Тканеспецифические биомаркеры старения


 


Владельцы патента RU 2557313:

НЕСТЕК С.А. (CH)
ЛАЙФДЖЕН ТЕКНОЛОДЖИЗ, ЛЛК (US)

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу идентификации изменений в экспрессии генов, характерных для старения, в выбранной ткани. Выбранная ткань представляет собой сердечную, мышечную, мозговую или жировую ткань. Способ включает отбор одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в ткани старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, с применением двух критериев. Указанными критериями являются изменение экспрессии по меньшей мере в 50% линий, пород или этнических групп тестируемых видов на заранее определенном уровне значимости в р<0.10, а также по меньшей мере частичное обращение изменений в экспрессии генов путем ограничения в калорийности. Изобретение обеспечивает получение надежных тканеспецифических биомаркеров старения. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 11 табл., 5 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка притязает на приоритет предварительной заявки на патент США серийный No. 61/209854, зарегистрированной 11 марта 2009, раскрытие которой включено в настоящий документ путем отсылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение в целом относится к области поддержки с помощью питания здоровья и продолжительности жизни животных. В особенности изобретение обеспечивает способы разработки тканеспецифических универсальных биомаркеров старения у животных, а также наборы надежных биомаркеров идентифицируемых этими способами и применение тканеспецифических универсальных биомаркеров старения для идентификации питательных веществ и других функциональных ингредиентов или агентов, обладающих омолаживающими свойствами у животных.

Уровень техники

Было показано, что ограничение в потреблении калорий в количествах, существенно ниже уровня ad libitum, увеличивает продолжительность жизни, снижает или откладывает наступление многих возрастных состояний, улучшает устойчивость к стрессу и замедляет функциональное ухудшение здоровья у многих видов животных, включая млекопитающих, таких как грызуны и приматы (см., например, D.K. Ingram et al. (2004) Ann. N.Y. Acad. Sci. 1019: 412-423). Безусловно, проводили клинические испытания для оценки влияния на увеличение продолжительности жизни в результате ограничений в потреблении калорий (CR) у людей. Но у людей, также как и у животных, кажется маловероятным, что CR представляет собой эффективную стратегию для увеличения продолжительности жизни для большинства индивидуумов из-за степени и продолжительности необходимых ограничений. По этой причине исследование было сосредоточено на идентификации веществ, например, фармацевтических агентов, питательных веществ и им подобных, способных имитировать эффект CR без существенного изменения в пищевом рационе.

Усилия были направлены на поиск агентов, которые могут имитировать один или несколько физиологических или биохимических эффектов CR (см., например, Ingram et al., 2004, supra) или которые могут имитировать профиль генной экспрессии, ассоциированных с CR в определенных тканях и органах (например, Spindler, U.S. Patent 6,406,853; U.S. Patent Pub. 2003/0124540). В связи с последним, были раскрыты способы анализа генов, ассоциированных с CR, и скрининга CR-миметиков, на основании профиля генной экспрессии (Spindler et al., публикация патента США 2004/0180003, 2004/0191775 и 2005/0013776; Pan et al., публикация патента США 2007/0231371).

Несмотря на доступность изложенных выше подходов, сохраняется необходимость в более надежных, быстрых и менее дорогостоящих способах скрининга агентов, способных замедлить или обратить процесс старения, препятствовать преждевременному старению и увеличить продолжительности жизни. Настоящее изобретение отвечает этому требованию.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следовательно, цель настоящего изобретения заключается в обеспечении способов идентификации надежных и универсально применимых маркеров экспрессии генов старения в выбранных тканях и в обеспечении наборов надежных и универсально применимых маркеров экспрессии генов, идентифицируемых этими способами.

Другая цель изобретения заключается в обеспечении одного или нескольких генов или сегментов гена, которые дифференциально экспрессируются в выбранных тканях старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами.

Дополнительная цель изобретения заключается в обеспечении набора, включающего множество полинуклеотидов, которые дифференциально экспрессируются в выбранных тканях старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами.

Другая цель изобретения заключается в обеспечении композиций из двух или нескольких полинуклеотидных или полипептидных зондов, подходящих для детекции экспрессии генов, дифференциально экспрессируемых в выбранных тканях старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами и устройств, таких как чипы, содержащие зонды на подложке.

Дополнительная цель изобретения заключается в обеспечении способов детекции дифференциальной экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в выбранных тканях старых субъектов, по сравнению с молодыми субъектами или стандартным контрольным образцом.

Другая цель изобретения заключается в обеспечении способа измерения эффекта тестируемого вещества на профиле экспрессии одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в выбранных тканях старых субъектов, по сравнению с молодыми субъектами или стандартным контрольным образцом.

Одну или несколько из этих целей достигают, применяя новые способы идентификации тканеспецифических биомаркеров старения и новые комбинации полинуклеотидов или полипептидов, представляющих собой гены и сегменты гена, которые дифференциально экспрессируются в выбранных тканях старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами. Полинуклеотиды применяют для получения композиций, зондов, устройств, основанных на зондах, и способов определения статуса полинуклеотидов, дифференциально экспрессируемых в выбранных тканях старых субъектов, по сравнению с молодыми субъектами или стандартным контрольным образцом, которые полезны для достижения вышеуказанных целей, например, для прогнозирования и диагностирования возрастных состояний в выбранных тканях и скрининга веществ для определения того, действительно ли они обладают омолаживающим эффектом в определенных тканях. Также обеспечивают разнообразные наборы, включающие комбинации зондов, устройства, в которых применены зонды, и вещества, а также различные компьютерные программы, содержащие информацию по применению, и средства коммуникации для передачи информации, имеющей отношение к дифференциально экспрессируемым генам и способам их применения.

Другие и дополнительные цели, признаки и преимущества изобретения легко понятны специалистам в этой области техники.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

Для применения в настоящем документе, диапазоны указаны в сокращенном виде, для того, чтобы избежать необходимости приводить длинный вариант и описывать все, без исключения, величины внутри диапазона. В зависимости от ситуации может быть выбрана любая подходящая величина внутри диапазона, подходящая в качестве верхнего значения, нижнего значения или границы диапазона. Ясно, что все без исключения, целые или дробные числа между любыми диапазонами или интервалами, приведенными в этой заявке, включены в эту заявку.

Используемое здесь и в прилагаемой формуле изобретения слово в единственном числе включает множественное число и, наоборот, кроме тех случаев, когда контекст ясно указывает на иное. Например, ссылка на «животное», «способ» или «вещество» включает множество таких «животных», «способов» или «веществ». Сходным образом, слова «включают», «включает» и «включающий» следует интерпретировать скорее включительно, чем исключительно.

Термин «животное» означает человека или другое животное, включая птиц, крупный рогатый скот, собак, лошадей, кошек, коз, мышей, овец и свиней. Если термин применяют в контексте сравнения исследуемых субъектов, то животные, которых сравнивают, представляют собой животных одних и тех же видов и, при возможности, одной и той же расы или породы. «Животное-компаньон» представляет собой любое домашнее животное и включает, без ограничения, кошек, собак, кроликов, морских свинок, хорьков, хомяков, мышей, песчанок, лошадей, коров, коз, овец, ослов, свиней и им подобных. Предпочтительно, животное представляет собой человека или животное-компаньона, такое как собака или кошка.

Термин «антитело» означает любой иммуноглобулин, который связывается со специфическим антигеном, и включает антитела IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Термин включает поликлональные, моноклональные, моновалентные, гуманизированные антитела, гетероконъюгаты, композиции антител с полиэпитопной специфичностью, химерные, биспецифичные антитела, диатела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител, такие как Fab, Fab', F(ab')2 и Fv или другие антигенсвязывающие фрагменты.

Термин «панель» означает упорядоченное расположение, по меньшей мере, двух зондов на подложке. По меньшей мере, один зонд представляет собой контрольный или стандартный зонд, и, по меньшей мере, один зонд представляет собой диагностический зонд. Размещение от примерно двух до примерно 40000 зондов на подложке гарантирует, что размер и интенсивность сигнала от каждого меченого комплекса, сформированного между зондом и полинуклеотидом или полипептидом образца, индивидуально различимы.

Термин «комплекс связывания» означает комплекс, формирующийся, когда полипептид в образце специфически связывается (как определено в этой заявке) с партнером по связыванию, таким как антитело или его функциональный фрагмент.

Термин «ограничение в калориях» или «ограничение в калорийности» означает любой режим питания с низким содержанием калорий, без недоедания. В целом, ограничение касается общего содержания калорий, получаемых из углеводов, жиров и белков. Ограничение обычно составляет, хотя не ограничивается, примерно от 25% до примерно 40% от калорийности потребляемой пищи по сравнению с калорийностью потребления ad libitum.

Термин «пищевая добавка» означает продукт, который предназначен для потребления в дополнении к нормальной диете животного. Пищевые добавки могут находиться в любой форме, например, в твердой, жидкой форме, в форме геля, таблеток, капсул, порошка и им подобных. Предпочтительно, их обеспечивают в подходящих лекарственных формах. В некоторых воплощениях их обеспечивают в упаковках для крупных потребителей, таких как нерасфасованные порошки или жидкости. В других воплощениях, добавки обеспечивают крупными партиями для включения в другие пищевые продукты, такие как сухие завтраки, лакомства, батончики с добавками, напитки и им подобные.

Термин «дифференциальная экспрессия» или «дифференциально экспрессируемый» означает увеличенную или повышенную экспрессию гена или означает ослабленную или сниженную экспрессию гена, которую детектируют по отсутствию, присутствию или, по меньшей мере, двукратному изменению в количестве транскрибируемой информационной РНК или транслируемого белка в образце.

Термин «эффективное количество» означает количество соединения, материала, композиции, лекарственного средства или другого материала, которое эффективно для достижения определенного биологического результата, такого как обращение или замедление старения в выбранной ткани, как описано в этой заявке.

Термин «пища» или «пищевая композиция» означает композицию, которая предназначена для поглощения животным, включая человека, и обеспечивает его питание. Использованное в этой заявке определение «пищевой продукт, разработанный для потребления человеком», представляет собой любую композицию, специфически предназначенную для поглощения человеком. «Корма для животных» представляют собой композиции, предназначенные для потребления домашними животными, предпочтительно, животными-компаньонами. «Полный и сбалансированный по питательным веществам корм для животных» представляет собой такой корм, который содержит все известные необходимые питательные вещества для предполагаемого получателя или потребителя корма, в подходящих количествах и пропорциях, основанных, например, на рекомендациях признанных авторитетов в области питания животных-компаньонов. Такие корма, следовательно, способны служить в качестве единственного источника пищевого рациона для поддержания жизни или стимуляции продуктивности, без добавления дополнительных питательных источников. Композиции сбалансированного по питательным веществам корма для животных широко известны и широко применяются в этой области техники.

Термин «фрагмент» означает (1) олигонуклеотидную или полинуклеотидную последовательность, которая представляет собой часть полной последовательности и которая обладает такой же или сходной активностью при определенном применении, как и полная полинуклеотидная последовательность; или (2) пептидная или полипептидная последовательность, которая представляет собой часть полной последовательности и которая обладает такой же или сходной активностью при специфическом применении, как и полная полипептидная последовательность. Такие фрагменты могут включать любое число нуклеотидов или аминокислот, которые считаются подходящими для специфического применения. Обычно, олигонуклеотидные или полинуклеотидные фрагменты содержат, по меньшей мере, примерно 10, 50, 100 или 1000 нуклеотидов, и полипептидные фрагменты содержат, по меньшей мере, примерно 4, 10, 20 или 50 последовательных аминокислот из полной последовательности. Термин охватывает варианты фрагментов полинуклеотидов и полипептидов.

Термин «ген» или «гены» означает полный или частичные сегмент ДНК, вовлеченный в продуцирование полипептида, включая участки, предшествующие кодирующей области и следующие за ней (лидерный и трейлерный) и промежуточные последовательности (интроны) между индивидуальными кодирующими сегментами (экзонами). Термин охватывает любую последовательность ДНК, которая гибридизуется с комплементарной цепью, кодирующей последовательности гена.

Термин «генный продукт» означает продукт транскрипции гена, такой как мРНК или ее производные (например, кДНК), или трансляции генного транскрипта. Термин «генный продукт» обычно означает продукт трансляции, который представляет собой белок. Термин «генный продукт» может быть применен взаимозаменяемо с термином «белок» в этой заявке.

Термин «гомолог» означает (1) полинуклеотид, включая полинуклеотиды из одинаковых или разных видов животных, имеющий более чем 30%, 50%, 70% или 90% сходства в последовательности с полинуклеотидом сравнения и имеющий одинаковые или существенно сходные свойства и демонстрирующий одинаковую или существенно сходную с полинуклеотидом сравнения функцию, или обладающий способностью специфически гибридизоваться с полинуклеотидом сравнения в жестких условиях; или (2) полипептид, включая полипептиды из одинаковых или разных видов животных, имеющий более чем 30%, 50%, 70% или 90% сходства в последовательности с полипептидом сравнения и имеющий одинаковые или существенно сходные свойства и демонстрирующий одинаковую или существенно сходную с полипептидом сравнения функцию, или обладающий способностью специфически связываться с полипептидом сравнения. При отсылке к фрагментам полноразмерной кодирующей последовательности, функция этих фрагментов может просто заключаться в кодировании выбранной части полипептида определенной последовательность или, соответственно, быть сходной последовательностью для гибридизации с другим полинуклеотидным фрагментом, кодирующим этот полипептид. При отсылке к фрагментам полипептида, функция этих фрагментов может просто заключаться в формировании эпитопа, подходящего для генерации антитела. Сходства в последовательности двух полипептидных последовательностей или двух полинуклеотидных последовательностей определяют, применяя способы, известные специалистам в этой области техники, например, алгоритм Karlin и Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268 (1990)). Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). Для получения выравниваний с разрывами для целей сравнения, может быть применена программа Gapped Blast, как описано у Altschul et al. (Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). При применении программ BLAST и Gapped BLAST, применяют параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). Смотри .

Термин «гибридизационный комплекс» означает комплекс, который формируется между полинуклеотидами образца, когда пурины одного полинуклеотида образуют водородные связи с пиримидинами комплементарного полинуклеотида, например, пар оснований 5'-A-G-T-C-3' с 3'-T-C-A-G-5'. Степень комплементарности и применение аналогов нуклеотидов определяют эффективность и жесткость условий реакции гибридизации.

Термин «совместно» означает, что лекарственный препарат, пищу или другое вещество вводят животному (1) вместе, в композиции, в частности, в пищевой композиции или (2) отдельно, с одинаковой или разной частотой, применяя одинаковые или разные пути введения за примерно одинаковое время или периодически. «Периодически» означает, что вещество вводят по схеме применения, приемлемой для специфического вещества. «Примерно одинаковое время» обычно означает, что вещество (пища или лекарственный препарат) вводят в одинаковое время или в течение примерно 72 часов друг от друга. «Совместно» специфически включает схемы введения, при которых вещества, такие как лекарственные препараты, вводят в течение указанного периода, а композиции изобретения вводят в течение неопределенного периода времени.

Термин «индивидуальный», при ссылке на животное, означает индивидуальное животное любого вида или типа. Этот термин может быть применен взаимозаменяемо с термином «субъект».

Термин «долгожительство» обычно означает продолжительность жизни за пределами средней прогнозируемой продолжительности жизни для определенного вида или для определенной линии, породы или этнической группы внутри этого вида, если существуют различия внутри вида. «Улучшенная продолжительность жизни» или «увеличенная продолжительность жизни» означает любое существенное удлинение продолжительности жизни определенного животного за пределами средней прогнозируемой продолжительности жизни для вида, к которому животное принадлежит.

Термин «полинуклеотид» или «олигонуклеотид» означает полимер нуклеотидов. Термин охватывает молекулы ДНК и РНК (включая кДНК и мРНК), как одноцепочечные, так и двухцепочечные, и, если одноцепочечные, то с комплементарной последовательностью как в линейной, так в кольцевой форме. Термин также охватывает фрагменты, варианты, гомологи и аллели, как подходящие для последовательностей, которые имеют одинаковые или существенно сходные свойства и демонстрируют одинаковую или существенно сходную с оригинальной последовательностью функцию. В особенности, термин охватывает гомологи из различных видов, например, из мыши и собаки или кошки. Последовательности могут быть полностью комплементарны (без ошибочно спаренных оснований) при выравнивании или могут иметь вплоть до примерно 30% ошибочно спаренных оснований в последовательности. Предпочтительно, для полинуклеотидов, цепь содержит от примерно 50 до 10000 нуклеотидов, более предпочтительно от примерно 150 до 3500 нуклеотидов. Предпочтительно, для олигонуклеотидов, цепь содержит от примерно 2 до 100 нуклеотидов, более предпочтительно от примерно 6 до 30 нуклеотидов. Точный размер полинуклеотида или олигонуклеотида будет зависеть от различных факторов и от конкретного приложения и применения полинуклеотида или олигонуклеотида. Термин включает нуклеотидные полимеры, которые синтезируют, и которые изолируют и очищают из природных источников. Термин «полинуклеотид» включает термин «олигонуклеотид».

Термин «полипептид», «пептид» или «белок» означает полимер аминокислот. Термин охватывает природные и неприродные (синтетические) полимеры и полимеры, в которых одна или несколько аминокислот заменены искусственными химическими миметиками. Термин также охватывает фрагменты, варианты и гомологи, которые имеют одинаковые или существенно сходные свойства и демонстрируют одинаковую или существенно сходную с оригинальной последовательностью функцию. Термин охватывает полимеры любой длины, предпочтительно полимеры, содержащие от примерно 2 до 1000 аминокислот, более предпочтительно от примерно 5 до 500 аминокислот. Термин включает полимеры аминокислот, которые синтезируют и которые изолируют и очищают из природных источников.

Термин «зонд» означает (1) олигонуклеотид или полинуклеотид, как РНК, так и ДНК, или природный в виде очищенного после ферментативного расщепления полинуклеотида, или полученный с помощью синтеза, который способен к отжигу с полинуклеотидом с последовательностями, комплементарными зонду, или способен специфически гибридизоваться с ним, или (2) соединение или вещество, включая пептид или полипептид, способные специфически связываться с определенным белком или фрагментом белка с существенным исключением других белков или фрагментов белков. Олигонуклеотидный или полинуклеотидный зонд может быть как одноцепочечный, так и двухцепочечный. Точная длина зонда будет зависеть от многих факторов, включая температуру, источник и применение. Например, для диагностического применения, в зависимости от сложности целевой последовательности, олигонуклеотидный зонд обычно содержит примерно от 10 до 100, от 15 до 50 или от 15 до 25 нуклеотидов. В некоторых диагностических приложениях, полинуклеотидный зонд содержит примерно 100-1000, 300-600 нуклеотидов, предпочтительно примерно 300 нуклеотидов. Зонды в этой заявке выбирают так, чтобы они были «в значительной степени» комплементарны разным нитям определенной последовательности-мишени. Это означает, что зонды должны быть в достаточной мере комплементарны для специфической гибридизации или отжига с их соответствующими последовательностями-мишенями в заранее заданном наборе условий. Следовательно, последовательность-зонд не должна быть полностью комплементарна последовательности мишени. Например, некомплементарный нуклеотидный фрагмент может быть присоединен к 5'- или 3'-концу зонда, тогда как оставшаяся последовательность зонда будет комплементарной последовательности-мишени. Альтернативно, некомплементарные основания или более длинные последовательности могут быть включены в последовательность зонда, если последовательность-зонд в достаточной степени комплементарна последовательности полинуклеотида-мишени для специфического отжига с полинуклеотидом-мишенью. Пептид или полипептидный зонд может представлять собой любую молекулу, с которой белок или пептид специфически связывается, включая ДНК (для ДНК-связывающих белков), антитела, рецепторы клеточной мембраны, пептиды, кофакторы, лектины, сахара, полисахариды, клетки, клеточные мембраны, органеллы и мембраны органелл.

Термин «образец» означает любую ткань или жидкость животного, содержащие, например, полинуклеотиды, полипептиды, антитела, метаболиты и им подобных, включая клетки и другие ткани, содержащие ДНК и РНК. Примеры включают жировую ткань, кровь, хрящ, соединительную ткань, эпителиальную ткань, лимфоидную ткань, мышцы, нервы, мокроту и им подобные. Образец может быть твердым или жидким и может представлять собой ДНК, РНК, кДНК, жидкости организма, такие как кровь или моча, клетки, клеточные препараты или растворимые фракции или аликвоты их среды, хромосомы, органеллы и им подобные.

Термин «разовая упаковка» означает, что компоненты набора физически собраны в один или несколько контейнеров или связаны с ним и рассматриваются как единица для производства, распространения, продажи или применения. Контейнеры включают, но не ограничиваются, мешки, коробки, бутылки, упаковки в термоусадочной пленке, скрепленные металлическими скрепками или иным образом зафиксированные компоненты или их комбинации. Разовая упаковка может представлять собой контейнеры с индивидуальными пищевыми композициями, физически присоединенными так, чтобы их рассматривали как единицу для производства, распространения, продажи или применения.

Термин «специфически связывается» означает специальное и точное взаимодействие между двумя молекулами, которое зависит от их структуры, в частности, от боковых групп их молекул. Например, интеркаляция регуляторного белка в большую бороздку молекулы ДНК, образование водородных связей вдоль углеродного скелета между двумя одноцепочечными нуклеиновыми кислотами или связывание между эпитопом белка и агонистом, антагонистом или антителом.

