Внк-21/13-13-перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вируса ящура и вируса бешенства

Изобретение относится к области биотехнологии. ВНК-21/13-13 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка задепонированна в Российской коллекции клеточных культур (РКК) в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН) под №89 и предназначена для репродукции вируса ящура типа А, О, С, Азия-1, CAT-1, CAT-2, CAT-3 и вируса бешенства штамм «Щелково-51», используемых для изготовления противовирусных вакцин против ящура и бешенства. Результат, достигаемый при использовании данной клеточной культуры, заключается в повышении иммуногенности, инфекционности и концентрации клеток ВНК-21/13-13 при промышленном суспензионном культивировании в биореакторах. 1 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии, сфере суспензионного культивирования перевиваемых культур клеток ВНК-21 и может быть использовано для репродукции вируса ящура типа А, О, С, Азия-1, CAT-1, CAT-2, САТ-3 и вируса бешенства штамм «Щелково-51», в свою очередь используемых для изготовления противовирусных вакцин против ящура и бешенства.

Уровень техники

Из уровня техники известна перевиваемая линия клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 клон 13, полученная в 1961 году в Англии Макферсоном и Стокером /Macpherson J, Stoker M. - Syrian hamster fibrolast cell line ВНК-21 snd its derivatives. - Nature, 1964, 203, 1355-1357/.

Известны следующие аналоги клеток почки хомячка.

1. ВНК-21/13 - сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка, полученная в Институте полиомиелита.

2. ВНК21/13 - сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка, полученная в НИИС;

3. ВНК-21 /2-17а - перевиваемый монослойно-суспензионный клон клеток, получен во ВНИЯИ;

4. ВНК-21/13-02 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вируса ящура и вируса бешенства, получена ФГУП «Щелковский биокомбинат».

Ниже представлено более подробное описание аналогов.

1. ВНК-21/13 - сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка поддерживалась в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР / С.Г. Юрков, В.В. Зуев и др. "Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ" - Покров. - 2000 г. - с. 60/.

Среда культивирования. Адаптирована к выращиванию в пристеночных культурах. Клетки отделяют от стекла с помощью 0,25% раствора трипсина, подогретого до 37°C.

Ростовые свойства. При пересеве с коэффициентом 1:2-1:3 монослой формируется на 2-3 сутки после эксплантации. При условии коррекции рН среды до 7,5-7,6 сформированный монослой сохраняется до 5-6 дней. В литровом матрасе РУ накапливается 40-45 млн клеток.

Морфология. Клетки фибробластоподобные.

Кариология. Культура резко гетероплоидная с вариабельностью хромосомных наборов от 32 до 78. Стволовую линию (модальный класс) составляют клетки с 40 хромосомами (32-34%), 4-6% клеток в популяции сохраняют диплоидный набор хромосом.

Среда замораживания. Среда культивирования (90%), диметилсульфоксид (10%).

Восстановление после хранения в жидком азоте. Жизнеспособность в пределах 85-95%. Культуры восстанавливают исходные ростовые свойства на 2-3 пассаже.

2. ВНК21/13 - сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка, получена в НИИС / С.Г. Юрков, В.В. Зуев и др. "Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ" - Покров. - 2000 г. - с. 6-1/.

Среда культивирования. Для суспензионного выращивания применяют среду Игла-МЕМ, обогащенную 120 мг/л серина и 610 мг/л глутамина с добавлением 0,25% ГЛА и 10% сыворотки крови КРС. При пристеночном культивировании употребляют среду Игла MEM (90%) и сыворотку КРС (10%) рН 7,5-7,6.

Способ поддержания. Поддерживается в суспензионных условиях в реакторах различной емкости. Сохранила способность расти в пристеночных культурах. В этом случае при очередном пассировании клеточный пласт диспергируют 0,25% раствором трипсина, подогретого до 37°C.

Ростовые свойства. В суспензионной культуре при посеве в концентрации 500 тыс. клеток на мл обеспечивает 3-4 кратный прирост популяции на 3-4 сутки роста. При коэффициенте пересева 1:3 монослой формируется в пристеночных культурах на 2-3 сутки после посева и переживает не более 3-х дней.

Морфология. Клетки эпителиоподобные.

