии плода. 22 з.п. ф-лы, 4 пр.
Наверх