Термин «специфически гибридизуется» означает ассоциацию двух одноцепочечных полинуклеотидов, имеющих в достаточной мере комплементарные последовательности (иногда определяемых как «в значительной степени комплементарные»), так чтобы произошла гибридизация в заранее определенных условиях, обычно применяемых в этой области техники. Например, термин может означать гибридизацию полинуклеотидного зонда с в значительной степени комплементарной последовательностью, которая содержится в молекуле одноцепочечной ДНК или РНК, в соответствии с аспектом изобретения, с существенным исключением гибридизации полинуклеотидного зонда с одноцепочечными полинуклеотидами некомплементарной последовательности.

Термин «стандарт» означает (1) контрольный образец, который содержит ткань из субъекта, которому было введено контрольное вещество или вещество сравнения или не было введено никакого вещества, в сравнении с образцом, который содержит ткань из субъекта, которому было введено тестируемое вещество, например, для определения, вызывает ли тестируемое вещество дифференциальную экспрессию гена, приобретенную в контексте его применения.

Термин «жесткие условия» означает (1) гибридизацию в 50% (объем/объем) формамиде с 0,1% бычьим сывороточным альбумином, 0,1% Фиколлом, 0,1% поливинилпирролидоном, 50 мМ натрий-фосфатном буфере при pH 6,5 с 750 мМ NaCl, 75 мМ цитрата натрия при 42°C, (2) гибридизация в 50% формамиде, 5х SSC (0,75 М NaCl, 0,075 М цитрат натрия), 50 мМ фосфате натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфате натрия, 5х растворе Денхардта, обработанной ультразвуком ДНК из молок лососевых (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% сульфате декстрана при 42°C; с промывками при 42°C в 0,2 х SSC и 0,1% SDS или с промывками с 0,015 М NaCl, 0,0015 М цитратом натрия, 0,1% Na2SO4 при 50°C или сходными процедурами, с применением такой же низкой ионной силы и высокой температуры, таких же агентов для промывок и похожих денатурирующих агентов.

Термин «тканеспецифический маркер» или «тканеспецифических биомаркер», применяемый в этой заявке, означает гены и продукты их экспрессии, которые дифференциально экспрессируются в выбранной ткани старого субъекта в сравнении с молодым субъектом. Термин «тканеспецифический» предназначен для того, чтобы охватить ткани и органы. Например, выбранная ткань может быть гладкомышечной тканью из сердца, и тканеспецифические маркеры могут быть обозначены как «специфические для сердца». В другом примере, выбранная ткань может быть жировой тканью, которая может быть не связана с каким-либо определенным органом. Специалисту ясны эти термины в том виде, как их применяют в контексте на всем протяжении описания.

Термин «вариант» означает (1) полинуклеотидную последовательность, содержащую любую замену, изменение, модификацию, замещение, делецию или вставку одного или нескольких нуклеотидов из полинуклеотидной последовательности или в нее, и которая имеет одинаковые или существенно сходные свойства и демонстрирует одинаковую или существенно сходную с оригинальной последовательностью функцию; и (2) полипептидную последовательность, содержащую любую замену, изменение, модификацию, замещение, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот из полипептидной последовательности или в нее, и которая имеет одинаковые или существенно сходные свойства и демонстрирует одинаковую или существенно сходную с оригинальной последовательностью функцию. Термин, следовательно, включает полиморфизм единичных нуклеотидов (SNP) и аллельные варианты и включает консервативные и неконсервативные замены аминокислот в полипептидах. Термин также охватывает получение производных полинуклеотида или полипептида химическим способом и замену нуклеотидов или аминокислот нуклеотидами или аминокислотами, которые не встречаются в природе.

Термин «виртуальная упаковка» означает, что компоненты набора связаны с помощью руководств на одном или нескольких физических или виртуальных компонентах набора, инструктирующих пользователя, как получить другие компоненты, например, в пакете, содержащем один компонент и руководства, предписывающие пользователю обратиться к веб-сайту, прослушать записанное сообщение, просмотреть визуальное сообщение или обратиться к составителю или инструктору для получения указаний по применению набора.

«Молодой» обычно означает взрослого молодого индивидуума, т.е., вышедшего из пубертатного периода или подросткового возраста, что будет определяться видом или линией, породой или этнической группой внутри вида, в соответствии с известными параметрами. Термин «пожилой» или «старый», используемый в этой заявке, означает индивидуума, который физически или хронологически находится в рамках последних 30% своей средней прогнозируемой продолжительности жизни, что обусловлено видом или линией, породой или этнической группой внутри вида, в соответствии с известными параметрами.

Способы и композиции и другие преимущества, раскрытые в этой заявке, не ограничены определенной методологией, протоколами и реагентами, описанными в этой заявке, поскольку, как ясно специалисту, они могут изменяться. Кроме того, терминология, примененная в этой заявке, предназначена для целей описания только конкретных воплощений и не предназначена для ограничения и не ограничивает объем того, что раскрыто или заявлено.

Если не указано иное, то все технические и научные термины, термины области техники и аббревиатуры, примененные в этой заявке, имеют значении, общепринятые для понимания специалистом среднего уровня компетенции в области(областях) техники изобретения или в области(областях) техники, где этот термин применяют. Хотя любые композиции, способы, изделия или другие средства или материалы, похожие или эквивалентные, описанным в этой заявке, могут быть применены в практике изобретения, в этой заявке описаны предпочтительные композиции, способы, изделия или другие средства или материалы.

Все патенты, патентные заявки, публикации и другие ссылки, процитированные в этой заявке или на которые ссылаются в этой заявке, включены в эту заявку путем отсылки в той степени, в которой это позволяется регулирующим законодательством. Обсуждение этих ссылок предназначено только для суммирования сделанных в них утверждений. Не делается никакого допущения, что любые такие патенты, патентные заявки, публикации или ссылки или любая их часть относятся к релевантному материалу или к известному уровню техники. Право оспаривать верность и пертинентность любого утверждения, что такие патенты, патентные заявки, публикации и другие ссылки являются релевантным материалом или входят в уровень техники, специфически сохраняется.

Изобретение

Частично, настоящее изобретение возникло из способа для идентификации надежных маркеров экспрессии генов старения в выбранных тканях, разработанного авторами. Способ включает стадию скрининга для поиска дифференциально экспрессирующегося гена в выбранных тканях в большинстве линий, пород или этнических групп у вида, и применяют такой критерий, что кандидат на маркер экспрессии гена должен дифференциально экспрессироваться в большинстве линий, пород или этнических групп, среди которых проводят скрининг. Применяя этот и, необязательно, один или несколько вторичных критериев скрининга, были идентифицированы наборы надежных маркеров экспрессии генов старения в нескольких выбранных тканях.

В некоторых воплощениях изобретения, маркеры применяют для измерения экспрессии, по меньшей мере, одного дифференциально экспрессируемого гена. В предпочтительных воплощениях, маркеры применяют для измерения экспрессии двух или нескольких дифференциально экспрессируемых генов. Измерение экспрессии двух или нескольких дифференциально экспрессируемых генов обеспечивает паттерн экспрессирующихся генов или профиль генной экспрессии для выбранной ткани. Более предпочтительно, может быть проведено измерение множества дифференциально экспрессируемых генов в нескольких выбранных тканях, что обеспечивает дополнительную информацию о паттерне экспрессирующихся генов или профиле генной экспрессии.

В различных воплощениях изобретения, изменения в экспрессии гена могут быть измерены с помощью одного или обоих из следующих способов: (1) измерение транскрипции путем обнаружения мРНК, продуцируемой определенным геном; и (2) измерение трансляции путем обнаружения белка, продуцируемого определенным транскриптом.

Сниженная или увеличенная экспрессия может быть измерена на уровне РНК, с помощью любого способа, хорошо известного в этой области техники для количественного определения полинуклеотидов, такого как, например, PCR (включая, без ограничения, RT-PCR и qPCR), защита от РНКазы, нозерн-блоттинг, микроэррей(чип), макроэррей(чип) и другие способы гибридизация. Гены, которые исследуют или испытывают в соответствии с изобретением, обычно находятся в форме мРНК или обратно транскрибированной мРНК. Гены могут быть клонированы и/или амплифицированы. Клонирование само по себе, похоже, не оказывает влияния на репрезентативность генов в популяции. Однако может быть предпочтительно в качестве источника применять полиА+РНК, поскольку для ее применения требуется меньшее число технологических операций.

Таким образом, в одном из аспектов изобретение обеспечивает способы идентификации маркеров экспрессии генов старения в выбранной ткани. Способы включают отбор одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в ткани у старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, с применением такого критерия, что ген дифференциально экспрессируется в выбранной ткани в большом количестве линий, пород или этнических групп видов, предпочтительно, на заранее заданном уровне значимости (например, p<0,10, p<0,05 или p<0,01). В некоторых воплощениях, ген дифференциально экспрессируется в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более линиях, породах или этнических группах. В других воплощениях устанавливают такой критерий, что ген дифференциально экспрессируется в большинстве протестированных линий, пород или этнических групп и может быть усилен так, чтобы ген должен дифференциально экспрессироваться, по меньшей мере, в 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% протестированных линий, пород или этнических групп.

Способ может быть применен на практике в линиях, породах или этнических группах любого вида. В конкретных воплощениях, вид представляет собой млекопитающее и, в особенности, человека или животное-компаньона, такое как собака или кошка, или других животных-компаньонов, как определены выше.

Ткань, которую выбирают для практического применения способа, может представлять собой любую ткань или орган, включая, но, не ограничиваясь, жировую ткань, мочевой пузырь, кровь, кость, костный мозг, пищеварительный тракт, мозг и центральную нервную систему, молочную железу, бронхи, хрящ, ободочную и прямую кишку, соединительную ткань, эндокринную систему, глаз, женские репродуктивные органы, железы, сердце, кишечник, почку, печень, легкое и назальную/бронхиальную систему, лимфатический узел и лимфоидные органы, мужские репродуктивные органы, ротовую полость и язык, нервную ткань, отличную от мозга/ЦНС, поджелудочную железу, брюшную полость, селезенку и желудок. В примерах осуществления изобретения ткань выбирают из сердца, мышц, мозга или жировой ткани.

Описанный выше способ может включать дополнительные критерии идентификации надежных маркеров старения в выбранных тканях. Например, способ может дополнительно включать тот критерий, что дифференциальная экспрессия гена, дифференциально экспрессируемого у старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, по меньшей мере, частично обращается путем ограничения в калорийности. Способ также может дополнительно включать тот критерий, что известно или предполагается, что ген, дифференциально экспрессируемый у старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, ассоциирован с одной или несколькими связанными со старением физиологическими функциями. Функциональность генного продукта может быть определена экспериментально или по доступной специалисту литературе.

Описанные выше способы применяют для идентификации биомаркеров старения в выбранных тканях. Соответственно, в еще одном аспекте изобретения обеспечивают комбинации, включающие множество полинуклеотидов или экспрессируемых из них белков, которые дифференциально экспрессируются в выбранных тканях старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, в которых полинуклеотиды выбирают из генов, кодирующих белки, перечисленные в таблице 2, таблице 5, таблице 8 или в таблице 10, или их фрагменты. В этих таблицах приведены определения генов, названия генов и номера в базе данных «Entrez», которые позволяют получить полное описание генов и генных продуктов в базе данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI) Национальных институтов здоровья.

В одном из воплощений, выбранная ткань представляет собой сердце, и полинуклеотиды выбирают из генов, кодирующих два или более из следующего: Amyl, Apod, Bdh1, С3, Casq1, Сс18, Kcnd2, Lcn2, Mt2, Myot, Pah, Prkcq, Serpina3n, Skap2, Tmem16k и Vgll2. Из этой группы дифференциальная экспрессия обращается путем ограничения в калорийности в С3, Ссl8, Lcn2, Mt2, Pah, Prkcq, Serpina3n, Tmem16k и Vgl12.

В другом воплощении, выбранная ткань представляет собой жировую ткань, и полинуклеотиды выбирают из генов, кодирующих два или более из следующего: Aspn, Clec4n, Соl6а2, Col18a1, Cox8b, Crip2, Ear11, Emilin2, Otop1, Pla2g2d, Rhbdl3, Slc6a13 и Sycp3. Из этой группы дифференциальная экспрессия обращается путем ограничения в калорийности в Aspn, Со16а2, Crip2, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, Rhbd13 и Slc6al3.

В другом воплощении, выбранная ткань представляет собой мозг, и полинуклеотиды выбирают из генов, кодирующих два или более из следующего: Apod, B2m, Clqa, Clqb, Cd68, Clec7a, Cst7, Ctsd, Gfap, Il33, Lgals3, Lyzs и Sppl. Из этой группы дифференциальная экспрессия обращается путем ограничения в калорийности в Apod, B2m, Clqa, Clqb, Ctsd, Gfap, Il33, Lyzs и Spp1.

В другом воплощении, выбранная ткань представляет собой мышцы, и полинуклеотиды выбирают из генов, кодирующих два или более из следующего: С4, Cdkn2c, Cdsl, Collal, Colla2, Col3al, Dusp26, Edg2, Igh-6, Mt2, Plk2, Rhpn2 и Syt9. Из этой группы дифференциальная экспрессия обращается путем ограничения в калорийности в С4, Cdkn2c, Cdsl, Colla1, Colla2, Col3a1, Edg2, Igh-6, Mt2, Plk2 и Syt9.

В одном из воплощений, комбинация включает два или более полинуклеотида или белка, экспрессируемые из этих полинуклеотидов. Предпочтительно, комбинация включает большинство полинуклеотидов или белков, экспрессируемых из этих полинуклеотидов, обычно, примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более полинуклеотидов или белков или их фрагментов, в качестве подходящих для определенных видов, ткани и применения. Если комбинация включает один или несколько фрагментов, то фрагменты могут быть любого размера, который сохраняет свойства и функцию исходного полинуклеотида или белка, предпочтительно, от примерно 30%, 60% или 90% от оригинала.

Полинуклеотиды и белки могут быть от любого животного, включая людей, в особенности, собак и кошек, в наибольшей особенности, собак. Гомологи полинуклеотидов и белков из разных видов животных могут быть получены с помощью стандартного анализа информации и молекулярных способов, хорошо известных специалисту. Например, название, опубликованный код доступа в базе данных или описание функции гена или белка можно ввести в одну из нескольких общедоступных баз данных, которые создадут список источников, предоставляющих информацию об этом гене из различных видов, включая информацию о последовательности. Одна из таких баз - это база данных information Hyperlinked over Proteins» (iHOP), которая доступна в интернете через URL: . Альтернативно, код доступа открытой базы данных известного гена или белка может быть применен для получения информация о последовательности для этого гена или белка и для поиска гомологов или ортологов в других видах с помощью сопоставительного поиска последовательностей. Например, код доступа гена или белка из мыши, полученный в GenBank, может быть введен в базу данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI) Национальных институтов здоровья, и, таким способом, могут быть получены последовательности ДНК или полипептидные последовательности для этого гена мыши. Применяя те же базы данных, поиск в BLAST можно провести на последовательности ДНК или белка мыши или их фрагментах, в достаточной мере длинных для определения гена или белка, для идентификации последовательностей, обладающих достаточно гомологией из других видов, например, из собаки. Коды доступа последовательностей из других видов, представляющих интерес, можно затем ввести в базу данных для получения информации, относящейся к этим полноразмерным последовательностям нуклеотида или белка, а также другой описательной информации.

В еще одном аспекте изобретения обеспечивают композиции, включающие два или более зонда детекции дифференциальной экспрессии гена в выбранной ткани у старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами. В некоторых воплощениях, выбранная ткань представляет собой сердце, жировую ткань, мозг или мышечную ткань, и зонды включают: (а) полинуклеотиды, которые специфически гибридизуются с двумя или более генами, кодирующими белки, перечисленные в таблице 2, таблице 5, таблице 8 или в таблице 10, или их фрагменты; или (b) агенты, связывающие полипептиды, которые специфически связываются с двумя или более полипептидами, выбранными из белков, перечисленных в таблице 2, таблице 5, таблице 8 или в таблице 10, или их фрагментов.

В одном из воплощений, выбранная ткань представляет собой сердце, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Amyl, Apod, Bdh1, С3, Casq1, Ссl8, Kcnd2, Lcn2, Mt2, Myot, Pah, Prkcq, Serpina3n, Skap2, Tmeml6k и Vgl12. В другом воплощении, выбранная ткань представляет собой жировую ткань, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Aspn, Clec4n, Соl6а2, Col18a1, Cox8b, Crip2, Ear11, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, PvhbdB, Slc6al3 и Sycp3. В другом воплощении, выбранная ткань представляет собой мозг, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Apod, B2m, Clqa, Clqb, Cd68, Clec7a, Cst7, Ctsd, Gfap, I133, Lgals3, Lyzs и Sppl. Еще в одном воплощении, выбранная ткань представляет собой мышцы, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой С4, Cdkn2c, Cdsl, Collal, Colla2, Col3al, Dusp26, Edg2, Igh-6, Mt2, Plk2, Rhpn2 и Syt9.

В конкретных воплощениях, дифференциальную экспрессию обращают путем ограничения в калорийности, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой: (а) С3, Сс18, Lcn2, Mt2, Pah, Prkcq, Serpina3n, Tmeml6k и Vgll2 в сердце; (b) Aspn, Col6a2, Crip2, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, Rhbdl3 и Slc6al3 в жировой ткани; (с) Apod, B2m, Clqa, Clqb, Ctsd, Gfap, 1133, Lyzs и Sppl в мозге; или (d) C4, Cdkn2c, Cdsl, Collal, Colla2, Col3al, Edg2, Igh-6, Mt2, Plk2 и Syt9 в мышцах.

Предпочтительно, композиция включает большинство зондов, обычно, примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500 или более зондов детекции полинуклеотидов или белков или их фрагментов, по необходимости, для определенного вида, ткани и применения. Специалисту ясно, что может быть применено множество разных зондов для единственного целевого гена или белка, для улучшения чувствительности или точности анализа с применением зондов. Например, могут быть применены некоторые олигонуклеотидные зонды, которые специфически гибридизуются с разными последовательностями на полинуклеотиде-мишени. Таким же образом, могут быть применены некоторые антитела, иммунологически специфические для разных эпитопов на белке-мишени.

Один или несколько олигонуклеотидных или полинуклеотидных зондов для исследуемого образца могут быть получены с помощью информации о последовательности для любого из генов, перечисленных в этой заявке, из любого вида, предпочтительно, собаки или кошки. Зонды должны быть в достаточной мере длинными, для того чтобы специфическая гибридизация проходила в значительной степени исключительно с подходящими комплементарными генами или транскриптами. В некоторых воплощениях, олигонуклеотидные зонды, по меньшей мере, имеют длину, равную примерно 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 25 нуклеотидов. В некоторых воплощениях, желательно применять более длинные зонды, по меньшей мере, примерно в 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 нуклеотидов, и в некоторых воплощениях могут подойти зонды длиной более чем примерно 100 нуклеотидов. Зонды могут включать полноразмерные последовательности, кодирующие функциональные белки. Зонды, представляющие собой нуклеиновые кислоты, синтезируют или получают с помощью способов, известных специалистам в этой области техники, например, с помощью синтеза in vitro из нуклеотидов, выделения и очистки из природных источников или энзиматическим расщеплением полинуклеотидов изобретения.

Гибридизационные комплексы, включающие зонды, представляющие собой нуклеиновые кислоты, гибридизованные с полинуклеотидом изобретения могут быть обнаружены с помощью множества способов, известных в этой области техники. В некоторых воплощениях изобретения, для быстрой и специфической детекции полинуклеотидов и профиля их экспрессии могут быть применены иммобилизованные зонды, представляющие собой нуклеиновые кислоты. Обычно, зонд, представляющий собой нуклеиновую кислоту, закрепляют на твердой подложке, и целевой полинуклеотид (например, ген, продукт транскрипции, ампликон, или, чаще всего, смесь после амплификации) гибридизуется с зондом. Как зонд, так и мишень, или оба, могут быть помечены, обычно, флуороформом или другой меткой, такой как стрептавидин. Если помечена мишень, то гибридизацию можно обнаружить, регистрируя флуоресценцию связавшихся комплексов. Если помечен зонд, гибридизацию обычно обнаруживают по тушению метки. Если помечены и зонд, и мишень, то детекцию гибридизации обычно проводят, регистрируя изменение цвета, возникающее в результате сближения двух связанных меток. В этой области техники известно множество стратегий мечения, меток и им подобного, в частности, для приложений, основанных на флуоресценции.

В другом воплощении, зонды включают агенты, связывающие полипептиды, которые специфически связываются с полипептидами, продуцируемыми в результате экспрессии одного или нескольких полипептидов, перечисленных в этой заявке, или их фрагментов. Такие связывающие белки зонды может быть получены с помощью информации о последовательности, доступной для любого из белков, определенных в таблице 2, таблице 5, таблице 8 и таблице 10, или их фрагментов.