Кариология. Популяция гетероплоидная с разбросом числа хромосом в клетках от 20 до 78. Модальный класс составляют клетки с диплоидным набором хромосом (16-24%).

Среда замораживания. Ростовая среда (90%), диметилсульфоксид (10%).

Восстановление после хранения в жидком азоте. Жизнеспособность на уровне 88-96%. Культуры восстанавливаются на 1-2 пассаже.

3. ВНК-21/2-17а - перевиваемый монослойно-суспеизионный клон клеток /С.Г. Юрков, В.В. Зуев и др. "Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ" - Покров. - 2000 г. - с. 62/ ,получен во ВНИЯИ и хранится в жидком азоте на уровне 13 пассажа.

Среда культивирования. 0,25% мышечный гидролизат на растворе Эрла (для монослойных культур) и раствор Хенкса для суспензионного культивирования с добавлением 5 аминокислот (аргинин, глутамин, метеонин, цистин, серии), согласно прописи модифицированной среды Игла и 8 витаминов группы В, сыворотка КРС (5%), рН среды 6,8-7,2.

Способ поддержания. Суспензионную культуру выращивают объемно-доливным методом. Монослойную культуру в пристеночных сосудах любой емкости. При очередном пересеве применяют смесь 0,25% трипсина и 0,02% раствора версена в соотношении 1:1.

Ростовые свойства. Через 48 часов культивирования в суспензии культура дает 6-7 кратный прирост, достигая конечной концентрации 2,3-2,8 млн/мл. При выращивании в монослое при посевной концентрации 50-100 тыс. клеток на мл среды монослой образуется на 2-3 сутки роста.

Морфология. В суспензии культура представлена одиночными блестящими, округлыми клетками. В монослое популяция состоит из фибробластоподобных клеток с прозрачной гомогенной цитоплазмой.

Кариология. Культура гетероплоидная. Модальный класс представлен клетками с 42 хромосомами, составляющими в популяции 28-40%.

Среда замораживания. Ростовая среда (90%), диметилсульфоксид (10%).

Восстановление после хранения в жидком азоте. Жизнеспособность 85-90%, клетки восстанавливают морфологию и ростовые свойства на 2-3 пассаже.

Чувствительность к вирусам. Культура клеток чувствительна к вирусу ящура типа А, О, С, Азия.

4. Наиболее близкой к заявляемому изобретению является ВНК-21/13-02 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, полученная на Щелковском биокомбинате и предназначенная для репродукции вируса ящура типа А, О, С, Азия-1, вируса бешенства шт. "Щелково-51", используемых для изготовления противовирусных вакцин против ящура и бешенства (RU 2300562, МПК: C12N 5/06).

Клетки ВНК-21/13-02 характеризуются высокой чувствительностью к вирусу ящура, который накапливается в количестве 7,0 lg ТЦД50/мл, при содержании иммуногенного компонента до 1 мг/мл, а также чувствительны к вирусу бешенства, обеспечивая титр инфекционности 6,5 lg ЛД50/мл.

ВНК-21/13-02 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка адаптирована к суспензионному способу культивирования с использованием питательной среды для суспензионного культивирования на основе солевого раствора Хенкса, содержащая 5-7% сыворотки, 0,125% гидролизата мышечных белков и 0,125% гидролизата лактальбумина с добавлением пяти аминокислот: 1-аргинина 0,042 г/л; 1-глутамина 0,584 г/л; 1-тирозина 0,02 г/л; 1-триптофана 0,015 г/л; 1-цистина 0,032 г/л и семи витаминов группы В: холин-хлорид 0,0034, пантотенат кальция (В5) 0,0034, пиридоксаль HCl 0,0034, тиамин (B1) 0,0034, миоинозит 0,0068, никотинамид (РР) 0,0034, рибофлавин (В2) 0,00034, фолиевая кислота (В9) 0,0034.

Морфология. В суспензии культура представлена одиночными округлыми клетками с небольшим количеством конгломератов, содержащих от 3 до 5 клеток. В монослое популяция состоит из фибробластоподобных клеток с прозрачной гомогенной цитоплазмой, иногда образуется единый цитоплазматический пласт без границ между клетками с наличием большого количества ядер. Отмечается присутствие 2-3-4 и более ядерных симпластов, лежащих изолированно или в структуре клеточного пласта. Также отмечается отпочковывание ядер от общей ядерной массы и формирование микроядер в результате разрушения ядра. Часть клеток отделяется от стекла и растет в суспензии.