Методики анализа, которые могут быть применены для определения количества белка в образце, также хорошо известны специалистам в этой области техники. Такие способы анализа включают радиоиммунологические анализы, анализы по конкурентному связыванию, вестерн-блоттинг и анализы методом ELISA. В способах анализа с применением антител, для применения в изобретении подходят как поликлональные, так и моноклональные антитела. Такие антитела могут быть иммунологически специфическими для определенного белка или эпитопа белка или фрагмента белка, что понятно специалистам в этой области техники. Способы получения поликлональных и моноклональных антител, иммунологически специфических для белка или пептида также хорошо известны в этой области техники.

В предпочтительных воплощениях изобретения могут быть применены антитела для детекции и количественного определения белков, продуцируемых в результате экспрессии генов, описанных в этой заявке. Хотя белки могут быть обнаружены с помощью иммунопреципитации, аффинного разделения, вестерн-блоттинга и подобных способов, в предпочтительном способе применяют технологию по типу ELISA, в котором антитело иммобилизовано на твердой подложке, и целевой белок или пептид инкубируют с иммобилизованным антителом. Как зонд, так и мишень, или оба, могут быть помечены. В этой области техники известно множество стратегий мечения, меток и им подобных.

В еще одном аспекте изобретения обеспечивают устройства, включающие твердую подложку, к которой прикреплена панель, включающая множество зондов для детекции дифференциальной экспрессии гена в выбранной ткани у старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами. В некоторых воплощениях, выбранная ткань представляет собой сердце, жировую ткань, мозг или мышечную ткань, и зонды включают: (а) полинуклеотиды, которые специфически гибридизуются с двумя или более генами, кодирующими белки, перечисленные в таблице 2, таблице 5, таблице 8 или в таблице 10, или их фрагменты; или (b) агенты, связывающие полипептиды, которые специфически связываются с двумя или более полипептидами, выбранными из белков, перечисленных в таблице 2, таблице 5, таблице 8 или в таблице 10, или их фрагментов. В предпочтительном воплощении, устройство применяют для обнаружения дифференциальной экспрессии генов у собак и кошек.

В одном из воплощений, выбранная ткань представляет собой сердце, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Amyl, Apod, Bdhl, С3, Casql, Ссl8, Kcnd2, Lcn2, Mt2, Myot, Pah, Prkcq, Serpina3n, Skap2, Tmeml6k и Vgl12. В другом воплощении, выбранная ткань представляет собой жировую ткань, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Aspn, Clec4n, Соl6а2, Col18a1, Cox8b, Crip2, Ear11, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, Rhbdl3, Slc6al3 и Sycp3. В другом воплощении, выбранная ткань представляет собой мозг, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Apod, B2m, Clqa, Clqb, Cd68, Clec7a, Cst7, Ctsd, Gfap, 1133, Lgals3, Lyzs и Sppl. Еще в одном воплощении, выбранная ткань представляет собой мышцы, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой С4, Cdkn2c, Cdsl, Col1al, Col1a2, Col3a1, Dusp26, Edg2, Igh-6, Mt2, Plk2, Rhpn2 и Syt9.

В конкретных воплощениях, дифференциальную экспрессию обращают путем ограничения в калорийности, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой: (а) С3, Ссl8, Lcn2, Mt2, Pah, Prkcq, Serpina3n, Tmeml6k и Vgl12 в сердце; (b) Aspn, Col6a2, Crip2, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, Rhbdl3 и Slc6al3 в жировой ткани; (с) Apod, B2m, Clqa, Clqb, Ctsd, Gfap, I133, Lyzs и Sppl в мозге; или (d) C4, Cdkn2c, Cdsl, Collal, Colla2, Col3al, Edg2, Igh-6, Mt2, Plk2 и Syt9 в мышцах.

В одном из воплощений, могут быть применены чипы с олигонуклеотидными или полинуклеотидными зондами, тогда как в другом воплощении можно применить чипы с антителами или другими белками, которые связываются с дифференциально экспрессируемыми генными продуктами. Такие чипы могут быть сделаны по индивидуальному заказу в соответствии с известными способами, такими как, например, синтез in-situ на твердой подложке или прикрепление заранее синтезированных зондов к твердой подложке посредством методики микропринтирования. В предпочтительных воплощениях чипы с зондами, представляющими собой нуклеиновые кислоты, или белок-связывающие зонды изготовляют по индивидуальному заказу для специфической детекции транскриптов или белков, продуцируемых двумя или более из следующего: дифференциально экспрессируемыми генами или фрагментами генов, описанными в этой заявке.

В еще одном аспекте изобретения обеспечивают способы детекции дифференциальной экспрессия одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в выбранной ткани у старых субъектов в сравнении со стандартом или с молодыми субъектами. В конкретных воплощениях ткань представляет собой сердце, жировую ткань, мозг или мышцы, и способы обычно включают: (а) обеспечение зондов, включающих (i) полинуклеотиды, которые специфически гибридизуются с двумя или более генами, кодирующими белки, перечисленные в таблице 2, таблице 5, таблице 8 или в таблице 10, или их фрагменты; или (ii) агенты, связывающие полипептиды, которые специфически связываются с двумя или более полипептидами, выбранными из белков, перечисленных в таблице 2, таблице 5, таблице 8 или в таблице 10, или их фрагментов; (b) добавление зондов к образцу, включающему мРНК или белки из старого субъекта, так чтобы сделать возможным гибридизацию или связывание зондов с мРНК или белками в образце, формируя таким способом комплексы гибридизации или связывания в образце; (с) необязательно, добавление зондов к другому образцу, включающему мРНК или белки из молодого субъекта, так чтобы сделать возможным гибридизацию или связывание зондов с мРНК или белками во втором образце, формируя таким способом комплексы гибридизации или связывания в другом образце; (d) детекцию гибридизационных комплексов в образце или образцах; и (е) сравнение комплексов гибридизации или связывания из первого образца с комплексами гибридизации или связывания из стандарта или, необязательно, из другого образца, в котором, по меньшей мере, одно различие между количеством гибридизации или связывания в образце в сравнении со стандартом или необязательным другим образцом указывает на дифференциальную экспрессию одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых у старых субъектов.

Способ может быть применен для обнаружения дифференциальной экспрессии генов, кодирующих генные продукты, приведенные в таблицах 2, 5, 8 или 10 или в дополняющих их таблицах. Таким образом, в одном из воплощений, выбранная ткань представляет собой сердце, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Amyl, Apod, Bdhl, С3, Casql, Ссl8, Kcnd2, Lcn2, Mt2, Myot, Pah, Prkcq, Serpina3n, Skap2, Tmeml6k и Vgll2. В другом воплощении, выбранная ткань представляет собой жировую ткань, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Aspn, Clec4n, Со16а2, Col18al, Сох8b, Crip2, Earll, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, RhbdB, Slc6al3 и Sycp3. В другом воплощении, выбранная ткань представляет собой мозг, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Apod, B2m, Clqa, Clqb, Cd68, Clec7a, Cst7, Ctsd, Gfap, 1133, Lgals3, Lyzs и Sppl. Еще в одном воплощении, выбранная ткань представляет собой мышцы, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой С4, Cdkn2c, Cdsl, Colla1, Col1a2, Col3al, Dusp26, Edg2, Igh-6, Mt2, Plk2, Rhpn2 и Syt9.

В конкретных воплощениях, дифференциальную экспрессию обращают путем ограничения в калорийности, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой: (а) СЗ, Ссl8, Lcn2, Mt2, Pah, Prkcq, Serpina3n, Tmeml6k и Vgl12 в сердце; (b) Aspn, Col6a2, Crip2, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, RhbdB и Slc6al3 в жировой ткани; (с) Apod, B2m, Clqa, Clqb, Ctsd, Gfap, I133, Lyzs и Sppl в мозге; или (d) C4, Cdkn2c, Cds1, Col1al, Col1a2, Col3a1, Edg2, Igh-6, Mt2, Plk2 и Syt9 в мышцах.

В предпочтительном воплощении, способ применяют для детекции дифференциальной экспрессии генов у собак и кошек. В конкретных воплощениях зонды связывают с подложкой, предпочтительно, в форме чипа.

Стадия (с) и часть стадий (d) и (е) необязательны, и их применяют, если необходимо провести относительно одновременное сравнение двух или нескольких анализируемых систем (т.е. тканей из старого и молодого субъектов). Однако в другом воплощении, стандарт, применяемый для сравнения, основан на данных, полученных ранее с применением способа. В этом воплощении, зонды приводят в контакт с образцом для формирования комплексов гибридизации или связывания, которые детектируют и сравнивают с комплексами стандарта. Различия между комплексами гибридизации или связывания из образца и стандарта указывают на дифференциальную экспрессию полинуклеотидов и, следовательно, генов, дифференциально экспрессируемых в ткани старого субъекта по сравнению со стандартом, который может включать мРНК, предварительно выделенную из молодого субъекта или «стандартного» субъекта другого типа. В предпочтительном воплощении, зонды изготавливают для специфической детекции полинуклеотидов или их фрагментов, продуцируемых одним или несколькими генами или фрагментами генов, идентифицируемых с помощью изобретения. Способы детекции гибридизационных комплексов известны специалистам в этой области техники.

Анализы, описанные в этой заявке, в которых применяют тканеспецифические биомаркеры для обнаружения связанных со старением продуктов транскрипции и трансляции, могут быть применены в способах определения физиологического возраста ткани у субъекта. Такие способы могут быть полезны для осуществления, содействия или проведения омолаживающего курса лечения, такого как ограничение в калорийности, и/или диеты. Такие способы включают получение образца выбранной ткани из субъекта, проходящего такой курс лечения. Образец ткани затем анализируют на измененную экспрессию одного или нескольких генов, ассоциированных с молодым по сравнению со старым фенотипом, применяя генный или белковый чип или другой способ детекции, как описано в этой заявке. Результаты анализа выявят, эффективен ли курс лечения в замедлении или обращении процесса старения в ткани.

В еще одном аспекте изобретения обеспечивают способы обнаружения того, действительно ли тестируемое вещество полезно для обращения или замедления процесса старения, по меньшей мере, в одной выбранной ткани при введении животному. Способы включают (а) определение первого профиля экспрессии генов путем измерения продуктов транскрипции или трансляции двух или нескольких полинуклеотидов, которые выбирают из генов, кодирующих белки, перечисленные в таблице 2, таблице 5, таблице 8 или в таблице 10, или их фрагменты, в тестируемой системе в отсутствии тестируемого вещества; (b) определение второго профиля экспрессии генов путем измерения продуктов транскрипции или трансляции двух или нескольких полинуклеотидов, которые выбирают из генов, кодирующих белки, перечисленные в таблице 2, таблице 5, таблице 8 или в таблице 10, или их фрагменты, в тестируемой системе в присутствии тестируемого вещества; и (с) сравнение первого профиля экспрессии генов со вторым профилем экспрессии генов, при котором изменение во втором профиле экспрессии генов в сравнении с первым профилем экспрессии генов указывает на то, что тестируемое вещество вероятно полезно для обращения или замедления процесса старения при введении животному. При сравнении первого профиля экспрессии генов со вторым профилем экспрессии генов, сравнение может быть проведено как на уровне индивидуального продукта транскрипции или трансляции, так и как среднее изменение признаков старения для всех продуктов транскрипции или трансляции. Этот способ полезен для определения показателя замедления старения.

В одном из воплощений, выбранная ткань представляет собой сердце, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Amyl, Apod, Bdh1, С3, Casql, Сс18, Kcnd2, Lcn2, Mt2, Myot, Pah, Prkcq, Serpina3n, Skap2, Tmeml6k и Vgl12. В другом воплощении, выбранная ткань представляет собой жировую ткань, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Aspn, Clec4n, Соl6а2, Col18a1, Cox8b, Crip2, Earl1, Emilin2, Otop1, Pla2g2d, RhbdB, Slc6a13 и Sycp3. В другом воплощении, выбранная ткань представляет собой мозг, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой Apod, B2m, Clqa, Clqb, Cd68, Clec7a, Cst7, Ctsd, Gfap, I133, Lgals3, Lyzs и Sppl. Еще в одном воплощении, выбранная ткань представляет собой мышцы, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой С4, Cdkn2c, Cds1, Col1a1, Col1a2, CoBal, Dusp26, Edg2, Igh-6, Mt2, Plk2, Rhpn2 и Syt9.

В конкретных воплощениях, дифференциальную экспрессию обращают путем ограничения в калорийности, и белки, кодируемые дифференциально экспрессируемыми генами, представляют собой: (а) С3, Ссl8, Lcn2, Mt2, Pah, Prkcq, Serpina3n, Tmeml6k и Vgll2 в сердце; (b) Aspn, Col6a2, Crip2, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, RhbdB и Slc6al3 в жировой ткани; (с) Apod, B2m, Clqa, Clqb, Ctsd, Gfap, I133, Lyzs и Sppl в мозге; или (d) C4, Cdkn2c, Cdsl, Colla1, Colla2, Col3a1, Edg2, Igh-6, Mt2, Plk2 и Syt9 в мышцах.

В некоторых воплощениях, способ может дополнительно включать стадию сравнения, по меньшей мере, второго профиля экспрессии генов с контрольным или стандартным профилем экспрессии генов, полученным путем измерения продуктов транскрипции или трансляции двух или нескольких полинуклеотидов, которые выбирают из генов, кодирующих белки, перечисленные в таблицах 2, 5, 8 или 10, или их фрагменты, в тестируемой системе в присутствии эталонного вещества или композиции, о которых известно, что они обращают или замедляют старение в определенной ткани или тканях при введении животным.

В одном из воплощений, тестируемая система включает популяцию культивируемых клеток. Конструкт нуклеиновой кислоты, включающий связанный со старением ген в соответствии с изобретением, вводят в культуру клеток-хозяев. Клетки-хозяева могут представлять собой линии клеток млекопитающих, такие как, но, не ограничиваясь, NIH3T3, СНО, HELA и COS, хотя также могут быть применены клетки, не принадлежащие млекопитающим, такие как клетки дрожжей, бактерий и насекомых. Кодирующие последовательности генов функционально связаны с соответствующими регуляторными элементами экспрессии, которые подходят для применения в определенных клетках-хозяевах. Конструкты нуклеиновой кислоты могут быть введены в клетки-хозяева в соответствии с любым способом, применяемым в этой области техники, включая, но, не ограничиваясь, трансфекцию, трансформацию, осаждение фосфатом кальция, электропорацию и липофекцию. Такие методики хорошо известны и рутинно применяются в этой области техники. Трансформированные клетки также могут быть применены для идентификации соединений, модулирующих экспрессию связанных со старением генов.

Анализы экспрессии гена могут быть проведены с помощью генного конструкта, включающего промотор селективно связанного со старением гена, функционально связанный с геном-репортером. Конструкт репортера может быть введен в подходящую культуру клеток, включая, без ограничения, описанные выше стандартные линии клеток-хозяев или клетки недавно изолированные из субъекта, такие как клетки жировой ткани или мышечные клетки. Анализ проводят путем регистрации экспрессии гена-репортера в присутствии или в отсутствии тестируемого компонента.

В предпочтительном воплощении, тестируемая система включает животных. Обычно, тестируемый компонент вводят субъекту и анализируют профиль экспрессии генов в выбранной ткани субъекта для определения эффекта тестируемого компонента на транскрипцию или трансляцию связанных со старением генов или генных продуктов по изобретению. Для определения эффекта тестируемого компонента экспрессия гена может быть проанализирована in situ или ex vivo. В другом воплощении, тестируемый компонент вводят субъекту и анализируют активность белка, экспрессируемого из гена in situ или ex vivo в соответствии с любым способом, применяемым в этой области техники для определения эффекта тестируемого компонента на активность белков, представляющих интерес. Кроме того, если тестируемый компонент вводят субъекту, то можно также оценить физиологический, системный и физический эффекты соединения, а также потенциальную токсичность соединения.

Тестируемые вещества могут представлять собой любое вещество и комбинацию веществ, которые могут иметь влияние на полинуклеотиды или гены, дифференциально экспрессируемые в выбранных тканях старого субъекта при сравнении с молодым субъектом. Подходящие тестируемые вещества включают, но не ограничиваются, аминокислоты; белки, пептиды, полипептиды, нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды, полинуклеотиды, малые молекулы, макромолекулы, витамины, минералы, простые сахара; сложные сахара; полисахариды; углеводы; триглицериды со средней длиной цепи (МСТ); триацилглицериды (TAGs); n-3 (омега-3) жирные кислоты, включая DHA, ЕРА, ALA; n-6 (омега-6) жирные кислоты, включая LA, γ-линоленовую кислоту (GLA) и ARA; SA, конъюгированную линолевую кислоту (CLA); источники холина, такие как лецитин; жирорастворимые витамины, включая витамин А и его предшественнники, такие как каротиноиды (например, (β-каротин), источники витамина D, такие как витамин D2 (эргокальциферол) и витамин D3 (холекальциферол), источники витамина Е, такие как токоферолы (например, α-токоферол) и токотриенолы, и источники витамина К, такие как витамин К1 (филлохинон) и витамин К2 (менадион); водорастворимые витамины, включая витамины В, такие как рибофлавин, ниацин (включая никотинамид и никотиновую кислоту), пиридоксин, пантотеновую кислоту, фолевую кислоту, биотин и кобаламин; и витамин С (аскорбиновую кислоту); антиоксиданты, включая некоторые из перечисленных выше витаминов, в особенности, витамины Е и С; также биофлавоноиды, такие как катехин, кверцетин и теафлавин; хиноны, такие как убихинон; каротиноиды, такие как ликопин и ликоксантин; ресвератрол; и α-липоевую кислоту; L-карнитин; D-лимонен; глюкозамин; S-аденозилметионин; и хитозан. В предпочтительном воплощении, тестируемые вещества представляют собой питательных веществ, которые могут быть добавлены к пище или потреблены в качестве пищевой добавки. Вещества, идентифицированные с помощью вышеизложенного способа, также рассматривают как часть изобретения.

В еще одном аспекте изобретения обеспечивают наборы, включающие, в отдельных контейнерах в разовой упаковке или в отдельных контейнерах в виртуальной упаковке, два или более зонда для детекции дифференциальной экспрессии гена в выбранной ткани у старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами. В некоторых воплощениях, ткань представляет собой сердце, жировую ткань, мозг или мышечную ткань, и зонды включают (а) полинуклеотиды, которые специфически гибридизуются с двумя или более генами, кодирующими белки, перечисленные в таблице 2, таблице 5, таблице 8 или в таблице 10, или их фрагменты; или (b) агенты, связывающие полипептиды, которые специфически связываются с двумя или более полипептидами, выбранными из белков, перечисленных в таблице 2, таблице 5, таблице 8 или в таблице 10, или их фрагменты; в которых набор дополнительно включает, по меньшей мере, одно из следующего: (1) инструкции по применению зондов в анализе экспрессии гена для детекции дифференциальной экспрессии гена в выбранных тканях субъектов, (2) реагенты и оборудование для применения зондов и (3) композицию, о которой известно, что она обращает или замедляет процесс старения в выбранной ткани при введении субъекту.

Если набор включает виртуальную упаковку, то набор ограничен инструкциями в виртуальной среде в комбинации с одним или несколькими физическими компонентами набора. В одном из воплощений, набор содержит зонды и/или другие физические компоненты и инструкции по применению зондов, а другие компоненты доступны через интернет. Набор может содержать дополнительные единицы оборудования, такие как устройство для перемешивания образцов, зондов и реагентов и устройство для применения набора, например, пробирки или принадлежности для перемешивания.

В еще одном аспекте изобретения обеспечивает компьютерные системы, включающие базу данных, содержащую информация о полинуклеотидах, которые дифференциально экспрессируются в выбранной ткани старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами. Эта база данных может содержать информацию, определяющую уровень экспрессии одного или нескольких полинуклеотидов, которые выбирают из генов, кодирующих белки, перечисленные в таблицах 2, 5, 8 или 10, и/или полипептидов, которые специфически связываются с белками, перечисленными в таблицах 2, 5, 8 или 10, и пользователь связывается с компьютером, для того чтобы воспользоваться базой данных, в частности, для того чтобы ввести, обработать и ознакомиться с информацией для разных животных или категорий животных. В одном из воплощений, база данных дополнительно содержит информацию об уровне активности одного или нескольких полипептидов, перечисленные в таблицах 2, 5, 8 или 10. В другом, база данных дополнительно включает информацию о последовательностях для одного или нескольких полинуклеотидов или полипептидов, таких как те, что перечислены в таблицах 2, 5, 8 или 10, предпочтительно, из различных видов. В других воплощениях, база данных содержит дополнительную информация, имеющую отношение к описанию генов в одном или нескольких видах животных. Компьютерная система представляет собой любое электронное устройство, способное хранить и обрабатывать данные и взаимодействовать с пользователем, например, обычный компьютер или аналитический инструмент, разработанный так, чтобы облегчать применение изобретения и выводящий результаты применительно к статусу животного.

В еще одном аспекте изобретения обеспечивает носитель информации для передачи информации об одной или нескольких композициях и способах, описанных в этой заявке, или инструкции для них. Такой носитель обычно включает документы, цифровые накопители, оптические накопители, звуковые презентации, визуальные изображения или им подобные, содержащие информацию или инструкции. Например, средства передачи данных могут представлять собой вывод данных на вэб-сайт, интерактивный терминал, брошюру, ярлык на изделии, листок-вкладыш в упаковку, рекламное сообщение, раздаточный информационный материал, аудиозапись с публичным сообщением, видеозапись, DVD, CD, читаемый компьютером чип, читаемый компьютером карта, читаемый компьютером диск, память компьютера или любая их комбинация. Полезная информация включает один или несколько из следующего: (1) способы стимуляции здоровья и хорошего состояния животных и (2) контактная информация для использования лицами, ухаживающими за животными, если у них возникнет вопрос об изобретение и его применении. Полезные инструкции включают методики для применения зондов, инструкции для проведения анализа экспрессии генов и по количеству вводимых веществ и частоте их введения. Средства сообщения полезны для получения информации по преимуществам применения изобретения.

ПРИМЕРЫ

Различные аспекты изобретения могут быть дополнительно проиллюстрированы следующими примерами. Понятно, что эти примеры предназначены только для иллюстрации и не ограничивают объем изобретения, раскрытого в этой заявке, если специально не указано иное.

Пример 1

Этот пример кратко описывает исследование, проведенное для тестирования способности некоторых комбинаций веществ имитировать эффекты увеличения продолжительности жизни, вызываемые ограничениями в потреблении калорий (CR) без уменьшения пищевого рациона. Мышей C57BL6 содержали на контрольной диете, основанной на формуле AIN93M (Американский институт питания (AIN)), синтетическая диетическая формула для содержания зрелых грызунов) или на диете с похожей композицией питательных веществ, но содержащей 25%-ное ограничение в калориях (CR)

Ткани собирали от мышей, находившихся на контрольной диете на пятом и 25-ом месяцах жизни; ткани от мышей, получавших дополнительные питательные вещества, собирали на 25-ом месяце жизни. Из ткани выделяли РНК и определяли изменения в экспрессии гена с помощью qPCR, применяя прибор «realplex2» компании «Eppendorf». Данные для индивидуальных генов приведены в некоторых из следующих примеров.

Пример 2

Этот пример описывает идентификацию биомаркеров старения в сердечной ткани.

Для идентификации изменения экспрессии гена в сердце семи линий мышей (129, C57BL6, Balbc, С3Н, СВА, DBA и B6C3HF1) применяют чип «Mouse Genome 430 2.0» компании «Affymetrix». Значительное изменение в экспрессии определяют с помощью двусторонних t-критериев для молодых против старых мышей (Р<0,05, n=7 мышей на породу на возрастную группу). Молодых мышей тестируют на 5-ом месяце жизни, старых мышей тестируют на 25-ом месяце жизни. В таблице 1 приведены ряд генов, экспрессия которых значительно изменяется с возрастом в каждой линии (Р<0,05), и в таблице 2 перечислены гены, экспрессия которых изменяется, по меньшей мере, в четырех из семи линиях.

Таблица 1
Линия Число транскриптов
129 4954
B6 2190
Balbc 2137
C3H 3236
CBA 1118
DBA 1521
Fl 1287
Таблица 2
Символ гена Название гена Номер в базе данных Entrez Gene»
Adh1 алкоголь дегидрогеназа 1 (класс I) 11522
Agtrl1 ангиотензин рецептор-подобный 1 23796
Akrlb8 альдо-кето-редуктаза семейства 1, член В8 14187
Aldhla1 альдегидцегидрогеназа семейства 1, субсемейства А1 11668
Alox5ap белок, активирующий арахидонат-5-липоксигеназу 11690
Amy1 амилаза 1, слюна 11722
Angpt12 ангиопоэтин-подобный 2 26360
Ankrd1 анкириновый повтор 1 домен (сердечные мышцы) 107765
Anxa1 аннексии А1 16952
Apod аполипопротеин D 11815
Apoe аполипопротеин Е 11816
Asah31 N-ацилсфингозин-амидогидролаза 3 - подобный 230379
Asph аспартат-бета-гидроксилаза 65973
Atp6v0e2 АТРаза, Н+-транспортирующая, липосомальная, V0 субъединица Е2 76252
Atp6vlcl АТРаза, Н+-транспортирующая, липосомальная, VI субъединица С1 66335
Atp9a АТРаза, класс II, тип 9А 11981
Atxn10 атаксин 10 54138
ВС023892 последовательность кДНК BC023892 212943
Bckdhb дегидрогеназа кетокислот с разветвленной цепью Е1, бета-полипептид 12040
Bdhl 3-гидроксибутират-дегидрогеназа, тип 1 71911
Bre белок, экспрессирумый в мозге и в репродуктивных органах 107976
Bysl бистин-подобный 53414
Clr компонент комплемента 1, r - субкомпонент 50909
C3 компонент комплемента 3 12266
Cacna2dl альфа-2-дельта-субъединица 1 потенциал-зависимых кальциевых каналов 12293
Camk2nl ингибитор 1 кальций/кальмодулин-зависимой протеинкиназы II 66259
Casql кальсеквестрин 1 12372
Ccdc72 содержащий биспиральный домен 72 66167
Ccl6 хемокина лиганд (С-С мотива) 6 20305
Ccl8 хемокина лиганд (С-С мотива) 8 20307
Ccndl циклин D1 12443
Cdl63 CD 163 антиген 93671
Cdh22 кадгерин 22 104010
Cebpd ССААТ/энхансер связывающий белок (С/ЕВР), дельта 12609
Cfb фактор комплемента В 14962
Chek2 гомолог чекпойнт киназы СНК2 (S. pombe) 50883
Churcl содержащий черчилль-домен 1 211151
Cilp белок промежуточного слоя хряща, нуклеотид-пирофосфогидролаза 214425
Ckb креатинкиназа, мозг 12709
Clic5 внутриклеточный хлоридный канал 5 224796
Col3al проколлаген, тип III, альфа 1 12825
Col8al проколлаген, тип VIII, альфа 1 12837
Cp церулоплазмин 12870
Cpxm2 карбоксипептидаза X 2 (семейства Ml4) 55987
Ctgf фактор роста соединительной ткани 14219
Ctss катепсин S 13040
Cxcll4 хемокин (С-Х-С мотив) лиганд 14 57266
Cyb5r3 цитохром-b5-редуктаза 3 109754
Cyp27al цитохром-Р450, семейства 27, субсемейства а, полипептид 1 104086
Dalrd3 DALR-антикодон-связывающий домен, содержащий 3 67789
Dbnl дребрин-подобный 13169
Dhrsl дегидрогеназа/редуктаза (семейства SDR), член 1 52585
Dhrs7c дегидрогеназа/редуктаза (семейства SDR), член 7С 68460
Dpepl дипептидаза 1 (почки) 13479
EG665317 предсказываемый ген, EG665317 665317
Ehbplll ЕН домен-связывающий белок 1 -подобный 1 114601
Ehmt2 лизин-N-метилтрансфераза 2 эухроматического гистона 110147
Enpp2 эктонуклеотид-пирофосфатаза/фосфодиэстераза 2 18606
Fadsl десатураза жирных кислот 1 76267
Fbln2 фибулин 2 14115
Fcgr3 рецептор Fc, IgG, низкоаффинный III 14131
Fez2 белок фасцикуляции и элонгации зета 2 (зигин II) 225020
Fgfrlop2 партнер онкогена FGFR1 2 67529
Fkbp5 РК506-связывающий белок 5 14229
Fmo2 флавин-содержащая монооксигеназа 2 55990
Ftl2 легкая цепь ферритина 2 14337
Fxyd6 FXYD домен-содержащий регулятор ионного транспорта 6 59095
Fzrl остановка (fizzy) клеточного деления 20-родственный 1 (Дрозофила) 56371
Gcdh глутарил-коэнзим А-дегидрогеназа 270076
Gda гуаниндезаминаза 14544
Gpm6b гликобелок m6b 14758
Hlxl H2.0-подобный гомеобокс 1 (Дрозофила) 15284
Hod гомеобокса единственный домен 74318
Hplbp3 белок гетерохроматина 1, связывающий белок 3 15441
Icaml внутриклеточной адгезии молекула 15894
Ier3 немедленно-ранний ответ 3 15937
Ifitl интерферон-индуцируемый белок с тетратрикопептидными повторами 1 15957
I14ra рецептор интерлейкина 4, альфа 16190
Isocl содержащий домен изохоризматазы 1 66307
Itm2a интегральный мембранный белок 2А 16431
Jph2 джанктофилин 2 59091
Kbtbd2 kelch-повтор и ВТВ (POZ) домен-содержащий 2 210973
Kcnd2 калиевый потенциал-зависимый канал, относящийся к семейству Shal, член 2 16508
Kcnel калиевый потенциал-зависимый канал, Isk-родственного подсемейства, член 1 16509
Klhdcl kelch-содержащий домен 1 271005
Lcn2 липокалин 2 16819
Lectl лейкоцитарный хемотаксин 1 16840
Letml трансмембранный белок, содержащий лейциновую молнию-EF-хенд (EF-hand) 1 56384
Lgals3bp лектин, галактозид-связывающий, растворимый, 3-связывающий белок 19039
Lrpl белок, родственный рецептору липопротеина низкой плотности 1 16971
Lrpll белок, родственный рецептору липопротеина низкой плотности 11 237253
Ly6a лимфоцитарный антигенный комплекс 6, локус А 110454
Man2al маннозидаза 2, альфа 1 17158
Mef2a энхансерный фактор миоцитов 2А 17258
Mfge8 белок жировых глобул молока-EGF фактор 8 17304
Mgp Gla белок матрикса 17313
Mier3 мезодермальный индуцирующий ранний ответ 1, член семейства 3 218613
Mlf1 фактор 1 миелолейкоза 17349
Mrcl рецептор С маннозы, тип 1 17533
Mt2 металлотионеин 2 17750
Mybpc3 миозин-связывающий белок С, сердечный 17868
Myom2 миомезин 2 17930
Myot муотилин 58916
Ndrg4 N-myc ген, регулирующий последующие звенья сигнальных каскадов 4 234593
Nfkbia ингибитор ядерного фактора, энхансера гена kappa легкой цепи в В-клетках, альфа 18035
Npr3 рецептор натрийуретического пептида 3 18162
Nt5c2 5'-нуклеотидаза, цитозольная II 76952
Oas2 2'-5' олигоаденилатсинтетаза 2 246728
Osmr рецептор онкостатина М 18414
Pah фенилаланингидроксилаза 18478
Pbxipl белок, взаимодействующий с фактором 1 транскрипции пре-В-клеточной лейкемии 229534
Pdelc фосфодиэстераза 1С 18575
Pdlim4 PDZ и LIM домен 4 30794
Pgm5 фосфоглюкомутаза 5 226041
Phldal подобный гомологу плекстрина домен, семейства А, член 1 21664
Pkn2 протеинкиназа N2 109333
Pld3 фосфолипаза семейства D, член 3 18807
Plp2 белок протеолипид 2 18824
Postn периостин, специфический фактор остеобластов 50706
Ppplr3b белок фосфатаза 1, регулятор (ингибитор) субъединицы ЗВ 244416
Prg4 протеогликан 4 (мегакариоцит-стимулирующий фактор, белок поверхностной зоны суставов) 96875
Prkarla протеинкиназа, сАМР-зависимый регулятор, тип I, альфа 19084
Prkcq протеинкиназа С, тета 18761
Ranbp5 RAN-связывающий белок 5 70572
Rnf5 белок RING пальцев 5 54197
Rpl31 рибосомальный L3-подобный белок 66211
Rras Онкоген саркомы крыс Харви, подгруппа R 20130
Rtn2 ретикулон 2 (ассоциированный с Z-бэндом белок) 20167
Rtn4 ретикулон 4 68585
Scnlb натриевый канал, потенциал-зависимый, тип I, бета 20266
Scn4b натриевый канал, тип IV, бета 399548
Serpina3n ингибитор сериновой (или цистеиновой) пептидазы, ветвь А, член 3N 20716
Serpine2 ингибитор сериновой (или цистеиновой) пептидазы, ветвь Е, член 2 20720
Skap2 фосфобелок ассоциированный с 2згс-семейством 54353
Slc6a6 член 6 семейства переносчиков растворенных веществ 6 (переносчик нейромедиаторов, таурин), 21366
Snx10 сортирующий нексин 10 71982
Socs3 супрессор цитокинного сигнала 3 12702
Srf фактор ответа сыворотки 20807
Svep1 суши фактор фон Виллебранда типа A, EGF и пентраксин домен содержащий 1 64817
Tbcld10c семейство ТВС1 домен, член 10 с 108995
Tfpi ингибитор тканевого фактора 21788
Tgfb2 трансформирующий фактор роста, бета 2 21808
Tgm2 трансглутаминаза 2, полипептид С 21817
Thbs2 тромбоспондин 2 21826
Thbs4 тромбоспондин 4 21828
Timp2 тканевой ингибитор металлопротеиназы 2 21858
Tlnl талин 1 21894
Tmeml6k трансмембранный белок 16К 102566
Tmeml76a трансмембранный белок 176А 66058
Tmem43 трансмембранный белок 43 74122
Tnfaip8 фактор некроза опухоли, альфа-индуцируемый белок 8 106869
Tomm40 транслоказа гомолога 40 наружней митохондриальной мембраны (дрожжи) 53333
Tpte2 трансмембранная фосфоинозитид-3-фосфатаза и гомолог тензина 2 57914
Trim47 белок 47 с трехчастным мотивом 217333
Tspanl3 тетраспанин 13 66109
Tspanl7 тетраспанин 17 74257
Uaplll UDP-N-ацетилглюкозамин-пирофосфорилаза 1 - подобный 1 227620
Ube2z убиквитин-конъюгирующий энзим E2Z (предполагаемый) 268470
Uchll убиквитин-карбоксиконцевая гидролаза L1 22223
Vgll2 рудимент-подобный гомолог 2 (Дрозофила) 215031
Vwf гомолог фактора фон Виллебранда 22371
Wdrl3 WD-повторяющися домен 13 73447
Wisp2 WNTl-индуцибельный белок сигнального пути 2 22403
Wtap белок, ассоциированный с опухолью Вильмса 1 60532
Yipf7 семейство Yip 1-домена, член 7 75581
Zadh2 цинк-связывающая алкогольдегидрогеназа, содержащая домен 2 225791
Zfp697 белок цинковых пальцев 697 242109

Шестнадцать потенциальных маркеров старения сердца отбирают для подтверждения данных, полученных на чипе, с помощью qPCR. Гены отбирают на основании многочисленных факторов, включая (но, не ограничиваясь): обильная экспрессия в эксперименте с микрочипом, явное изменение в экспрессии в линии В6, предварительные сведения о связи гена со старением сердца. С помощью образцов RNA из В6, примененных в исследовании с чипом, qPCR-анализ выявил, что все 16 генов показали изменение в экспрессии с возрастом. Эти гены приведены в таблице 3. Для девяти маркеров из 16 подтвержденных с помощью qPCR маркеров старения сердца, qPCR дополнительно выявил, что их возрастная экспрессия образца обращается с помощью CR, по меньшей мере, примерно, на 32%. Эти девять маркеров - С3, Ссl8, Lcn2, Mt2, Pah, Prkcq, Serpina3n, Tmem16k и Vgl12.

Таблица 3
Символ Название гена Номер в базе
гена данных «Entrez Gene»
Amyl амилаза 1, слюна 11722
Apod аполипопротеин D 11815
Bdhl 3-гидроксибутират дегидрогеназа, тип 1 71911
С3 Компонент комплемента 3 12266
Casq1 кальсеквестрин 1 12372
Сс18 хемокин лиганд (С-С мотива) 8 20307
Kcnd2 калиевый потенциал-зависимый канал, относящийся к семейству Shal, член 2 16508
Lcn2 липокалин 2 16819
Mt2 металлотионеин 2 17750
Myot Миотилин 58916
Pah фенилаланингидроксилаза 18478
Prkcq протеинкиназа С, тета 18761
Serpina3n ингибитор сериновой (или цистеиновой) пептидазы, ветвь А, член 3N 20716
Skap2 фосфобелок ассоциированный с src-семейством 2 54353
Tmem 16k трансмембранный белок 16К 102566
VgH2 рудимент-подобный гомолог 2 (Дрозофила) 215031

Эффекты приведенного в примере 1 применения диеты на специфические маркеры старения сердца описаны ниже, вместе с опубликованной функцией (опубликованными функциями) каждого маркера.

Реакция на стресс

Металлотионеин 2 (Mt2): Известно, что гены металлотионеина индуцируются в ответ на окислительный стресс, и трансгенные мыши, сверхэкспрессирующие металлотионеин 2А человека со специфического для сердца промотора, защищены от доксорубициновой кардиотоксичности. Сообщалось, что Mt2 может защитить сердце от окислительного повреждения, только если он присутствует до индукции окислительного стресса. Следует отметить, что этот ген по данным анализа микрочипа был идентифицирован как возможный супермаркер старения скелетной мышцы, но изменение в экспрессии этого гена не было подтверждено с помощью qPCR. В сердце, мы наблюдали увеличение в экспрессии этого гена с возрастом, которое частично предотвращалось CR.

Аполипопротеин D (Apod): Аполипопротеин D представляет собой член семейства генов липокалина, он вовлечен в иммунный ответ и ответ на стресс.Apod индуцируется в ответ на стресс в мозге, и ранее мы идентифицировали этот ген в качестве супермаркера старения неокортекса мыши. В сердце мыши экспрессия этото гена увеличивается в ~2,5 раза с возрастом, но CR не предупреждает это увеличение.

Липокалин 2 (Lcn2). Ряд сообщений указывают на то, что липокалин 2 индуцируется воспалением и окислительным стрессом, и его увеличению препятствуют ловушки активных форм кислорода, цистеамин и DMSO. Следовательно, Lcn2 может быть полезным биомаркером для идентификации окислительного стресса как in vitro, так и in vivo. В сердце мыши экспрессия этого гена увеличивается примерно в три раза с возрастом и CR полностью предотвращает это увеличение.

Иммунный ответ/Воспаление

Компонент комплемента 3 (С3): Компонент комплемента 3 играет центральную роль в активации системы комплемента. Его активация необходима как для классического, так и для альтернативного пути активация комплемента. Ранее мы идентифицировали близкородственный ген (С4) в качестве супермаркера старения в скелетных мышцах мыши; эти данные находятся в соответствии со многими сообщениями об увеличении иммунной активации с возрастом. В сердце мыши, экспрессия С3 увеличивается примерно в два раза с возрастом, и CR предупреждает это увеличение.

Хемокин лиганд (С-С мотив) 8 (Сс18): Этот цитокин проявляет хемотаксическую активность в отношении моноцитов, лимфоцитов, базофилов и эозинофилов и привлекает лейкоциты в участки воспаления, этот цитокин может вносить вклад в ассоциированную с опухолью инфильтрацию лейкоцитов и в антивурусное состояние в отношении ВИЧ-инфекции. В сердце мыши экспрессия этого гена значительно увеличивается (примерно в шесть раз) с возрастом, и CR частично предупреждает это увеличение.

Протеинкиназа С, тета (Prkcq): Члены семейства протеинкиназ С (РКС) фосфорилируют большое разнообразие белков-мишеней, и известно, что они вовлечены в разнообразные клеточные сигнальные пути. Каждый член семейства РКС обладает специфическим профилем экспрессии, и считается, что он играет отдельную роль. Prkcq необходима для активации Т-лимфоцитов; интересно, что экспрессия близкородственного гена (Prkcz) увеличивается в скелетных мышцах множества линий мышей, хотя это было не подтверждено методом qPCR. В сердце, экспрессия увеличивается примерно в три раза с возрастом, и этому слабо препятствует CR.

Ингибитор сериновой (или цистеиновой) пептидазы, ветвь А, член 3N (Serpina3n): Было показано, что этот ген подавляет опосредуемый гранзимом В апоптоз в цитотоксических Т-лимфоцитах, и общий эффект увеличения экспрессии этого гена может привести к ингибированию апоптоза в иммунных клетках. В сердце мыши экспрессия этого гена увеличивается в четыре раза с возрастом, и CR практически полностью предупреждает это увеличение.

Фосфобелок 2, ассоциированный с src-семейством (Skap2): Белок, кодируемый этим генов, способствует адгезии иммунной клетки в участках воспаления. В сердце мыши экспрессия этого гена увеличивается примерно в два раза с возрастом, и CR не влияет на это увеличение.

Метаболизм

3-Гидроксибутиратдегидрогеназа, тип 1 (Bdh1): Этот ген кодирует члена семейства генов короткоцепочечных дегидрогеназ/редуктаз, и вовлечен в продукцию кетоновых тел путем катализа взаимопревращения ацетоацетата и 3-гидроксибутирата, основных кетоновых тел, продуцируемых в ходе катаболизма жирных кислот. В сердце мыши мы наблюдали слабое увеличение в экспрессии этого гена с возрастом, которое дополнительно увеличивалось под действием CR.

Фенилаланингидроксилаза (Pah):Pah кодирует фермент фенилаланингидроксилазу, которая представляет собой лимитирующую скорость стадию в катаболизме фенилаланина до тирозина. Недостаток активности этого фермента приводит к фенилкетонурии, нарушению с аутосомно-рецессивным типом наследования. В сердце мыши экспрессия этого гена увеличивается примерно в десять раз с возрастом, и CR снижает экспрессию этого гена до примерно в половину от регистрируемой в старых контролях.