Способ культивирования: монослой клеток ВНК-21/13-02 выращивают в матрацах любой емкости. Для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена в соотношении 1:9 при температуре 37°C. Клетки снимают бесцентрифужным методом и ресуспендируют в ростовой среде до посевной концентрации. В суспензии культуру клеток выращивают отъемно-доливным способом в течение 48 часов до 10-50 последовательных пассажей.

Кариологическая характеристика: кариотип суспензионной культуры клеток ВНК-21/13-02 соответствует кариотипу сирийского хомячка, размах варьирования числа хромосом на клетку от 31 до 80, модальный класс (36%) составляют клетки, содержащие 42 хромосомы. В монослойной культуре количество хромосом на одну клетку варьирует от 31 до 98, модальный класс (22%) составляют клетки с числом хромосом (n=44).

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является получение культуры клеток ВНК-21/13-13, предназначенной для репродукции в промышленных условиях вируса ящура типа А, О, С, Азия-1, CAT-1, CAT-2, CAT-3, вируса бешенства шт. "Щелково-51", используемых для изготовления противовирусных вакцин против ящура и бешенства.

Технический результат достигается в повышении иммуногенности, инфекционности и концентрации клеток ВНК-21/13-13 при промышленном суспензионном культивировании в биореакторах.

Поставленная задача решается получением ВНК-21/13-13 - перевиваемой монослойно-суспензионной сублинии клеток почки новорожденного сирийского хомячка, депонированной в Российской коллекции клеточных культур (РКК), в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН) под №89, предназначенной для репродукции вируса ящура типа А, О, С, Азия-1, CAT-1, CAT-2, САТ-3 и вируса бешенства штамм «Щелково-51», используемых для изготовления противовирусных вакцин против ящура и бешенства.

Заявляемые клетки характеризуются высокой чувствительностью к вирусу ящура, который накапливается в количестве 7,0 lg ТЦД50/мл, при содержании иммуногенного компонента до 1,5 (в наиболее близком аналоге, с использованием культуры клеток ВНК 13/02 - до 1) мг/мл, повышенной чувствительностью к вирусу бешенства, соответствующей титру от 6,5 до 8,0 lg ЛД50/мл, и увеличенным выходом клеток, индекс пролиферации которых при суспензионном культивировании равняется 6-8 и достигает концентрации к 48 часам 4·106 клеток/мл при жизнеспособности 95-98%. С помощью заявляемых клеток получают на 50% больше конечного продукта по сравнению с аналогом.

Заявляемые преимущества обусловлены генетическими характеристиками созданной линии клеток ВНК-21/13-13 (подтвержденными протоколом ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии), которая была модифицирована путем многократных пассажей суспензии с использованием питательной среды оригинального состава, которая была подобрана опытным путем и многократно проверена в лабораторных условиях.

Осуществление изобретения

ВНК-21/13-13 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка адаптирована к суспензионному способу выращивания с использованием питательной среды для суспензионного выращивания, содержащей натрий хлористый, калий хлористый, магний сернокислый 7-водный, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций хлористый, натрий углекислый кислый, L-аргинин, L-глутамин, L-тирозин, L-триптофан, D-кальций пантотенат, пиридоксаль гидрохлорид, тиамина гидрохлорид, миоинозит, никотинамид, рибофлавин, фолиевую кислоту, глюкозу или декстрозу моногидрат, ферментативный гидролизат мышечных белков, ферментативный гидролизат лактальбумина, бензилпенициллина натриевую соль, канамицина сульфат, противогрибковый препарат и дистиллированную воду или суперочищенную апирогенную воду, при этом в качестве противогрибкового препарата среда содержит нистатин, растворенный в растворе гидроокиси натрия с активностью от 6×104 до 6,5×104 ЕД/л и дополнительно содержит холина хлорид и янтарную кислоту (бутандикислоту), причем бензилпеницилин натриевую соль используют с активностью 0,09×105 - 1,1×105, а канамицина сульфат - с активностью 0,09×105 - 1,1×105, при следующем содержании компонентов, г/л:

Нистатин с активностью от 6×104 до 6,5×104 Д/л 0,0098-0,0102
Бензилпеницилина натриевая соль с активностью 0,09×105-1,1×105 0,05-0,07
Канамицина сульфат с активностью 0,09×105-1,1×105 Ед/л 0,14-0,16
Глюкоза или Декстроза моногидрат 3,5-3,7
D-кальций пантотенат 3,2×10-3-3,5×10-3
Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,05-0,07
Калий хлористый 0,3-0,5
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,10-0,20
Кальций хлористый фармакопийный 0,26-0,30
Ферментативный гидролизат лактальбумина 1,15-1,30
Ферментативный гидролизат мышечных белков 1,15-1,30
L-аргинин 0,040-0,044
L-глутамин 0,58-0,60
L-тирозин 0,018-0,022
L-триптофан 0,018-0,022
Магний сернокислый, 7-водный 0,15-0,25
Мио-инозит 6,4×10-3-7,0×10-3
Натрий углекислый кислый 0,30-0,40
Натрий хлористый 7,5-8,5
Никотинамид 3,2×10-3-3,5×10-3
Пиридоксаль гидрохлорид 3,2×10-3-3,5×10-3
Рибофлавин 3,2×10-4-3,5×10-4
Тиамина гидрохлорид 3,2×10-3-3,5×10-3
Фолиевая кислота 3,2×10-3-3,5×10-3
Холина хлорид 3,2×10-3-3,5×10-3
Кислота янтарная (бутандикислота) 0,065-0,095
Натрий гидроокись 7,38-9,24×10-3
Вода дистиллированная или суперочищенная апирогенная остальное

При этом растворение нистатина (полиенового противогрибкового антибиотика, который является высокоактивным в отношении дрожжеподобных грибов) проводят в растворе щелочи. Преимуществом питательной среды данного состава является использование химически стабильного раствора щелочи, в котором происходит полное растворение антибиотика и сохранение его активности. Добавление янтарной кислоты в состав питательной среды обеспечивает стабилизацию конечной величины рН, буферной емкости среды, что гарантирует лучшие ростовые свойства для клеток животного происхождения.

Полученная ВНК-21/13-13 депонирована в Российской коллекции клеточных культур в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (РККК) (СХЖ РАСХН) ВИЭВ при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко. Линии клеток присвоен коллекционный №89.

Происхождение. Перевиваемая линия клеток ВНК-21/13-13 выделена из линии клеток ВНК-21/13-02 запатентованной 31.05 2005 г., патент №2300562. Линия клеток ВНК-21/13-02 находится в ФКП «Щелковский биокомбинат».

Морфология. В суспензии культура представлена одиночными клетками, возможно формирование отдельных клеточных конгломератов, состоящих из 5-10 клеток. Клетки фибробластоподобные с прозрачной гомогенной цитоплазмой.

Способ культивирования: В суспензии культуру клеток выращивают в течение 48 часов до 50 последовательных пассажей.

Условия культивирования: суспензионное культивирование проводят в реакторах емкостью 4-40-100-600-2000 литров с рабочим объемом 3-30-60-450-1800 литров соответственно при следующих параметрах:

- посевная концентрация 0,4-0,5·106 кл/мл;

- скорость перемешивания 25-40 об/мин;

- температура культивирования 36,0-36,5°C;

- рН среды в пределах 6,5-7,15;

- аэрация путем барботирования воздухом 0,5-1,5 л/л среды.

Индекс пролиферации при суспензионном культивировании равняется 6-8, концентрация к 48 часам достигает 4·106 клеток/мл при жизнеспособности 95-98%.

Культура ВНК-21/13-13 выделена из культуры ВНК-21/13-02 путем многократного пассирования в суспензионных условиях (49 пассажей в суспензии) из-за чего изменилась кариологическая характеристика.

Кариологическая характеристика: согласно акту лаборатории ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии, составленному по результатам цитогенетических исследований культуры клеток ВНК-21/13-13, проведенные цитогенетические исследования позволили заключить, что число диплоидных метафазных пластинок 2n=44 составляет 17% от общего числа. Разброс числа хромосом в клетках культуры колеблется от 20 до 64, модальный класс представлен пластинками содержащими 30 хромосом, что составляет 43%.