Сердечная функция

Амилаза 1 (Amyl). Амилазы представляют собой секретируемые белки, которые гидролизуют 1,4-альфа-гликозидные связи в олигосахаридах и полисахаридах, и, таким образом, катализирует первую стадию расщепления поступающих с пищей крахмала и гликогена. Белок, кодируемый этим геном, может быть связан с сердечной функцией, поскольку сообщалось об увеличении уровня этого белка в плазме крови у людей с хронической сердечной недостаточностью. Ранее мы наблюдали увеличение в экспрессии этого гена в скелетных мышцах во множестве линий мышей, хотя этот ген не был идентифицирован в качестве супермаркера в мышцах. В сердце мыши, экспрессия этого гена увеличивается в ~2,5-раза с возрастом, и CR заметно на нее не влияет.

Гомолог рудимент-подобного 2 (Дрозофила) (Vgl12): Этот ген кодирует транскрипционный кофактор, который активирует дифференциацию скелетных мышц, следовательно, его экспрессия в сердце, вероятно, связана с поддержанием сердечных мышц в целом. В сердце мыши экспрессия этого гена увеличивается в ~7,5-раз с возрастом, и CR предупреждает примерно половину от возрастного увеличения в экспрессии.

Миотилин (Myot): Этот ген кодирует белок, обнаруженный в области z-дисков поперечнополосатых мышц и вовлеченный в поддержание структуры мышц и организацию саркомера. У людей, мутация в этом гене связана с одной из форм мышечной дистрофии. Экспрессия этого гена не сильно увеличивается с возрастом в сердце мыши, и CR не препятствует этому увеличению.

Кальсеквестрин (Casql): Кальсеквестрин представляет собой основной кальций-связывающий белок в саркоплазматическом ретикулуме, и высвобождение ионов кальция, связанных с Casql, приводит к сокращению мышц. Экспрессия этого гена снижается с возрастом, что, возможно, отражает снижение мышечного сокращения с возрастом в целом. Экспрессия этого гена не изменяется под действием CR.

Калиевый потенциал-зависимый канал, относящийся к семейству Shal, член 2 (Kcnd2): Белок, кодируемый этим геном, ответственен за выход калия в сердце, и экспрессия этого гена регулируется другими генами, чувствительными к уровню кальция. Экспрессия этого гена снижается на ~25% с возрастом, но не изменяется под действием CR.

Трансмембранный белок 16К (Tmem16k): Для этого гена нет данных о его функциях, однако согласно базе данных «Gene Ontology consortium» (Консорциум по генной онтологии), он представляет собой интегральный мембранный белок. Экспрессия этого гена увеличивается на ~50% с возрастом, и CR снижает экспрессию этого гена до такого низкого уровня, какой наблюдают у молодых контрольных мышей.

Для оценки общей эффективности вмешательства, разработанного для противодействия возрастным изменениям в экспрессии гена, полезно создать показатель, который позволит сравнивать эффективность вмешательства в противодействии экспрессии маркеров старения сердца. Ниже описаны два показателя, хотя также могут быть разработаны другие анализы. Каждый показатель представляет собой среднее от эффектов воздействия режима питания в противодействии возрастным изменениям в экспрессии гена; первый показатель рассматривает все 16 универсальных маркеров старения сердца, описанных в этом сообщении; второй показатель рассматривает только девять универсальных маркеров, которые изменяются как при старении, так и под действием CR. Для каждого гена «процент предотвращения» рассчитывают как процент изменения при старении, которому противодействует вмешательство. Например, величина, равная «100%», будет указывать на то, что воздействие режима питания поддерживает экспрессию гена на том же уровне, что наблюдают в молодых контролях. Оценка предупреждения, равная более чем 100%, будет указывать на сдвиг в экспрессии гена до уровня, который «моложе» того, что наблюдают в молодых контролях; наоборот, отрицательный процент предотвращения будет указывать на усиление экспрессии гена по сравнению с наблюдаемой в старых контрольных группах. Величины для каждого гена затем усредняют по всей обработке, и результирующий показатель выявляет степень, в которой воздействие может противостоять возрастным изменениям в экспрессии маркеров старения сердца. Для обоих показателей умеренное CR обладает наибольшей способностью противостоять возрастным изменениям в экспрессии маркеров старения сердца.

Пример 3

Этот пример описывает идентификацию транскрипционных маркеров старения в жировой ткани.

Для идентификации изменений в экспрессии гена в эпидидимальной жировой ткани семи линий мышей (129, C57BL6, Balbc, С3Н, СВА, DBA и B6C3HF1) применяют чип «Mouse Genome 430 2.0» компании «Affymetrix». Значительное изменение в экспрессии определяют с помощью двусторонних t-критериев для молодых против старых мышей (Р<0,05, п=7 мышей на линию на возрастную группу). Молодых мышей тестируют на пятом месяце жизни, старых мышей тестируют на 25-м месяце жизни. Таблица 4 показывает число генов, экспрессия которых значительно изменяется с возрастом в каждой линии и в таблице 5 перечислены все гены, экспрессия в которых изменяется, по меньшей мере, в пяти из семи линий.

Таблица 4
Линия Число транскриптов
129 2420
B6 1980
Balbc 1646
С3Н 5391
СВА 5993
DBA 3788
F1 4187
Таблица 5
Символ гена Название гена Номер в базе данных «Entrez gene»
Amotll ангиомотин-подобный 1 75723
Cdc42epl CDC42 эффекторный белок (Rho GTPaзa-связывающий) 1 104445
Chkb холинкиназа, бета 12651
AI597468 экспрессируемая последовательность AI597468 103266
Flna филамин, альфа 192176
Mstlr макрофаг-стимулирующий рецептор 1 (связанная с с-met тирозинкиназа) 19882
Nmb нейромедин В 68039
Nsdl связывающий ядерный рецептор SET-домен, белок 1 18193
Nap 115 белок сборки нуклеосом 1 - подобный 5 58243
Otopl отопетрин 1 21906
Osbpl8 оксистерол-связывающий белок-подобный 8 237542
Pla2g2d фосфолипаза A2, группа HD 18782
Polr2d полимераза (РНК) II (ДНК-направленная), полипептид D 69241
Pcdhb22 протокадгерин бета 22 93893
4921524J17Rik RIKEN кДНК 4921524J17 ген 66714
Rc3h2 RING пальца и СССН-типа домены цинковых пальцев 2 319817
Rbms3 РНК-связывающий мотив, взаимодействующий с одноцепочечными последовательностями белок 207181
Akap2 киназа A (PRKA), якорный белок 2 11641
Aco2 Аконитаза 2, митохондриальная 11429
Acsfi член семейства ацил-СоА-синтетаз 3 257633
Acadl ацил-коэнзим-А-дегидрогеназа, длинноцепочечные 11363
Acadvl ацил-коэнзим А-дегидрогеназа, очень длинноцепочечная 11370
Arf2 фактор ADP-рибозилирования 2 11841
Arl5b подобный фактору ADP-рибозилирования 5В 75869
Ankibl анкириновый повтор и IBR домен содержащий 1 70797
Anxa2 аннексии А2 12306
Aspn Аспорин 66695
Abcd4 АТР-связывающая кассета, суб-семейства D (ALD), член 4 19300
Bmpl костный морфогенентический белок 1 12153
Clgaltlcl С1GALT1-специфический шаперон 1 59048
Cidea индуцирующий гибель клеток фактор фрагментации ДНК, альфа субъединица-подобный эффектор А 12683
Coq9 гомолог коэнзима Q9 (дрожжи) 67914
Col5a2 коллаген, тип V, альфа 2 12832
Col6al коллаген, тип VI, альфа 1 12833
Col6a2 коллаген, тип VI, альфа 2 12834
Col18a1 коллаген, тип XVIII, альфа 1 12822
Clec4n домен лектина С-типа, семейства 4, член n 56620
Crip2 обогащенный цистеином белок 2 68337
Cyb5r1 цитохром Ь5 редуктаза 1 72017
Cox4i1 цитохром с оксидаза, субъединица IV, изоформа 1 12857
Сохбс цитохром с оксидаза, субъединица VIc 12864
Dnmt3a ДНК-метилтрансфераза 3А 13435
Dnaja3 гомолог DnaJ (Hsp40), субсемейство А, член 3 83945
Emilin2 разделитель эластиновых микрофибрил 2 246707
Earll эозинофил-ассоциированный, семейства рибонуклеазы А, член 11 93726
Efempl содержащий эпидермальный фактор роста, фибулин-подобный, белок внеклеточного матрикса 1 216616
Fbxo6 F-бокс белок 6 50762
Fndc3b содержащий домен фибронектина типа III - 3В 72007
Fyttd1 сорок-два-три содержащий домен 1 69823
Gcnt2 глюкозаминил-(N-ацил)-трансфераза 2,1-ветвящий энзим 14538
Gpd2 глицеролфосфатдегидрогеназа 2, митохондриальная 14571
Gnb4 гуаниннуклеотид-связывающий белок (G-белок), бета 4 14696
Hddc3 содержащий HD домен 3 68695
Hfe Гемохроматоз 15216
Hadha гидросиацил-коэнзим A дегидрогеназа/3-кетоацил-коэнзим А тиолаза/еноил-коэнзим А гидратаза (трифункциональный белок), альфа-субъединица 97212
C130006E23 гипотетический белок С130006Е23 331563
Hifla индуцируемый гипоксией фактор 1, альфа-субъединица 15251
Itga6 интегрин альфа 6 16403
Irf7 фактор регуляции интерферона 7 54123
Ldhb лактатдегидрогеназа В 16832
Lacel повышающий лактацию 1 215951
Lxn Латексин 17035
Lenep белок эпителиальной ткани хрусталика 57275
Limsl LIM и стареющих клеток антиген-подобный домены 1 110829
Macrodl содержащий домен MACRO 1 107227
Msln Мезотелин 56047
Myadm маркер, ассоциированный с миелоидной дифференциацией 50918
Gnptg N-ацилглюкозамин-1-фосфотрансфераза, гамма субъединица 214505
Ndufa10 NADH дегидрогеназа (убихинон) 1 альфа, субкомплекс 10 67273
Ndufa5 NADH дегидрогеназа (убихинон) 1 альфа, субкомплекс 5 68202
Ntn4 нетрин 4 57764
Ntrk3 нейротрофическая тирозинкиназа, рецептор, тип 3 18213
Nmnat3 никотинамиднуклеотидаденилилтрансфераза 3 74080
Nidi нидоген 1 18073
Ogdh оксоглутаратдегидрогеназа (липоамид) 18293
Ptcd3 домен с пентатрикопептидным повтором 3 69956
Ppic пептидилпропил изомераза С 19038
Pxdn гомолог перосидазина (Дрозофила) 69675
Kcnjl5 калиевый канал внутреннего очищения, подсемейства J, член 15 16516
EG665378 предсказываемый ген, EG665378 665378
Prss23 протеаза, сериновая, 23 76453
Piml участок провирсной интеграции 1 18712
Rmndl гомолог, требуемый для мейотического ядерного деления 1 (S. cerevisiae) 66084
Rp2h гомолог пигментного ретинита 2 (человек) 19889
ArhgeflO фактор обмена Rho-гуаниннуклеотида (GEF) 10 234094
RhbdB ромбоид, жилко-подобный 3 (Дрозофила) 246104
1810013D10Rik ген RIKEN кДНК 1810013D10 66278
2010005J08Rik ген RIKEN кДНК 2010005J08 72046
2810482I07Rik ген RIKEN кДНК 2810482107 67243
4933439C20Rik ген RIKEN кДНК 4933439С20 66776
9530058B02Rik ген RIKEN кДНК 9530058 В02 68241
D830012I24Rik ген RIKEN кДНК D830012124 320070
Sec23a SEC23A (S. cerevisiae) 20334
Sema4a sema-домен, иммуноглобулина домен (Ig), трансмембранный домен (ТМ) и короткий 20351
цитоплазматический домен, (семафорин) 4A
Serpina3n ингибитор сериновой (или цистеиновой) пептидазы, ветвь А, член 3N 20716
Serpinfl ингибитор сериновой (или цистеиновой) пептидазы, ветвь F, член 1 20317
Serhl подобный сериновой гидролазе 68607
LOCI 00047339 сходный с лизилоксидаза-подобным 2 100047339
LOCI 00046998 сходный с атрофией зрительного нерва 1 (аутосомная доминанта) 100046998
LOCI 00046740 сходный с секретируемым кислым богатым цистеином гликобелоком 100046740
Smcr7 гомолог кандидата 7области хромосомы синдрома Смита-Магениса, (человек) 237781
Slc46a3 семейства переносчиков растворенных веществ 46, член 3 71706
Slc6al3 семейство переносчиков растворенных веществ 6 (переносчик нейромедиаторов, GAB А), член 13 14412
Stard3nl STARD3 N-концевой подобный 76205
Sdhb сукцинатдегидрогеназный комплекс, субъединица В, железо-серный (Iр) 67680
Suclgl сукцинат-СоА-лигаза, GDP-образующий, альфа-субъединица 56451
Sucla2 сукцинат-коэнзим А-лигаза, ADP-образующая, бета-субъединица 20916
Supv311 супрессор varl, 3-подобный 1 (S. cerevisiae) 338359
Syngr1 синаптогирин 1 20972
Sycp3 белок синаптонемалього комплекса 3 20962
Tspan2 тетраспанин 2 70747
Tanc1 тетратрикопептидный повтор, анкириновый повтор и биспиральный-содержащий 1 66860
Timm44 транслоказа внутренней митохондриальной мембранны 44 21856
Usp47 убиквитин-специфическая пептидаза 47 74996
Uckl1 уридин-цитидинкиназа 1-подобный 1 68556
Vpsl3a вакуолярный белок сортирующий 13А (дрожжи) 271564
Vashl вазохибин 1 238328
Vcan Версикан 13003
Wwtrl WW-содержащий домен, регулятор транскрипции 1 97064
Zkscanl7 цинковый палец с KRAB и SCAN доменами 17 268417

Для подтверждения данных, полученных на чипе методом qPCR, отбирают тридцать один потенциальный маркер старения жировой ткани. При отборе генов-кандидатов для подтверждения методом RT-PCR, в первую очередь тестировали гены, экспрессия в которых изменилась во всех линиях. Другие факторы, которые необходимо учитывать, включают исключение генов с низкой экспрессией (которую оценивают по средней интенсивности сигнала в эксперименте с микропанелью) и исключение генов, которые не демонстрируют изменения в экспрессии, по меньшей мере, на 50% (<1,5 или>1,5-кратное изменение). Четыре гена, которые изменились во всех семи линиях, не имели доступного для приобретения праймера и, таким образом, эти гены не могли быть подвергнуты скринингу методом qPCR. Бета-актин (Actb) не изменялся ни в одной из линий и служил в качестве конститутивного гена для qPCR-анализов.

Для оставшихся 27-ми генов, идентифицированных в качестве кандидатов-маркеров старения жировой ткани, применяют qPCR-анализ для тестирования образцов из исследования по кормлению питательными веществами по примеру 1 для подтверждения возрастных изменений и противодействия возрастным изменениям в условиях умеренной CR. Статистически значимое изменение в экспрессии с возрастом при анализе методом qPCR наблюдали для 13 из 27 генов. Данные приведены в таблице 6. Было дополнительно определено, что восемь из этих 13-ти генов изменяются с возрастом, и CR предупреждает, по меньшей мере, примерно 33% возрастного изменения; эти восемь генов представляют собой: Aspn, Соl6а2, Crip2, Emilin2, Otopl, Pla2g2d, RhbdB и Slc6al3.

Таблица 6
Символ гена Название гена Номер в базе данных «Entrez gene»
Aspn Аспорин 66695
Clec4n Домен семейства лектина С-типа 4, член n 56620
Соl6а2 Коллаген, тип VI, альфа 2 12834
Col18a1 Коллаген, тип XVIII, альфа 1 12822
Cox8b Цитохром с оксидаза, субъединица VIIIb 12869
Crip2 Обогащенный цистеином белок 2 68337
Earll Эозинофил-ассоциированный, семейства рибонуклеаз А, член 11 93726
Emilin2 Разделитель эластиновых микрофибрил 2 246707
Otopl Отопетрин 1 21906
Pla2g2d Фосфолипаза А2, группа IID 18782
RhbdB Ромбоид, жилко-подобный 3 (Дрозофила) 246104
Slc6al3 Семейства переносчиков растворенных веществ 6 (переносчик нейромедиаторов, GAB А), член 13 14412
Sycp3 Синаптонемального комплекса белок 3 20962

Функциональная значимость маркеров старения жировой ткани обсуждается ниже. Гены, отвечающие на фактор роста

Аспорин (Aspn): Трансформирующий фактор роста бета (TGF-бета) представляет собой секретируемый белок, который играет роль в поддержании внеклеточного матрикса (ЕСМ), регулируя экспрессию генов, вовлеченных в поддержание цитоскелета (1). Аспорин представляет собой компонент ЕСМ, и было показано, что экспрессия аспорина индуцируется TGF-бета (2) в суставном хряще; мы наблюдали снижение в экспрессии аспорина (2-кратное) в жировой ткани с возрастом. Рассмотренные вместе, эти данные предполагают снижение в поддержании ЕСМ с возрастом в жировой ткани. CR может предупредить это снижение, поскольку CR практически полностью предупреждает возрастное снижение в экспрессии Aspn (1,8-кратное увеличение в старых CR против старых контрольных мышей).

Обогащенный цистеином белок 2 (Crip2): Хотя мало что известно о функции Crip2, похоже, что он принадлежит к семейству белков, вовлеченных в ремоделирование цитоскелета (3), и как с аспорином (выше), было показано, что экспрессия Crip2 индуцируется TGF-бета (4). Уровень экспрессии Crip2 был очень сходен с тем, что наблюдали с аспорином, включая значительное изменение в экспрессии с возрастом (в 2,3 раза), которое предупреждает CR (в 2,0 раза).

Ромбоид, жилко-подобный 3 (Rhbdl3): Белок, кодируемый геном Rhbdl3, характеризуется как наиболее эволюционно консервативная кДНК гена rho дрозофилы, которая модулируется сигналом эпидермального фактора роста, и играет некоторую роль в развитии нервной системы у мышей. Экспрессия этого гена сильно снижается с возрастом, и CR полностью предупреждает возрастные изменения в экспрессии этого гена (изменение в 6,2 раза с возрастом и увеличение в 7,2 раза с CR).

Таким образом, приведенные выше три гена представляют собой универсальные маркеры старения жировой ткани, которые регулируются факторами роста, экспрессия которых может модулироваться режимом питания.

Снижение в ЕСМ в сборке микрофибрилл с возрастом

Коллаген, тип VI, альфа 2 (Соl6а2): Коллаген VI представляет собой компонент внеклеточного матрикса, и мутации по гену Соl6а2 у людей связаны с некоторыми врожденными миопатиями из-за нарушенного образования микрофибрилл (6, 7). Ранее, в нашем исследовании универсальных маркеров старения в скелетных мышцах мыши мы показали, что экспрессия некоторых генов коллагена (Col1al, Col1a2 и Соl3а1) снижается с возрастом, и что этому снижению препятствует CR. Значительное снижение (снижение в 2,1 раза) в Соl6а2 в жировой ткани предполагает падение в поддержании ЕСМ с возрастом из-за снижения в сборке микрофибрилл.

Разделитель эластиновых микрофибрилл 2 (Emilin2). Мало что известно о функции Emilin2, хотя сообщалось о том, что он синтезируется и локализуется в ЕСМ. Emilin2 может выполнять некоторую роль в клеточной смерти через внешний апоптический путь, поскольку связывание апоптических факторов с Emilin2 приводит к активация каспазы. Альтернативно, другие исследователи предполагают, что повышенный уровень в сыворотке белка, кодируемого этим геном, может быть биомаркером рака яичников. В любом случае, наблюдали значительное снижение в экспрессии Emilin2 с возрастом в жировой ткани (-2,1 раза изменение с возрастом), и CR предотвращает возрастное изменение на ~35%.

Увеличение воспаления с возрастом

Фосфолипаза А2, группа IID (Pla2g2d): Фосфолипазы А2 (PLA2) хорошо известны из-за их способности приводить к мобилизации жирные кислоты из фосфолипидов, которые затем превращаются в провоспалительные простагландины и лейкотриены (11). Интересно, что повышенный уровень PLA2 может иметь последствия вне мобилизации липидов, поскольку увеличение внеклеточного PLA2 связано с увеличенным уровнем провоспалительных цитокинов TNFcc и интерлейкина 1 (12). Экспрессия гена Pla2g2d увеличивается в 3,1 раза с возрастом и частично (но незначительно) предупреждается CR (изменение в экспрессии в 1,4 раза).

Менее охарактеризованные гены

Отопетрин 1 (Otopl): Единственное сообщение, касающееся функция Otopl, говорит о том, что он важен для образования отолитов, структур внутреннего уха, которые ответственны за восприятие силы тяжести и нагрузки (13). Поскольку эти структуры формируются путем кристаллизации карбоната кальций, вероятно, что функция этого гена в жировой ткани имеет отношение к гомеостазу кальция. Экспрессия Otopl увеличивается в 3,0 раза с возрастом и частично (но не значительно) предупреждается CR (изменение в экспрессии в 1,5 раза).

Семейства переносчиков растворенных веществ 6, член 13 (Slc6al3): Не существует сообщений относительно функции этого гена у мышей или людей. Однако по единственному исследованию на крысах (14) можно предположить, что белок, кодируемый геном Slc6al3, вовлечен в транспорт нейромедиатора, гамма-аминомасляной кислоты (GABA). Экспрессия Slc6al3 снижается (изменение в 1,8 раз) с возрастом и это снижение частично (но незначительно) предупреждается CR (изменение в 1,3 раза по сравнению со старыми контролями).

Для оценки общей эффективности воздействия, разработанного для противодействия возрастным изменениям в универсальных маркерах старения, полезно создать показатель, который позволит сравнивать, как воздействие противодействует экспрессии универсальных маркеров старения. Соответственно, «показатель предупреждения старения » рассчитывают для описания среднего эффекта воздействия на возрастные изменения в экспрессии восьми универсальных маркеров старения жировой ткани.

Для каждого из восьми универсальных маркеров старения жировой ткани, рассчитывали «процент предотвращения» как процент изменения в старении, которому противодействует воздействие. Например, величина, равная «100%» будет указывать на то, что воздействие режима питания поддерживает экспрессию гена том же уровне, что наблюдают в молодых контролях. Оценка предупреждения, превышающая 100%, будет указывать на сдвиг в экспрессии гена до уровня, который «моложе» того, что наблюдают в молодых контролях; наоборот, отрицательный процент предотвращения будет указывать на то, что экспрессия гена усилилась по сравнению с наблюдаемой в старых контрольных группах. Величины для каждого гена затем усредняют по всей обработке, и результирующий показатель выявляет итоговую степень, в которой воздействие может противостоять возрастным изменениям на уровне транскрипции.

Пример 4

Этот пример описывает идентификацию транскрипционных маркеров старения в мозговой ткани.

Для идентификации изменений в экспрессии гена в неокортексе шести линий мышей (C57BL6, Balbc, С3Н, СВА, DBA и B6C3HF1) применяют чип «Mouse Genome 430 2.0» компании «Affymetrix». Значительное изменение в экспрессии определяют с помощью двусторонних t-критериев для молодых против старых мышей (Р<0,05, n=7 мышей на линию на возрастную группу). Молодых мышей тестируют на пятом месяце жизни, старых мышей тестируют на 25-м месяце жизни.

Таблица 7 показывает число генов, которые значительно изменяются с возрастом в каждой линии. В таблице 8 перечислены все гены, экспрессия в которых изменяется, по меньшей мере, в трех из шести линий.

Таблица 7
Линия Число транскриптов
В6 1029
Balbc 415
СЗН 2151
СВА 1542
DBA 1604
F1 1957
Таблица 8
Символ гена Название гена Номер в базе данных «Entrez gene»
Abca8a АТР-связывающая кассета, подсемейство А (АВС1), член 8а 217258
Adamts14 ADAMTS-подобный 4 229595
Agxt211 аланин-глиоксилат-аминотрансфераза 2-подобный 1 71760
AI465270 экспрессируемая последовательность AI465270 102097
AI838057 экспрессируемая последовательность AI838057 101160
Ак311 аденилаткиназа 3 альфа-подобный 1 11639
Alad аминолевулинат, дельта-, дегидратаза 17025
Alkbh3 alkB, репарация после алкилирования, гомолог 3 (Е. coli) 69113
Ankrdl7 Анкириновый повтор домен 17 81702
Ankrd39 Анкириновый повтор домен 39 109346
Anln аниллин, актин-связывающий белок (scraps-гомолог, Дрозофила) 68743
Anxa4 аннексии А4 11746
Anxa5 аннексии А5 11747
Apod аполипопротеин D 11815
Arid4a АТ-обогащенный взаимодействующий домен 4А (Rbp 1 - подобный) 238247
Arl2 подобный фактору ADP-рибозилирования 2 56327
Arpc1b Родственный актину комплекс белка 2/3, субъединица 1В 11867
Aspa аспартоацилаза (аминоацилаза) 2 11484
Atp2b1 АТРаза, Са++ - транспортирующая, плазматическая мембрана 1 67972
B2m бета-2 микроглобулин 12010
BC035295 последовательность кДНК ВС035295 207785
BC061194 последовательность кДНК ВС061194 381350
Bcor корепрессор, взаимодействующий с Вс16 71458
Bid домен, взаимодействующий с ВНЗ, агонист гибели 12122
Bok Родственный Вс1-2 белок-киллер яичников 51800
C030017B01Rik ген RIKEN кДНК С030017 В01 77524
C130006E23 гипотетический белок С130006Е23 331563
Clqa компонент комплемента 1, q субкомпонент, альфа-полипептид 12259
Clqb компонент комплемента 1, q субкомпонент, бета-полипептид 12260
Clqc компонент комплемента 1, q субкомпонент, С-цепь 12262
C330006P03Rik ген RIKEN кДНК С330006Р03 320588
Calb2 кальбиндин 2 12308
Camsaplll Кальмодулин-регулируемый спектрин-ассоциированный белок 1 - подобный 1 67886
Capnsl кальпаин, малая субъединица 1 12336
Cast Кальпастатин 12380
Ccnd2 циклин D2 12444
Ccs медный шаперон для супероксиддисмутазы 12460
Cdl4 CD 14 антиген 12475
Cd52 CD52 антиген 23833
Cd59a CD59a антиген 12509
Cd68 CD68 антиген 12514
Cd74 CD74 антиген (инвариантный полипептид основного комплекса гистосовместимости, класс II антиген-ассоциированный) 16149
Cd81 CD 81 антиген 12520
Cd9 CD9 антиген 12527
Cdhll кадгерин 11 12552
Cdh8 кадгерин 8 12564
Cdkl2 циклин-зависимая киназоподобный 2 (CDC2-родственная киназа) 53886
Cebpd ССААТ/энхансер-связывающий белок (С/ЕВР), дельта 12609
Cendl выход из клеточного цикла и нейрональная дифференциация 1 57754
Chkb холинкиназа бета 12651
Cited 1 Cbp/рЗОО-взаимодействующий трансактиватор с Glu/Asp-обогащенным карбоксиконцевым доменом 1 12705
Clec7a домен лектина С-типа, семейства 7, член а 56644
Cmtm3 CKLF-подобный MARVEL трансмембранный домен содержащий 3 68119
Cmtm5 CKLF-подобный MARVEL трансмембранный домен содержащий 5 67272
Cnksr2 коннектор энхансер супрессора киназы Ras 2 245684
Cnn3 кальпонин 3, кислый 71994
Cntn6 контактен 6 53870
Commd9 содержащий домен СОММ 9 76501
Comtdl содержащий домен катехол-О-метилтрансферазы 1 69156
Cope белковый комплекс коатомер, эпсилон-субъединица 59042
Corolb коронин, актин-связывающий белок 1В 23789
Criml Обогащенный цистеином трансмембранный BMP регулятор 1 (хордин-подобный) 50766
Cst7 цистатин F (лейкоцистатин) 13011
Ctsd катепсин D 13033
Ctss катепсин S 13040
Ctsz катепсин Z 64138
Cyb5rl цитохром b5 редуктаза 1 72017
Cyba цитохром b-245, альфа-полипептид 13057
Cyp20al цитохром Р450, семейства 20, подсемейства А, полипептид 1 77951
Cyp27al цитохром Р450, семейства 27, подсемейства а, полипептид 1 104086
D12Ertd647e ДНК сегмент, Chr 12, ERATO Doi 647, экспрессируемый 52668
D19Wsul2e ДНК сегмент, Chr 19, Wayne State University 12, экспрессируемая 226090
DlErtd471e ДНК сегмент, Chr 1, ERATO Doi 471, экспрессируемый 27877
Ddc допа-декарбоксилаза 13195
Ddt D-допахром таутомераза 13202
Dhrsl дегидрогеназа/редуктаза (SDR семейства) член 1 52585
Diap2 гомолог диафана 2 (Дрозофила) 54004
Dnalcl динеин, аксонема, легкая цепь 1 105000
Dusp6 двойной специфичности фосфатаза 6 67603
E330009J07Pvik ген RIKEN кДНК E330009J07 243780
Efhal домен EF-хенд, семейства А1 68514
EG434128 предсказываемый ген, EG434128 434128
Egrl ответ на начальной стадии роста 1 13653
Egr3 ответ на начальной стадии роста 3 13655
Epha4 Eph-рецептор А4 13838
Ephx1 эпоксид-гидролаза 1, микросомальная 13849
Егоl1b EROl-подобный бета (S. cerevisiae) 67475
Eya4 гомолог безглазый 4 (Дрозофила) 14051
Fahd2a домен, содержащий фумарилацетоацетат-гидролазу 2А 68126
Fbxo39 F-бокс белок 39 327959
Fcerlg Fc рецептор, IgE, высокоаффинный I, гамма-полипептид 14127
Fcgr3 Fc рецептор, IgG, низкоаффинный III 14131
Fnbpl1 формин-связывающий белок 1-подобный 214459
Fndc3b домен, содержащий фибронектин типа III ЗВ 72007
Foxgl forkhead-бокс G1 15228
Fxydl регулятор ионного транспорта, содержащий домен 1FXYD 56188
Gabrb3 рецептор гамма-аминомасляной кислоты (GABA-A), субъединица бета 3 14402
Gal Галанин 14419
Gatm глицин-амидинотрансфераза (b-аргинин:глицин амидинотрансфераза) 67092
Gda гуанин-дезаминаза 14544
Gfap глиофибриллярный кислый белок 14580
Golph2 Гольджи фосфобелок 2 105348
Gprin3 член семейства GPRTN 3 243385
Gpx3 Глутатион-пероксидаза 3 14778
Grhpr глиоксилат-редуктаза/гидросипируват-редуктаза 76238
Gria3 глутаматный рецептор, ионотрофный, AMP A3 (альфа 3) 53623
Gstm1 глутатион S-трансфераза, mu 1 14862
Gstm6 глутатион S-трансфераза, mu 6 14867
Gstm7 глутатион S-трансфераза, mu 7 68312
Gsto1 глутатион S-трансфераза, омега 1 14873
Gstt3 глутатион S-трансфераза, тета 3 103140
Gtf2fl общий транскрипционный фактор IIF, полипептид 1 98053
H2-D1 гистосовместимости 2, D область локус 1 14964
H2-M3 гистосовместимости 2, М область локус 3 14991
Hapln2 гиалуронан и протеогликан-связанный белок 2 73940
Hebp2 гем-связывающий белок 2 56016
Hectd2 НЕСТ-содержащий домен 2 226098
Helz хеликаза с доменом цинковых пальцев 78455
Homer 1 homer-гомолог 1 (Дрозофила) 26556
Hsdl7bll гидросистероид-(17-бета)-дегидрогеназа 11 114664
Hsd3b7 гидроси-дельта-5-стероид-дегидрогеназа, 3 бета- и стероид-дельта-изомераза 7 101502
Idh2 Изоцитратдегидрогеназа 2 (NADP+), митохондриальная 269951
Ier3 немедленно-ранний ответ 3 15937
Ifit3 интерферон-индуцируемый белок с тетратрикопептид повторами 3 15959
Ifitm3 интерферон-индуцируемый трансмембранный белок 3 66141
Ikbkg ингибитор каппаВ киназы гамма 16151
I133 интерлейкин 33 77125
Imp4 IMP4, U3 малый ядерный рибонуклеобелок, гомолог (дрожжи) 27993
Itih3 интер-альфа ингибитор трипсина, тяжелая цепь 3 16426
Jmjdlc jumonji-coдержащий домен 1С 108829
Kcnfl калиевый потенциал-зависимый канал, подсемейства F, член 1 382571
Kcnj16 калиевый канал внутреннего очищения, подсемейства J, член 16 16517
Kcnvl калиевый канал, подсемейства V, член 1 67498
Klf10 Kruppel-подобный фактор 10 21847
Klf9 Kruppel-подобный фактор 9 16601
Klk6 калликреин -родственнная пептидаза 6 19144
Lcat лецитин-холестерол-ацилтрансфераза 16816
Lcpl лимфоцитарный цитозольный белок 1 18826
Lefty1 определения левый/правый фактор 1 13590
Lgals3 лектин, галактоза-связывающий, растворимые 3 16854
Lgals8 лектин, галактоза-связывающий, растворимые 8 56048
Lhfp HMGIC партнер слияния липомы 108927
LOC629605 гипотетический белок LOC629605 629605
LOC672274 сходный с транскрипционным фактором SOX-4 672274
Lohllcr2a потеря гетерозиготности, 11, хромосомный участок 2, ген А гомолог (человек) 67776
Lyzs Лизоцим 17105
M6prbpl белок, связывающий рецептор манноза-6-фосфата 1 66905
Malatl ассоциированный с метастазами аденокарциномы легкого транскрипт 1 (некодирующая РНК) 72289
Marcks миристоилированный обогащенный аланином субстрат протеинкиназы С 17118
Mccc2 метилкротоноил-коэнзим А карбоксилаза 2 (бета) 78038
Mdk мидкин 17242
Mfhas1 Злокачественной фиброзной гистиоцитоксантомы амплифицированная последовательность 1 52065
Mrpl10 митохондриальный рибосомальный белок L10 107732
Mysml myb-подобный, SWIRM и MPN домены 1 320713
Nfyb ядерный транскрипционный фактор-Y бета 18045
Nol4 ядерный белок 4 319211
Ntsr2 Нейротензина рецептор 2 18217
Optn Оптинейрин 71648
Рапк3 пантотенаткиназа 3 211347
Pcdhl7 протокадгерин 17 219228
Pcdh8 протокадгерин 8 18530
Pcdhb2 протокадгерин бета 2 93873
Pcdhb21 протокадгерин бета 21 93892
Pcdhb9 протокадгерин бета 9 93880
Pcolce2 проколлаген С-эндопептидаза энхансер 2 76477
Peci пероксисомальная дельтаЗ, дельта2-енол-коэнзим А изомераза 23986
Phldal подобный гомологичному плекстрину домен, семейства А, член 1 21664
Plek Плекстрин 56193
Plekhfl содержащий гомологичный плекстрину домен, семейство F (с FYVE-доменом) член 1 72287
Plxna2 плекстрин A2 18845
Pmp22 периферический белок миелина 18858
Ppap2c Фосфатидной кислоты фосфатаза, тип 2с 50784
Ppmld белок фосфатаза 1D магний-зависимая, дельта изоформа 53892
Ppp5c белок фосфатаза 5, каталитическая субъединица 19060
Prdm5 PR-содержащий домен 5 70779
Psmb8 протеосома (просома, макропаин) субъединица, бета, тип 8 (большая мультифункциональная пептидаза 7) 16913
Psmb9 субъединица протеосомы (просома, макропаин), бета, тип 9 (большая мультифункциональная пептидаза 2) 16912
Ptpnl2 белок тирозин-фосфатаза, нерецепторная, тип 12 19248
Pvrl3 родственный рецептору полиовируса 3 58998
Rabllfip2 белок, взаимодействующий с семейством RAB11 2 (класс I) 74998
Rabl3 RAB, подобный членам семейства RAS-онкогенов 3 67657
Rcbtb2 регулятор конденсации хромосом (RCC1) и ВТВ (РОZ)-содержащий домен белок 2 105670
Sbno1 sno, strawberry notch-гомолог 1 (Дрозофила) 243272
Shox2 низкорослости гомеобокс 2 20429
Slcl4a1 семейства переносчиков растворенных веществ 14 (переносчик мочевины), член 1 108052
Slcl5a4 семейства переносчиков растворенных веществ 15, член 4 100561
Slit2 гомолог slit 2 (Дрозофила) 20563
Slit3 гомолог slit 3 (Дрозофила) 20564
Sord Сорбитолдегидрогеназа 20322
Sos2 гомолог Son of sevenless 2 (Дрозофила) 20663
Sparc секретируемый кислый богатый цистеином гликобелок 20692
Spp1 секретируемый фосфобелок 1 20750
Spred2 sprouty-родственный, EVH1 содержащий домен 2 114716
Ssbp3 Одноцепочечную ДНК-связывающий белок 3 72475
Sstr4 соматостатина рецептор 4 20608
Stl8 супрессор онкогенности 18 240690
Suhw4 супрессора мохнатого крыла гомолог 4 (Дрозофила) 235469
Tcea2 фактор элонгации транскрипции A (SII), 2 21400
Th тирозин-гидроксилаза 21823
Tmbiml содержащие трансмембранный мотив ингибитора ВАХ 1 69660
Tmeml44 трансмембранный белок 144 70652
Tmeml76a трансмембранный белок 176А 66058
Tmeml76b трансмембранный белок 176В 65963
Tnntl тропонин Т1, скелетный, медленный 21955
Tnnt2 тропонин Т2, сердечный 21956
Trf Трансферрин 22041
Tspan4 тетраспанин 4 64540
Tspo белок-транслокатор 12257
Ube2j1 убиквитин-конъюгированный энзим Е2, Л 56228
Ubtd2 убиквитин-содержащий домен 2 327900
Vim Виментин 22352
Wwox WW-домен-содержащая оксидоредуктаза 80707
Zfp292 цинковых пальцов белок 292 30046
Zmat5 цинковые пальцы, матрин тип 5 67178
Zswim6 цинковых пальцев, SWIM-содержащий домен 6 67263
Zwilch Zwilch, ассоциированный с кинетохором, гомолог (Дрозофила) 68014

Восемнадцать потенциальных маркеров старения мозга отбирают для подтверждения данных чипа методом qPCR. Гены отбирают на основании множества факторов, включая но, не ограничиваясь: избыточную экспрессию в эксперименте с микрочипом, надежные изменения в экспрессии в линии В6, предварительную информацию о генах, ассоциированных со старением мозга. С помощью РНК-образцов из мышей В6, примененных в исследовании с чипом, qPCR-анализ выявил, что 13/18 генов показали изменение в экспрессии с возрастом. Эти 13 генов приведены в таблице 9. Было дополнительно установлено, что восемь из 13-ти генов изменяются с возрастом, и CR предупреждает, по меньшей мере, примерно 33% возрастных изменений; эти восемь генов представляют собой: Apod, B2m, Clqa, Clqb, Ctsd, Gfap, I133, Lyzs и Sppl.

Таблица 9
Символ гена Название гена Номер в базе данных «Entrez gene»
Apod Аполипопротеин D 11815
B2m бета-2 микроглобулин 12010
Clqa компонент комплемента 1, q субкомпонент, альфа-полипептид 12259
Clqb компонент комплемента 1, q субкомпонент, бета-полипептид 12260
Cd68 CD68 антиген 12514
Clec7a домен лектина С-типа, семейства 7, член а 56644
Cst7 Цистатин F (лейкоцистатин) 13011
Ctsd катепсин D 13033
Gfap глиофибриллярный кислый белок 14580
1133 интерлейкин 33 77125
Lgals3 лектин, галактоза-связывающий, растворимые 3 16854
Lyzs Лизоцим 17105
Sppl секретируемый фосфобелок 1 20750

Маркеры старения мозга, идентифицированные выше, применяют для оценки эффективности CR в противодействии возрастным изменениям при старении мозга. Степень, в которой CR может противостоять возрастным изменениям в экспрессии («процент предотвращения»), определяют с помощью показателей, описанных в предыдущих примерах.

Многие из тех генов, о которых ранее сообщалось, что они представляют собой биомаркеры старения, были идентифицированы в исследованиях на чипе и подтверждены методом qPCR, включая Cd68, Ctsd и Gfap. CR противодействует изменениям в экспрессии для Ctsd, но только умеренно эффективно для Cd68 и Gfap.

Для некоторых генов было показано, что они обладают нейропротективным действием, если экспрессия резко усиливается, но действуют губительно, если оверэкспрессируются длительное время (например, при старении). Некоторые из этих генов включают Apod, Clqa и Clqb. Умеренная CR-диета противостоит изменениям в Apod. CR противостоит увеличению в экспрессии Clqb, наблюдаемому с возрастом и у всех мышей, получавших добавки.

Наблюдали заметное увеличение в экспрессии генов, вовлеченных в иммунный ответ и в воспалительные ответы (например, B2m, Сlec71, Cst7, I133, Lgals3). Это находится в строгом соответствии с предыдущими сообщениями об увеличении нейровоспаления с возрастом. Сообщали о том, CR противостоит возрастным изменениям в экспрессии нейровоспалительных генов, хотя, похоже, CR противостоит только возрастному увеличению в экспрессии В2 т.В целом, изменения в экспрессии воспалительных супермаркеров было большим (в особенности, Clec7а и Cst7) и устойчивым к воздействию режима питания в этом исследовании. Однако было показано, что значительное ограничение в калорийности потребляемой пищи (~40%) противодействует возрастным изменениям в генах, ответственных за нейровоспаление, таким образом, альтернативные воздействия обладают потенциалом для противодействия возрастным изменениям в этих супермаркерах.

Наконец, много маркеров ассоциировано с нейродегенеративными нарушениями, такими как болезнь Альцгеймера (например, Apod, Clqa, Clqb, Ctsd, Lyzs, Sppl). Предполагают, что ограничение в калориях противодействует прогрессии болезни Альцгеймера у людей и в моделях заболевания на мышах. Соответственно, умеренное CR, примененное в этом исследовании противодействует возрастным изменениям во многих их этих генов.