Таблица 1
Интервал изменчивости числа хромосом в культуре клеток ВНК-21/13-13
Количество хромосом 20-24 26 30 35-36 44 64
% 18 3 43 17 17 2

Было проведено молекулярно-генетическое исследование образца клеточной культуры (ВНК-21/13-13) на предмет соответствия изначальной видовой принадлежности Mesocricetus auratus.

Методы исследования. Выделение ДНК из суспензии клеток (10000 клеток/мл) проводили с использованием набора реагентов «Рибо-Преп» (Амплисенс, Россия) согласно прилагаемой инструкции. Определение видовой принадлежности исследуемой культуры клеток проводили с использованием методики видоспецифической ПЦР, разработанной в лаборатории ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко. Для исключения возможной контаминации культуры клетками, полученными от других видов животных и человека, одновременно проводили видоспецифическую ПЦР с использованием набора видоспецифических праймеров для определения видовой принадлежности 12 видам животных.

Результаты: В исследуемом образце клеточной культуры присутствует ДНК сирийского хомячка и отсутствует ДНК человека, свиньи, кошки, овцы, лошади, зеленой мартышки, собаки, кролика, коровы, крысы и мыши.

Криоконсервация, жизнеспособность после консервации. Для длительного хранения в жидком азоте (минус 196°C) используют ампулы, заполненные суспензией клеток с концентрацией 30-35 млн клеток/мл. Консервирование клеток проводят в питательной среде (73%), сыворотке (20%), диметилсульфоксид (7%). Замораживание суспензии клеток осуществляют по 2-х ступенчатому режиму понижения температуры от 0 до минус 30°C со скоростью 1°C в минуту, от минус 30°C до минус 70°C со скоростью 4-6°C в минуту. Охлажденные до минус 70°C ампулы с суспензией клеток помещают на хранение в сосуды Дьюара с жидким азотом (минус 196°C), предварительно подержав ампулы в парах азота. Жизнеспособность клеток после консервации составляет 98-99%.

Линию клеток получили следующим образом.

В качестве исходного материала использовали ВНК-21/13-02 - перевиваемую монослойно-суспензионную сублинию клеток почки новорожденного сирийского хомячка, находящуюся на хранении в Российской коллекции клеточных культур (РКК), в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН) под №61, а также в ФКП «Щелковский биокомбинат». Суспензионное культивирование проводили в биоферментере MD-300 фирмы "MARUBISHI" (Япония) и в промышленном 130-литровом биоферментере Applikon (Голландия) с автоматическим поддержанием концентрации водородных ионов (рН 6,9-7,0), концентрации растворенного кислорода DO (10-30%), температуры (36,5-37°C), ручным регулированием подачи воздуха и скорости перемешивания (до 100 об/мин). Культивирование проводили, используя питательную среду перечисленного выше состава. При этом в процессе культивирования в питательную среду добавляли 7% по объему сыворотки крупного рогатого скота (КРС).

Засевная концентрация клеток составляла 500 тыс. клеток/мл, за время генерации (48 часов) концентрация клеток в суспензии увеличивалась в 6-7 раз.

После проведения 49 пассажей в суспензии были получены клетки, отличающиеся однообразием морфологии и размера с небольшим количеством конгломератов и высокой пролиферативной активностью (индекс пролиферации составил 6-7).

Культура клеток прошла контроль на стерильность согласно ГОСТ 28085-2013 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности».

Данные кариологического анализа, проведенного методом Moorhead Р.З. et al 1960 г., адаптированной суспензионной культуры клеток ВНК-21/13-13 соответствуют кариотипу сирийского хомячка, размах варьирования числа хромосом на клетку составляет от 20 до 64, модальный класс (43%) составляют клетки, содержащие 30 хромосом.

Концентрация клеток ВНК-21/13-13, выращенных в биореакторах промышленных объемов в среде, содержащей 0,25% по объему гидролизата и 7% по объему сыворотки, отличается высокой пролиферативной активностью и составляет от 2,0 до 4,0 млн клеток/мл.