Основная информация о сообщаемых или предполагаемых функциях генов, представляющих собой маркеры, приведена ниже.

Apod: Сообщали, об увеличение экспрессии аполипопротеина D при различных неврологических нарушениях, включая болезнь Альцгеймера, шизофрению и инсульт, и при старении мозга. Apod может представлять собой белок, отвечающий на стресс, поскольку сообщалось, что оверэкспрессия этого гена в дрозофиле приводит к нейропротекции и удлинению продолжительность жизни. Таким образом, уровень Apod коррелирует с уровнем эндогенного стресса.

В2М: бета-2-микроглобулин (часть класса I молекул комплекса основной гистосовместимости) также представляет собой известный маркер воспаления, и ранее было показано его увеличение с возрастом в спинномозговой жидкости пожилых людей и в мозге людей с болезнью Паркинсона.

Clqa и Clqb: По имеющимся данным эти гены задействованы во врожденном иммунитете и представляют собой маркеры воспаления, которые, как мы показали ранее, активируются с возрастом в мозге мыши, и было также показано, что они активируются при нейродегенеративных заболеваниях человека, таких как болезнь Альцгеймера.

Cd68: также известен как макросиалин, Cd68 представляет собой макрофаг-специфический белок, экспрессия которого, по имеющимся данным, увеличивается при старении в отдельных областях мозга самцов мышей C57BL/6NNia, и считается, что он экспрессируется в микроглии.

С1ес7а: также известен как Dectin-1, по имеющимся данным, этот рецептор может индуцировать множество клеточных ответов в макрофагах, включая фагоцитоз, окислительный взрыв и продукцию цитокинов. Этот ген кодирует члена суперсемейства С-тип лектин/С-тип лектин-подобный домен (CTL/CTLD). Кодируемый гликобелок представляет собой небольшой, типа II, мембранный рецептор со складкой внеклеточного лектин-подобного домена С-типа и с цитоплазматическим доменом с тирозиновым мотивом активации иммунорецептора. По имеющимся данным он функционирует как распознающий структуру рецептор, который распознает множество бета-1,3-связанных и бета-1,6-связанных глюканов из грибов и растений, и, таким образом, играет некоторую роль во врожденном иммунном ответе. Охарактеризованы альтернативные транскрипционные сплайсированные варианты, кодирующие разные изоформы. Этот ген тесно связан с другими членами суперсемейства CTL/CTLD на хромосоме 12р13 в природном участке комплекса ген-киллер.

Cst7: Цистатин F представляет собой гликозилированный низкомолекулярный ингибитор цистеиновой протеиназы человека. Цистатины представляют собой важные природные ингибиторы цистеиновых протеаз, нацеленные на первоначально папаин-подобные цистеиновые протеазы, включая катепсины и протеазы паразитов, такие как круципаин, а также аспарагиниловые эндопептидазы млекопитающих. Цистатин F млекопитающих, который экспрессируется практически исключительно в гемопоэтических клетках и аккумулируется в лизосомо-подобных органеллах, вовлечен в регуляцию презентации антигена и другие иммунные процессы. Он представляет собой необычный цистатин, член суперсемейства с описанным редокс-регулируемым механизмом активация и ограниченным профилем специфичности.

Ctsd: Катепсин D представляет собой основную липосомальную протеазу, и недавно сообщалось о мутациях в Ctsd, которые делают ее энзиматически дефектной, в подгруппах нейронного восковидного липофусциноза/болезни Баттена. Фенотип этого заболевания не требует Вах-опосредуемого апоптоза, а напротив, вероятно, опосредуется через аутофагию. Катепсин D-опосредуемый протеолиз аполипопротеина Е может участвовать в болезни Альцгеймера. Сообщалось также об активации липосомальной системы в экспериментальных моделях нейронального повреждения.

Gfap: Глиофибриллярный кислый белок представляет собой классический маркер активация астроцитов и, возможно, наиболее хорошо изученный маркер старения мозга. Этот ген кодирует один из основных белов промежуточных филаментов зрелых астроцитов. Его применяют в качестве маркера для того, чтобы при исследовании отличить астроциты от других глиальных клеток. Мутации в этом гене вызывают болезнь Александера, редкое нарушение астроцитов в центральной нервной системе.

I133: Плохо охарактеризованный цитокин, сообщалось, что IL-33 представляет собой белок с двойной функцией, который может функционировать и как провоспалительный цитокин, и как внутриклеточный ядерный фактор со свойствами регулятора транскрипции.

Lgals3: Галектин-3 представляет собой мульти-функциональный белок и, по имеющимся данным, участвует в опосредовании воспалительных реакций. По сообщениям, галектин-3 активируется в микроглиальных клетках. Интересно, что галектин-3, по имеющимся сведениям активирует адгезию нейрональных клеток и рост нейритов.

Lyzs: Также, известен как лизоцим, он представляет собой плохо охарактеризованный и, предположительно, липосомальный белок, который широко распространен в лейкоцитах и вовлечен в воспалительные реакции.

Spp1: Секретируемый фосфобелок-1, также известный как остеопонтин, представляет собой секретируемый аргинин-глицин-аспартат (RGD)-содержащий фосфобелок. Похоже, что Spp1 оверэкспрессируется при болезни Паркинсона. Остеопонтин (OPN) вовлечен в воспалительные процессы и в процессы заживления ран, включая аутоиммунный увеит.

Пример 5

Этот пример описывает идентификацию транскрипционных маркеров старения в мышечной ткани. Для создания панели генов, которые, вероятно, представляют собой надежные маркеры старения в скелетных мышцах мыши, проводят анализ транскрипционного профиля с помощью чипа «Mouse Genome 430 2.0» компании «Affymetrix» в икроножных мышцах мышей из семи линий: 129/J, C57BL/6, CBA/J, DBA2J, С3Н/HeJ, Balb/c и B6C3HF1. Анализ профиля проводят на семи молодых (пять месяцев жизни) и семи старых (28-30 месяцев) мышах из каждой линии. Двусторонние t-критерии выполняют для тестирования на статистическую значимость изменения в экспрессии гена с возрастом. Из -21000 транскриптов, представленных на панели, 172 транскриптов значительно (Р<0,05) изменились с возрастом, по меньшей мере, в шести из семи линий (таблица 10).

Таблица 10
Символ гена Название гена Номер в базе данных «Entrez gene»
Acsl6 ацил-СоА-синтетаза, динные цепи, член семейства 6 216739
Actrla APvPl актин-родственный белок 1 гомолог А (дрожжи) 54130
Adcy2 аденилатциклаза 2 210044
Agtrl1 ангиотензина рецептор-подобный 1 23796
Akrlb8 альдо-кето-редуктаза семейства 1, член В8 14187
Aldhla1 альдегид дегидрогеназа семейства 1, подсемейства А1 11668
Amyl амилаза 1, слюна 11722
Ankrd32 анкириновый повтор домен 32 105377
Antxr2 рецептор сибиреязвенного токсина 2 71914
Apod аполипопротеин D 11815
Arrdc4 аррестин-содержащий домен 4 66412
Atpl3a5 АТРаза, тип 13А5 268878
AU018740 экспрессируемая последовательность AU018740 98528
B3gntl UDP-GlcNAc:6eTaGal бета-1,3-N-ацилглюкозаминилтрансфераза 1 53625
C4 компонент комплемента 4 (в рамках H-2S) 12268
Cd209b антиген CD209b 69165
Cdkl2 циклин-зависимой киназе-подобный 2 (CDC2-родственная киназа) 53886
Cdkn2c ингибитор циклин-зависимой киназы 2С (р18, ингибирует CDK4) 12580
Cdsl CDP-диацилглицерол-синтаза 1 74596
Ces2 /// LOC546098 карбоксилэстераза 2 /// сходный с карбоксилэстеразой 2 234671 /// 546098
Chad Хондроадгерин 12643
Chodl Хондролектин 246048
Chrnal холинергический рецептор, никотиновый, альфа-полипептид 1 (мышцы) 11435
Chrnbl холинергический рецептор, никотиновый, бета-полипептид 1 (мышцы) 11443
Cilp2 белок промежуточного слоя хряща 2 68709
Clybl цитратлиаза бета-подобная 69634
Col11a1 проколлаген, тип XI, альфа 1 12814
Col1a1 проколлаген, тип I, альфа 1 12842
Col1a2 проколлаген, тип I, альфа 2 12843
Col3a1 проколлаген, тип III, альфа 1 12825
Col4al проколлаген, тип IV, альфа 1 12826
Col5a2 проколлаген, тип V, альфа 2 12832
Col6a1 проколлаген, тип VI, альфа 1 12833
Cpne2 копии II 234577
Csprs компонент Sp100-rs 114564
Ctnnbll катенин, бета-подобный 1 66642
Cuzdl CUB и вителлинового слоя-подобный домен 1 16433
Cytl цитокин-подобный 1 231162
Ddx6 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp)-бокс полипептид 6 13209
Dhx36 DEAH (Asp-Glu-Ala-His)-бокс полипептид 36 72162
Dmn Десмулин 233335
Dmxl2 Dmx-подобный 2 235380
Dnajbl4 гомолог DnaJ (Hsp40), подсемейства В, член 14 70604
Dusp26 двойной специфичности фосфатаза 26 (предполагаемая) 66959
E030025D05Rik ген RIKEN кДНК E030025D05 216613
Edg2 эндотелиальной дифференциации, лизофосфатидиловой кислоты G-белок-сопряженный рецептор, 2 14745
Efhal домен EF-хенд семейства А1 68514
Egfl6 EGF-подобный-домен, множественный 6 54156
Eif2c2 эукариотический фактор инициации трансляции 2С, 2 239528
Emb эмбигин 13723
Fbxl4 F-бокс и обогащенный лициновыми повторами белок 4 269514
Fmo2 флавин-содержащая монооксигеназа 2 55990
Fmod Фибромодулин 14264
Fscnl гомолог фасцина 1, белок пучкования актина (Strongylocentrotus purpuratus) 14086
Fut8 фукозилтрансфераза 8 53618
Gadd45a блокировки роста и индуцируемый поврежениями ДНК 45 альфа 13197
Gca гранкальцин 227960
GdaplO белок, ассоциированный с индуцируемой дифференциацией ганглиозида 10 14546
Gnal4 гуаниннуклеотид-связывающий белок, альфа 14 14675
Gtl2 /// Lphnl GTL2, импринтинговый по материнской линии 17263///33081
экспрессируемая, нетранслируемая мРНК /// латрофилин 1 4
Histlh3i гистон 1, H3i (Histlh3i), мРНК 319153
Hnl гематологическая и неврологическая экспрессируемая последовательность 1 15374
Homer2 homer-гомолог 2 (Дрозофила) 26557
Hook1 hook-гомолог 1 (Дрозофила) 77963
Ноок3 hook-гомолог 3 (Дрозофила) 320191
Hsdl7b7 гидросистероид-(17-бета)-дегидрогеназа 7 15490
Icam1 молекула внутриклеточной адгезии 15894
Igh-6 тяжелая цепь иммуноглобулина 6 (тяжелая цепь IgM) 16019
Itih5 интер-альфа (глобулин) ингибитор Н5 209378
Jaridlb jumonji, АТ-обогащенный взаимодействующий домен IB (Rbp2-подобный) 75605
Jmjd3 Jumonji-содержащий домен 3, мРНК (кДНК-клон IMAGE:4037702) 216850
Kcnabl калиевый потенциал-зависимый канал, родственный подсемейству shaker, бета член 1 16497
Kera Кератосан 16545
Krtl-18 комплекс кератина 1, кислый, ген 18 16668
Lgals3 лектин, галактоза-связывающий, растворимый 3 16854
LOC241944 белок сходный с ZNF43 241944
LOC545323 сходный с нейробичин-подобным 1 545323
Lpgatl лизофосфатидилглицерол-ацилтрансфераза 1 226856
Lip 11 рецептору липопротеина низкой плотности-родственный белок 11 237253
Mfap4 ассоциированный с микрофибриллами белок 4 76293
Mgstl микросомальная глутатион-Б-трансфераза 1 56615
Mia3 ингибирующий активность меланомы 3 338366
M113 миелоидной/лимфоидной ткани или недифференцированный лейкоз 3 231051
M115 миелоидной/лимфоидной ткани или недифференцированный лейкоз 5 69188
Mt2 металлотионеин 2 17750
Mtap7 ассоциированный с микротрубочками белок 7 17761
Myo5a миозин Va 17918
Nipal гомолог, не импринтинговый в синдроме Прадера-Вилли/Ангельмана 1 (человек) 233280
Nxn Нуклеоредоксин 18230
Opcml опиоид-связывающий белок/молекуле клеточной адгезии-подобный 330908
Pbl предполагаемый: ген Mus musculus RIKEN кДНК 2310032М22 (Pbl) 76748
Pcgf4 polycomb группы RING пальца 4 12151
Pdcd6ip программируемой клеточной гибели 6, взаимодействующий белок 18571
Pkp2 плакофилин 2 67451
Plekhbl домен, содержащий гомолог плекстрина, семейства В (эвектины) член 1 27276
Plk2 polo-подобная киназа 2 (Дрозофила) 20620
Plp2 протеолипид белок 2 18824
Prkcz протеинкиназа С, зета 18762
Рига /// 633041 lE07Rik белок А, связывающий обогащенный пуринами элемент /// ген RIKEN кДНК 6330411Е07 19290 /// 70733
Purb белок В, связывающий обогащенный пуринами элемент (Purb), мРНК 19291
Pvrl3 рецептору поливируса-родственный 3 58998
Rgs5 регулятор сигнального пути G-белка 5 19737
Rhpn2 рофилин, Rho ОТРаза-связывающий белок 2 52428
Rnf125 RING пальца белок 125 67664
Sbnol sno, гомолог strawberry notch 1 (Дрозофила) 243272
Serpina3n ингибитор сериновой (или цистеиновой) пептидазы, ветвь А, член 3N 20716
Serpinfl ингибитор сериновой (или цистеиновой) пептидазы, ветвь F, член 1 20317
Sh3bp5 белок, связывающий SH3домен 5 (ВТК-ассоциированный) 24056
Slc4al0 переносчиков растворенных веществ семейства 4, бикарбоната натрия сопереносчик-подобный, член 10 94229
Smc411 SMC4 поддержание структуры хромосомы 4-подобный 1 (дрожжи) 70099
Spint2 ингибитор сериновой протеазы Кунитца, тип 2 20733
Supt3h гомолог супрессора Ту 3 (S. cerevisiae) 109115
Syt9 синаптотагмин IX 60510
Taf91 ТАР9-подобная РНК полимераза II, фактор ассоциированный с TATA box-связывающим белком (ТВР) 407786
Tekt1 тектин 1 21689
Tnmd теномодулин 64103
Trim41 трехчленный мотив-со держащий 41 211007
Ttcl4 домен тетратрикопептидный повторов 14 67120
Ttc9c домен тетратрикопептидный повторов 9С 70387
Ubnl убинуклеин 1 170644
Vsig4 V-set и иммуноглобулин содержащий домен 4 278180
Vtn витронектин 22370
Wifl Wnt-ингибирующий фактор 1 24117
Zdhhc21 цинковые пальцы, DHHC-содержащий домен 21 68268

Из 172 транскриптов, которые были идентифицированы в анализе с микрочипом, методом qPCR анализируют 21 ген для определения изменений в экспрессии с возрастом и под действием CR. Гены выбирают с помощью нескольких критериев - гены отбирают на основании известной биологической функции, если они имели относительно избыточную экспрессию в анализе на чипе и/или если исследования, опубликованные в престижных журналах, предполагают его участие в старении мышц. RT-PCR анализ проводят, применяя прибор «Applied Biosystems 7000» с помощью имеющихся в продаже PCR-праймеров, разработанных компанией «Applied Biosystems». TATA box-связывающий белок (Tbp) применяют в качестве внутреннего контроля для всех RT-PCR анализов, поскольку ранее было показано, что этот ген не изменяется с возрастом или под действием CR. Из 21-го протестированного гена, 13 генов показали изменение в экспрессии с возрастом, по меньшей мере, в шести из семи линий (таблица 11). Из 13-ти генов, одиннадцать продемонстрировали обращение под действием CR. Эти одиннадцать генов представляют собой: С4, Cdkn2c, Cds1, Col1a1, Col1a2, Col3a1, Edg2, Igh-6, Mt2, Р1k2 и Syt9.

Таблица 11
Символ гена Название гена Номер в базе данных «Entrez gene»
С4 компонент комплемента 4 (внутри H-2S) 12268
Cdkn2c ингибитор циклин-зависимой киназы 2С (р18, ингибирует CDK4) 12580
Cdsl CDP-диацилглицерол-синтаза 1 74596
Col1a1 проколлаген, тип I, альфа 1 12842
Col1a2 проколлаген, тип I, альфа 2 12843
Col3a1 проколлаген, тип III, альфа 1 12825
Dusp26 двойной специфичности фосфатаза 26 (предполагаемая) 66959
Edg2 эндотелиальной дифференциации, лизофосфатидиловой кислоты G-белок-сопряженный рецептор,2 14745
Igh-6 тяжелая цепь иммуноглобулина 6 (тяжелая цепь IgM) 16019
Mt2 металлотионеин 2 17750
Plk2 polo-подобная киназа 2 (Дрозофила) 20620
Rhpn2 рофилин, Rho ОТРаза-связывающий белок 2 52428
Syt9 синаптотагмин IX 60510

Из генов, приведенных в таблице 11, два могут быть широко классифицированы, как вовлеченные в воспалительный ответ (С4 и Igh6), два быть широко классифицированы по поврежденной ДНК / контрольной точке клеточного цикла (Cdkn2c и Р1к2), два могут быть классифицированы по ответу на стресс (Mt2 и Dusp26), один (Cdsl) может быть широко классифицирован, как вовлеченный в биосинтез, один может быть классифицирован, как вовлеченный в кальциевый метаболизм (Syt9), и пять генов (Col1a1, Col1a2, Col3a1, Edg2, Rhpn2) могут быть классифицированы, как вовлеченные в ремоделирование цитоскелета.

После того как подходящая панель биомаркеров была подтверждена посредством qPCR (в отношении изменений с возрастом и, в большинстве случаев, обращения изменение под действием CR), экспрессию этих гены анализируют в образцах mRNA из исследования по питательным веществам по примеру 1. Ниже обсуждаются результаты, имеющие отношение к специфическим маркерам, наряду с описанием известной по данным литературы функциональной значимости этих маркеров.

Комплемент С4: Четвертый компонент каскада комплемента представляет собой существенный фактор во врожденном иммунитете. Его активацию наблюдают при нормальном старении мозга у людей, а также в мозге людей с болезнью Альцгеймера. Разные аллели С4 у людей связаны со здоровьем и продолжительностью жизни, можно предположить, что статус С4 прямо воздействует на здоровье. Комплемент С4 также связан с аутоиммунными заболеваниями.

Igh-6: Igh6 представляет собой антиген В-клеток, необходимый для созревания В-клеток. Дефицитных по Igh6 мышей обычно применяю в качестве модели дефицита В-клеток. Таким образом, увеличение Igh-6 в скелетных мышцах с возрастом может быть вторичным по отношению к увеличению в инфильтрации В-клеток в этой ткани, которая в этих исследованиях полностью предупреждается CR.

Cdkn2C (р18): CdKn2C, также известный как pl8INK4c, представляет собой ингибитор циклинкиназы (CKI) Gl-фазы. Он представляет собой один из нескольких CKI, вовлеченных в арест клеточного цикла в ответ на повреждение ДНК. Ингибиторы CKI представляют собой гены-супрессоры опухоли, поскольку мутации как в р18, так и в родственном р16, приводят к образованию опухолей. В частности р16 связан с клеточным старением компартмента популяции взрослых стволовых клеток. Вероятно, наблюдамая возрастная активация р18 отражает накопление повреждений ДНК.

Plk2: Polo-киназа 2 представляет собой polo-подобную киназу, экспрессируемую в G1 в культивируемых клетках и некоторых тканях животных, которая функционирует в ответ на повреждение ДНК. Polo, «основатель» этого семейства генов, был идентифицирован в дрозофиле и участвует в контролировании клеточного деления.

Mt2: Металлотионеины (I, II и III) представляют собой низкомолекулярные, обогащенные цистеином металлсвязывающие белки, обнаруженные у широкого круга организмов, о которых известно, что они индуцируются в самых разнообразных стрессовых состояниях. Поскольку эти белки контролируют перенос внутриклеточного цинка, считается, что контроль уровня цинка с помощью металлотионеинов представляет собой важный аспект в защите клетки от стресса.

Dusp26: DUSP (тирозин-фосфатазы с двойной специфичностью) похожи на тирозинфосфатазы, поскольку обладают характерным для тирозинфосфатаз доменом (I/V)HCXAGXGR(S/T), вовлеченным в их каталитическую активность. Были идентифицированы многие члены этого класса, включая DUSP1-9, DUSP16 и DUSP-26, также, известные как МКР 8. Все эти белки дефосфорилируют сериновый/треониновый и тирозиновый остатки на разных членах семейства МАР-киназы, что приводит к их инактивации. DUSP активируются стимулами, которые запускают МАР-киназные пути, такие как тепловой шок, митогены и гипоксия. Недавно было показано, что Dusp26 ассоциирован с транскрипционным фактором теплового шока 4b, что связало этот DUSP с ответом на тепловой шок. Удивительно, но CR не способно предупредить возрастную индукцию Dusp26 Cdsl: CDP-диацилглицерол-синтаза представляет собой скорость-лимитирующий фермент, вовлеченный в биосинтез глицеролипидов, которые служит в качестве предшественников как фосфоинозитидов, так и фосфатидилглицерола. Считается, что CDP-диацилглицерол-синтазы регулируют активность путей биосинтеза фосфолипидов.