Клетки ВНК 21/13-13 являются перспективной клеточно-культуральная системой, предназначенной для промышленного получения вируссодержащей культуральной жидкости для изготовления иммуногенных инактивированных антирабических вакцин и противоящурных вакцин. Линия клеток ВНК 21/13-13 позволяет получать вирусы бешенства и ящура в промышленных масштабах и использовать их (вирусы) для изготовления безвредных высокоиммуногенных антирабических вакцин и противоящурных вакцин. В частности, суспензионное культивирование клеток ВНК 21/13-13 с последующим их инфицированием вирусом бешенства позволяет стабильно получать высокоактивный вируссодержащий материал и готовить из него инактивированные антирабические вакцины с иммуногенной потенцией, превосходящей международный стандарт в 2,5 раза (Индекс иммуногенности равен 2,5).

ВНК-21/13-13 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, депонированная в Российской коллекции клеточных культур (РККК) в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН) под №89, предназначенная для репродукции вируса ящура типа А, О, С, Азия-1, CAT-1, CAT-2, CAT-3 и вируса бешенства штамм «Щелково-51», используемых для изготовления противовирусных вакцин против ящура и бешенства.



 

Похожие патенты:

Настоящее изобретение касается способа получения популяции клеток, экспрессирующих маркеры плюрипотентности и маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована в лабораторной диагностике как тест-система и способ определения антивирусной активности интерферона альфа (ИФН-α) в сыворотке крови человека.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной хирургии, и может быть использовано для лечения инфекционного перитонита в эксперименте. Для этого крысам внутривенно вводят суспензию аллогенных мезенхимальных стволовых клеток из расчета 1,5×106 на 100 г массы животного в 2 мл физиологического раствора.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к выращиванию колоний клеток. Система культивирования плюрипотентных стволовых клеток состоит из соединенных между собой системы управления и блока культивирования.

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Раскрыт способ промотирования регенеративных процессов в культуре ткани или культуре клеток.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к лентивирусной доставке апоптина в опухолевые ткани, и может быть использовано в медицине. Способ включает получение лентивирусного конструкта, экспрессирующего модифицированный апоптин, слитый с секреторным сигналом лактотрансферрина и трансдукторным сигналом (ST-CTP-апоптин), с последующим получением рекомбинантных лентивирусных частиц, дефектных по репликации и несущих модифицированный апоптин, которые затем вводятся в Т-лимфоциты (TILs), полученные при хирургическом удалении опухоли или в процессе получения биопсии, которые обладают способностью проникать в опухолевые ткани.
Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду для микроразмножения кальцефильных растений в культуре in vitro, включающую растворенные в дистиллированной воде витамины и аминокислоты по прописи Мурасиге и Скуга, сахарозу в количестве 20000 мг/л, агар-агар в количестве 8000 мг/л, а также регуляторы роста 6-бензиламинопурин, гибберелловую кислоту и 3-индолил уксусную кислоту, минеральный состав Woody Plant Medium, кинетин, при этом регуляторы роста взяты в следующей концентрации, мг/л: 6-бензиламинопурин 0.1-0.3 кинетин 0.9-1.1 гибберелловая кислота 0.9-1.1 3-индолил уксусная кислота 0.4-0.6 Изобретение позволяет увеличить коэффициент размножения посредством активации пазушных меристем без ущерба качеству регенерантов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ индукции в культуре in vitro гибели плюрипотентных стволовых клеток и клеток, отличных от кардиомиоцитов, происходящих из плюрипотентных стволовых клеток, путем культивирования клеточной популяции, включающей плюрипотентные стволовые клетки, клетки, отличные от кардиомиоцитов, происходящих из плюрипотентных стволовых клеток, и кардиомиоциты, происходящие из плюрипотентных стволовых клеток, в гипертоническом растворе, содержащем сахариды (углеводы) и имеющем осмотическое давление от 370 мОсм/кг до 1000 мОсм/кг.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ закрепления плюрипотентных стволовых клеток человека на плоском носителе.

Изобретение относится к области медицины, генетической инженерии и биотехнологии. Предложен способ обеспечения безопухолевой тканезаместительной терапии на основе получаемых из взрослых соматических клеток индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК), где последние генетически модифицируют при помощи искусственной хромосомы (ИХ), несущей бицистронную кассету с геном-самоубийцей и геном чувствительности к антибиотику под контролем регуляторного элемента, специфичного для плюрипотентных стволовых клеток, при этом модифицированные иПСК отбирают в присутствии соответствующего антибиотика, подтверждают отсутствие интеграции ИХ в геном иПСК, вводят в организм реципиента напрямую, без предварительной дифференцировки in vitro, через 1-14 дней реципиентам проводят 5-10-дневный курс терапии индуктором токсичности продукта гена-самоубийцы.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Предложен способ дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток фиброзированных легких в фибробластные клетки, характеризующийся тем, что из правой доли фиброзированных легких выделяют клетки с фенотипом мезенхимальных стволовых клеток (CD44+, CD73+, CD90+, CD106+, CD31-, CD34-, CD45-), способные самообновляться in vitro в течение 60 дней, затем при добавлении в культуру мезенхимальных стволовых клеток фактора роста фибробластов 2 мкг/мл получают фибробластные клетки. Способ позволяет получить донорские клетки больных идиопатическим фиброзом из тканей фиброзированных легких. 3 ил., 1 пр.

Изобретение относится к биотехнологии. Раскрыт способ выращивания эмбриональных стволовых клеток человека. Способ предусматривает прикрепление популяции клеток к микроносителю в среде, содержащей ингибитор Rho-киназы. Далее проводят культивирование клеток, отделение клеток от микроносителя и прикрепление полученных клеток ко второму микроносителю в среде, содержащей ингибитор Rho-киназы. Изобретение может быть использовано в медицине. 6 з.п. ф-лы, 48 ил., 3 табл., 11 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ культивирования эпителиальных стволовых клеток или выделенных фрагментов ткани, содержащих указанные эпителиальные стволовые клетки, включающий обеспечение внеклеточного матрикса, инкубирование эпителиальной стволовой клетки или выделенного фрагмента ткани, содержащего указанные эпителиальные стволовые клетки, с внеклеточным матриксом, культивирование эпителиальной стволовой клетки или выделенного фрагмента ткани в присутствии клеточной культуральной среды, содержащей базальную среду для клеток животного или человека, в которую добавлены ингибитор морфогенетического белка кости (BMP) и 5- 500 нг/мл митогенного фактора роста, а также клеточная культуральная среда, ее применение, способ культивирования трехмерного органоида, способ его получения, трехмерный органоид и его применение. 9 н. и 23 з.п. ф-лы, 10 пр., 34 ил.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантной продукции белков человека, и может быть использовано в производстве химерных антител к фактору некроза опухоли человека. Получен штамм клеток яичников китайского хомячка CHO-Inflix 20/5, трансфецированных векторами, экспрессирующими легкую и тяжелую цепи химерного антитела против фактора некроза опухоли альфа (ФНО-α) человека. Штамм депонирован в Российскую коллекцию клеточных культур под №РККК(П)760Д. Изобретение позволяет получать химерное антитело с удельной продуктивностью не менее 33,5 пикограмм на клетку в сутки. 4 ил., 2 табл., 4 пр.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения экзосом из крови. Кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию. Далее клеточную фракцию крови подвергают последовательной двухстадийной обработке сначала буферным раствором PBS, содержащим 5 мМ ЭДТА, с последующим центрифугированием и сбором супернатанта. Обрабатывают клетки равным объемом 0,15-0,35% раствора трипсина в PBS с последующим центрифугированием и сбором супернатанта. Плазму и полученные супернатанты из клеточной фракции объединяют, удаляют клеточный дебрис центрифугированием при 15000-17000 g в течение 10-20 минут. Удаляют примесь частиц неэкзосомального происхождения путем фильтрации через фильтры с диаметром пор 0,1 мкм, а суммарный пул экзосом осаждают ультрацентрифугированием при 100000-160000 g в течение 60-120 минут. Предложенное изобретение позволяет повысить выход и чистоту целевого продукта, а также сократить длительность и снизить трудоемкость способа. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описано применение специфических молекул-конъюгатов, которые являются транспортерами карго-молекул, для транспортировки представляющей интерес субстанции в лейкоциты. Указанные молекулы-конъюгаты, которые являются транспортерами карго-молекулы, можно применять для лечения, профилактики, ослабления и/или уменьшения интенсивности заболевания и/или нарушения, в котором принимают участие лейкоциты. Описаны также способ получения указанных молекул-конъюгатов, которые являются транспортерами карго-молекул, способ транспортировки представляющей интерес субстанции в лейкоциты и лейкоциты, содержащие указанные молекулы-конъюгаты, которые являются транспортерами карго-молекул. Изобретение может быть использовано в медицине. 5 н. и 21 з.п. ф-лы, 34 ил., 5 табл., 29 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве питательных сред для суспензионного культивирования клеток, в частности суспензионного культивирования клеток почки сирийского хомячка. Питательная среда содержит натрий хлористый, калий хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций хлористый, натрий двууглекислый, L-аргинин, L-глутамин, L-тирозин, L-триптофан, пантотенат кальция, пиридоксаль HCl, тиамин, мезо-инозит, никотинамид, рибофлавин, фолиевую кислоту, глюкозу, ферментативный гидролизат мышечных белков, ферментативный гидролизат лактальбумина, бензилпенициллина натриевую соль с активностью 0,09×105-1,1×105, канамицина сульфат с активностью 0,09×105-1,1×105, нистатин с активностью от 6×104 до 6,5×104 ЕД/л, холина хлорид, янтарную кислоту и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить качество получаемого продукта. 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу лечения нарушения кровотока в мозге. Для этого указанному индивидууму вводят эффективное количество изолированной популяции клеток, включающей человеческие адгезивные плацентарные клетки, которые представляют собой CD10+, CD34-, CD105+ и CD200+, где по меньшей мере 70% указанных плацентарных клеток в указанной популяции клеток являются нематеринскими по происхождению. Использование данного способа демонстрирует безопасность и эффективность внутривенного введения изолированных плацентарных клеток с фенотипом CD10+, CD34-, CD105+ и CD200+ для лечения симптомов, ассоциированных с нарушениями мозгового кровотока в мозге. 44 з.п. ф-лы, 9 ил., 1 табл., 5 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано при лечении полнослойных локальных остеохондральных дефектов суставов. Для этого проводят артроскопию крупного сустава, определяют локализацию и размер остеохондрального или хондрального дефекта, удаляют свободный фрагмент и выполняют абразивную хондропластику и микрофрактуринг. Для восстановления дефектов гиалинового хряща в зону дефекта хрящевой ткани вводят смесь клеток стромальной сосудистой фракции (ССФ) одновременно с фибриновым клеем с использованием системы дуплоджект. После проведения артротомии пораженный сустав выдерживают 5 минут, после чего выполняют 8-10 циклов пассивных сгибательно-разгибательных движений. В менее крупные суставы - голеностопный или локтевой - вводят клетки ССФ под контролем электронно-оптического преобразователя без вскрытия сустава под анестезией. Изобретение позволяет проводить восстановление дефектов гиалинового хряща суставных поверхностей смесью клеток стромальной сосудистой фракции в сжатые сроки и без нанесения дополнительной травмы. 1 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено трансгенное животное, представляющее собой мышь или крысу, в геном которого встроена нуклеиновая кислота, кодирующая перестроенную вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина человека, функционально связанную с константной областью иммуноглобулина указанного животного и функционально связанную с промотором, обеспечивающим экспрессию трансгенной легкой цепи в В-клетках млекопитающего, таким образом, что она образует пары с различными эндогенными тяжелыми цепями, обеспечивая получение антител. Также рассмотрены способы получения антител с использованием трансгенного животного, В-клетка трансгенного животного, применение животного и его В-клетки для получения антител и способ получения трансгенного животного по изобретению. Данное изобретение позволяет продуцировать антитела, содержащие легкую цепь с вариабельной областью иммуноглобулина человека в паре с различными тяжелыми цепями иммуноглобулинов животного. 8 н. и 16 з.п. ф-лы, 27 ил., 11 табл., 22 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. ВНК-2113-13 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка задепонированна в Российской коллекции клеточных культур в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко под №89 и предназначена для репродукции вируса ящура типа А, О, С, Азия-1, CAT-1, CAT-2, CAT-3 и вируса бешенства штамм «Щелково-51», используемых для изготовления противовирусных вакцин против ящура и бешенства. Результат, достигаемый при использовании данной клеточной культуры, заключается в повышении иммуногенности, инфекционности и концентрации клеток ВНК-2113-13 при промышленном суспензионном культивировании в биореакторах. 1 табл.

Наверх