Edg2: Экспрессия Edg2 (эндотелиальной дифференциации, лизофосфатидиловой кислоты G-белок-сопряженный рецептор, 2) снижается с возрастом, и это снижение полностью предупреждается CR. Лизофосфатидиловая кислота индуцирует перестройку цитоскелета, и поскольку Edg2 представляет собой рецептор для этой молекулы, эти результаты обобщают общую закономерность, показанную в этом исследовании, что ремоделирование цитоскелета представляет собой обычный признак старения в скелетных мышцах мыши.

Col1a1, Col1a2, Col3a1: Col1a и Соl1а2 кодируют цепи проколлагена типа I. Мутации в этих генах связаны с заболеванием, несовершенный остеогенез у человека. Насколько нам известно, этот результат представляет собой первое обнаружение скоординированной отрицательной регуляции генов коллагена при старении. Три гена про-коллагена (Col1a1, Col1a2, Соl3а1) продемонстрировали изменения с возрастом, которым противодействовало CR.

Rhpn2: Рофилин 2 представляет собой Rho ОТРаза-связывающий белок. Предполагается, что он играет некоторую роль в эндоцитозе и на основании скрининга двугибридных дрожжей было сделано предположение, что компоненты цитоскелета являются партнерами рофилина 2.

Syt9: Кальций входит в пресинаптические окончания, и нейроэндокринные клетки запускают экзоцитоз в синаптических и секреторных пузырьках. Синаптотагмины, включая Syt9, представляет собой кальций-связывающие белки, которые, как считается, представляет собой кальциевые сенсоры для экзоцитоза.

Описание раскрывает типичные предпочтительные воплощения изобретения. Хотя применяют специфические термины, их применяют только в общем и описательном смысле и не для целей ограничения, объем изобретения изложен в формуле изобретения. Ясно, что возможны многие модификации и вариации изобретения в свете вышеприведенных сведений изобретения. Следовательно, понятно, что в рамках объема прилагаемой формулы изобретения изобретение может быть применено на практике иначе, чем конкретно описано.

1. Способ идентификации изменений в экспрессии генов, характерных для старения, в выбранной ткани, где выбранная ткань представляет собой сердечную, мышечную, мозговую или жировую ткань, включающий
отбор одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в ткани старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, применяя первый критерий, что
(i) один или несколько генов дифференциально экспрессируются по меньшей мере в 50% линий, пород или этнических групп тестируемых видов на заранее определенном уровне значимости в p<0.10, и вторым критерием, что
(ii) изменение в экспрессии одного или нескольких генов у старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами по меньшей мере частично обращается путем ограничения в калорийности.

2. Способ по п. 1, в котором выбранный ген дифференциально экспрессируется в трех или более линиях, породах или этнических группах.

3. Способ по п. 1, в котором выбранный ген дифференциально экспрессируется в пяти или более линиях, породах или этнических группах.

4. Способ по п. 1, в котором выбранный ген дифференциально экспрессируется, по меньшей мере, в 75% протестированных линий, пород или этнических групп.

5. Способ по п. 1, дополнительно включающий тот критерий, что известно или предполагается, что ген, дифференциально экспрессируемый у старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, ассоциирован с одной или несколькими связанными со старением физиологическими функциями.

6. Способ по п. 1, в котором вид представляет собой собаку или кошку.

7. Способ детектирования дифференциальной экспрессия одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в выбранной ткани у старых субъектов в сравнении со стандартом или с молодыми субъектами, где выбранная ткань представляет собой сердечную, мышечную, мозговую или жировую ткань, включающий:
(a) обеспечение зондов, содержащих
(i) полинуклеотиды, которые специфически гибридизуются с двумя или более генами, кодирующими белки или их фрагменты, где ткань представляет собой сердечную ткань, а белки включают по меньшей мере один из следующих: Amy1, Apod, Bdh1, C3, Casq1, Ccl8, Kcnd2, Lcn2, Mt2, Myot, Pah, Prkcq, Serpina3n, Skap2, Tmem16k и Vgll2; где ткань представляет собой жировую ткань, а белки включают по меньшей мере один из следующих Aspn, Clec4n, Col6a2, Col18a1, Cox8b, Crip2, Ear11, Emilin2, Otop1, Pla2g2d, Rhbdl3, Slc6a13 и Sycp3; где ткань представляет собой мозговую ткань, а белки включают по меньшей мере один из следующих: Apod, B2m, Cd68, Clec7a, Cst7, Ctsd, Gfap, Il33, Lyzs и Spp1; где ткань представляет собой мышечную ткань, а белки включают по меньшей мере один из следующих: С4, Cdkn2c, Cds1,, Col1a2,, Dusp26, Edg2, Igh-6, Mt2, Plk2, Rhpn2 и Syt9; или
(ii) связывающие полипептиды агенты, которые специфически связываются двумя или более белками, выбранными из белков Adh1, Agtrl1, Akr1b8, Aldh1a1, Alox5ap, Amy1, Angptl2, Ankrd1, Anxa1, Apod, Apoe, Asah3l, Asph, Atp6v0e2, Atp6v1c1, Atp9a, Atxn10, BC023892, Bckdhb, Bdh1, Bre, Bysl, C1r, C3, Cacna2d1, Camk2n1, Casq1, Ccdc72, Ccl6, Ccl8, Ccnd1, Cd163, Cdh22, Cebpd, Cfb, Chek2, Churc1, Cilp, Ckb, Clic5, Col3a1, Col8a1, Cp, Cpxm2, Ctgf, Ctss, Cxcl14, Cyb5r3, Cyp27a1, Dalrd3, Dbnl, Dhrs1, Dhrs7c, Dpep1, EG665317, Ehbp1l1, Ehmt2, Enpp2, Fads1, Fbln2, Fcgr3, Fez2, Fgfr1op2, Fkbp5, Fmo2, Ftl2, Fxyd6, Fzr1, Gcdh, Gda, Gpm6b, Hlx1, Hod, Hp1bp3, Icam1, Ier3, Ifit1, Il4ra, Isoc1, Itm2a, Jph2, Kbtbd2, Kcnd2, Kcne1, Klhdc1, Lcn2, Lect1, Letm1, Lgals3bp, Lrp1, Lrp11, Ly6a, Man2a1, Mef2a, Mfge8, Mgp, Mier3, Mlf1, Mrc1, Mt2, Mybpc3, Myom2, Myot, Ndrg4, Nfkbia, Npr3, Nt5c2, Oas2, Osmr, Pah, Pbxip1, Pde1c, Pdlim4, Pgm5, Phlda1, Pkn2, Pld3, Plp2, Postn, Ppp1r3b, Prg4, Prkar1a, Prkcq, Ranbp5, Rnf5, Rpl3l, Rras, Rtn2, Rtn4, Scn1b, Scn4b, Serpina3n, Serpine2, Skap2, Slc6a6, Snx10, Socs3, Srf, Svep1, Tbc1d10c, Tfpi, Tgfb2, Tgm2, Thbs2, Thbs4, Timp2, Tln1, Tmem16k, Tmem176a, Tmem43, Tnfaip8, Tomm40, Tpte2, Trim47, Tspan13, Tspan17, Uap1l1, Ube2z, Uchl1, Vgll2, Vwf, Wdr13, Wisp2, Wtap, Yipf7, Zadh2, Zfp697, Amotl1, Cdc42ep1, Chkb, AI597468, Flna, Mst1r, Nmb, Nsd1, Nap1l5, Otop1, Osbpl8, Pla2g2d, Polr2d, Pcdhb22, 4921524J17Rik, Rc3h2, Rbms3, Akap2, Aco2, Acsf3, Acadl, Acadvl, Arf2, Arl5b, Ankib1, Anxa2, Aspn, Abcd4, Bmp1, C1galt1c1, Cidea, Coq9, Col5a2, Col6a1, Col6a2, Col18a1, Clec4n, Crip2, Cyb5r1, Cox4i1, Сох6 с, Dnmt3a, Dnaja3, Emilin2, Ear11, Efemp1, Fbxo6, Fndc3b, Fyttd1, Gcnt2, Gpd2, Gnb4, Hddc3, Hfe, Hadha, C130006E23, Hif1a, Itga6, Irf7, Ldhb, Lace1, Lxn, Lenep, Lims1, Macrod1, Msln, Myadm, Gnptg, Ndufa10, Ndufa5, Ntn4, Ntrk3, Nmnat3, Nid1, Ogdh, Ptcd3, Ppic, Pxdn, Kcnj15, EG665378, Prss23, Pim1, Rmnd1, Rp2h, Arhgef10, Rhbdl3, 1810013D10Rik, 2010005J08Rik, 2810482I07Rik, 4933439C20Rik, 9530058B02Rik, D830012I24Rik, Sec23a, Sema4a, Serpina3n, Serpinf1, Serhl, LOC100047339, LOC100046998, LOC100046740, Smcr7, Slc46a3, Slc6a13, Stard3nl, Sdhb, Suclg1, Sucla2, Supv3l1, Syngr1, Sycp3, Tspan2, Tanc1, Timm44, Usp47, Uckl1, Vps13a, Vash1, Vcan, Wwtr1, Zkscan17, Abca8a, Adamtsl4, Agxt2l1, AI465270, AI838057, Ak3l1, Alad, Alkbh3, Ankrd17, Ankrd39, Anln, Anxa4, Anxa5, Apod, Arid4a, Arl2, Arpc1b, Aspa, Atp2b1, B2m, BC035295, BC061194, Bcor, Bid, Bok, C030017B01Rik, C130006E23, C1qa, C1qb, C1qc, C330006P03Rik, Calb2, Camsap1l1, Capns1, Cast, Ccnd2, Ccs, Cd14, Cd52, Cd59a, Cd68, Cd74, Cd81, Cd9, Cdh11, Cdh8, Cdkl2, Cebpd, Cend1, Chkb, Cited1, Clec7a, Cmtm3, Cmtm5, Cnksr2, Cnn3, Cntn6, Commd9, Comtd1, Cope, Coro1b, Crim1, Cst7, Ctsd, Ctss, Ctsz, Cyb5r1, Cyba, Cyp20a1, Cyp27a1, D12Ertd647e, D19Wsu12e, D1Ertd471e, Ddc, Ddt, Dhrs1, Diap2, Dnalc1, Dusp6, E330009J07Rik, Efha1, EG434128, Egr1, Egr3, Epha4, Ephx1, Ero1lb, Eya4, Fahd2a, Fbxo39, Fcer1g, Fcgr3, Fnbp1l, Fndc3b, Foxg1, Fxyd1, Gabrb3, Gal, Gatm, Gda, Gfap, Golph2, Gprin3, Gpx3, Grhpr, Gria3, Gstm1, Gstm6, Gstm7, Gsto1, Gstt3, Gtf2f1, H2-D1, H2-M3, Hapln2, Hebp2, Hectd2, Helz, Homer1, Hsd17b11, Hsd3b7, Idh2, Ier3, Ifit3, Ifitm3, Ikbkg, Il33, Imp4, Itih3, Jmjd1c, Kcnf1, Kcnj16, Kcnv1, Klf10, Klf9, Klk6, Lcat, Lcp1, Lefty1, Lgals3, Lgals8, Lhfp, LOC629605, LOC672274, Loh11cr2a, Lyzs, M6prbp1, Malat1, Marcks, Mccc2, Mdk, Mfhas1, Mrpl10, Mysm1, Nfyb, Nol4, Ntsr2, Optn, Pank3, Pcdh17, Pcdh8, Pcdhb2, Pcdhb21, Pcdhb9, Pcolce2, Peci, Phlda1, Plek, Plekhf1, Plxna2, Pmp22, Ppap2c, Ppm1d, Ppp5c, Prdm5, Psmb8, Psmb9, Ptpn12, Pvrl3, Rab11fip2, Rabl3, Rcbtb2, Sbno1, Shox2, Slc14a1, Slc15a4, Slit2, Slit3, Sord, Sos2, Sparc, Spp1, Spred2, Ssbp3, Sstr4, St18, Suhw4, Tcea2, Th, Tmbim1, Tmem144, Tmem176a, Tmem176b, Tnnt1, Tnnt2, Trf, Tspan4, Tspo, Ube2j1, Ubtd2, Vim, Wwox, Zfp292, Zmat5, Zswim6, Zwilch, Acsl6, Actr1a, Adcy2, Agtrl1, Akr1b8, Aldh1a1, Amy1, Ankrd32, Antxr2, Apod, Arrdc4, Atp13a5, AU018740, B3gnt1, C4, Cd209b, Cdkl2, Cdkn2c, Cds1, Ces2 /// LOC546098, Chad, Chodl, Chrna1, Chrnb1, Cilp2, Clybl, Col11a1, Col1a1, Col1a2, Col3a1, Col4a1, Col5a2, Col6a1, Cpne2, Csprs, Ctnnbl1, Cuzd1, Cyt1, Ddx6, Dhx36, Dmn, Dmxl2, Dnajb14, Dusp26, E030025D05Rik, Edg2, Efha1, Egfl6, Eif2c2, Emb, Fbxl4, Fmo2, Fmod, Fscn1, Fut8, Gadd45a, Gca, Gdap10, Gna14, Gtl2 /// Lphn1, Hist1h3i, Hn1, Homer2, Hook1, Hook3, Hsd17b7, Icam1, Igh-6, Itih5, Jarid1b, Jmjd3, Kcnab1, Kera, Krt1-18, Lgals3, LOC241944, LOC545323, Lpgat1, Lrp11, Mfap4, Mgst1, Mia3, Mll3, Mll5, Mt2, Mtap7, Myo5a, Nipa1, Nxn, Opcml, Pb1, Pcgf4, Pdcd6ip, Pkp2, Plekhb1, Plk2, Plp2, Prkcz, Pura /// 6330411E07Rik, Purb, Pvrl3, Rgs5, Rhpn2, Rnf125, Sbno1, Serpina3n, Serpinf1, Sh3bp5, Slc4a10, Smc4l1, Spint2, Supt3h, Syt9, Taf9l, Tekt1, Tnmd, Trim41, Ttc14, Ttc9c, Ubn1, Vsig4, Vtn, Wif1, Zdhhc21, Ces2, или их фрагментами;
(b) добавление зондов к образцу, содержащему мРНК или белки из старого субъекта, так, чтобы могла осуществиться гибридизация или связывание зондов с мРНК или белками в образце, формируя таким способом комплексы гибридизации или связывания в образце;
(с) необязательно, добавление зондов к другому образцу, включающему мРНК или белки из молодого субъекта, так чтобы могла осуществиться гибридизация или связывание зондов с мРНК или белками во втором образце, формируя тем самым комплексы гибридизации или связывания в другом образце;
(d) детекцию гибридизационных комплексов в образце или образцах; и
(e) сравнение комплексов гибридизации или связывания из первого образца с комплексами гибридизации или связывания из стандарта или, необязательно, из другого образца, в котором, по меньшей мере, одно различие между количеством гибридизации или связывания в образце в сравнении со стандартом или необязательным другим образцом указывает на дифференциальную экспрессию одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых у старых субъектов;
где вид представляет собой собаку или кошку.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в диагностике кардиомиопатий различной природы. Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления мутаций кодирующей части гена десмина (DES), ассоциированных с кардиомиопатиями.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к ингибиторам сигнального пути AXL, и может быть использовано в медицине. Получают растворимый вариант полипептида AXL без трансмембранного домена AXL, который содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении номер n, где n выбран из 32, 72, 87, 92 или 127 или их сочетание, где n+7 соответствует нумерации SEQ ID NO: 1 - последовательности AXL дикого типа, в котором указанная модификация повышает сродство связывания полипептида AXL со специфически задерживающим рост белком 6 (GAS6), которое, по меньшей мере, примерно в 2 раза сильнее, чем сродство полипептида AXL дикого типа.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации Burkholderia pseudomallei и дифференциации от возбудителя сапа методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией.

Изобретение относится к области медицины, молекулярной биологии и биотехнологии. Предложен способ определения полиморфизма гена GP6 человека, кодирующего гликопротеин VI, по полиморфной позиции rs 1613662, основанный на снятии кривых плавления с флуоресцентно-мечеными аллель-специфичными олигонуклеотидными пробами.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к интернализации терапевтических молекул внутрь клетки, и может быть использовано в медицине. Получают композицию для доставки молекул нуклеиновых кислот в клетки, содержащую по меньшей мере один пептид с по меньшей мере 92% идентичностью к GAAEAAARVYDLGLRRLRQRRRLRRERVRA (SEQ ID NO: 2); IREIMEKFGKQPVSLPARRLKLRGRKRRQR (SEQ ID NO: 3); или YLKVVRKHHRVIAGQFFGHHHTDSFRMLYD (SEQ ID NO: 4), присоединенный к одной или нескольким молекулам нуклеиновых кислот.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу анализа пригодности РНК, экстрагированной из ткани или клетки (клеток), фиксированных с помощью фиксатора, для анализа экспрессии генов.

Группа изобретений относится к области лизиса клеток. Предложен способ избирательного лизиса животных клеток, а также прибор для обнаружения микроорганизмов.

Изобретения относятся к области медицинской микробиологии и касаются способа дифференциации токсигенных генетически измененных штаммов V.cholerae биовара Эль Тор и тест-системы.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу выявления мутаций в гене MYO7A, сопровождающихся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты или синдрома Ушера.
Изобретение относится к области биотехнологии и касается специфических олигонуклеотидных праймеров. Представленные праймеры включают сайты эндонуклеазного расщепления, фланкирующие участки генома, кодирующие гликопротеины Gn и Gc, а также нуклеопротеин N, для получения библиотеки генов, кодирующих гликопротеины Gn и Gc и нуклеопротеин N вируса лихорадки долины Рифт.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины, молекулярной биологии и биотехнологии. Предложен способ определения чувствительности клеток рака легкого к цисплатину, включающий определение уровня экспрессии генов MLH1, ERCC1, DDB2, AKR1B1, FTL в зависимости от IC50 цисплатина для известных клеточных линий, построение градуировочной прямой зависимости IC50 цисплатина для этих клеточных линий от полученного уровня экспрессии указанных генов и гибридизацию на микрочипе. Предложен также набор олигонуклеотидных зондов, представленных SEQ ID NO: 9-13. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективные средства и методы для определения чувствительности клеток рака легкого к цисплатину. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 3 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу прогнозирования развития профессиональных гиперкератозов. Сущность способа состоит в том, что выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, проводят генотипирование полиморфизма rs1625895 гена ТР53 методом полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом. При выявлении генотипа G/A и аллеля А прогнозируют риск развития профессиональных гиперкератозов. Использование изобретения дает возможность прогнозировать развитие профессиональных гиперкератозов при воздействии на организм вредных производственных факторов. 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для определения риска развития рака тела матки у женщин с гиперпластическими процессами эндометрия. Осуществляют выделение ДНК из периферической венозной крови, проводят генотипирование гена APOE, выявляют полиморфные аллели APOE*2, APOE*3, APOE*4 и при наличии генотипов, содержащих аллели APOE*2 прогнозируют высокий риск рака эндометрия. Изобретение обеспечивает высокоспецифичный критерий для оценки прогноза риска развития гиперпролиферативных заболеваний эндометрия, в том числе эндометриоидной аденокарциномы у женщин с гиперпластическими процессами эндометрия. 2 ил., 10 табл., 4 пр.

Изобретения относятся к области ДНК-генеалогии и касаются способа определения гаплогрупп Y-хромосомы человека, тест-системы и олигонулкотидных праймеров. Охарактеризованный способ осуществляют в два этапа. На первом этапе производят генотипирование по основным гаплогруппам R,N,J,I,Q,C,E,D,G,O Y-хромосомного древа путем мультиплексной ПЦР с использованием специфичных олигонуклеотидных праймеров первого и второго наборов тест-системы. На втором этапе, если мутация выявлена, проводят дополнительную мультиплексную ПЦР для типирования по субгаплогруппам. Если на первом этапе мутация не выявлена, проводят мультиплексную ПЦР для типирования по редким гаплогруппам A,C3,F,H,K,L,O3 и Т. Последовательностям из первого набора тест-системы соответствует область отжига праймеров вне зон мутаций в пределах видовой специфичности. Последовательностям из второго набора тест-системы соответствует область отжига олигонуклеотидных праймеров, непосредственно примыкающая к зоне мутации в пределах видовой специфичности. Изобретения могут быть использованы для установления гаплогрупп Y-хромосомы человека. 3 н.п.ф-лы, 2 ил.,7 табл., 2 пр.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ обнаружения присутствия или отсутствия нескольких серотипов вируса папилломы человека (ВПЧ) в биологическом образце с помощью многоканальной системы анализа, где указанная система анализа обнаруживает большее количество серотипов, чем существует каналов обнаружения. Особенностью способа является то, что используются первый и второй наборы праймеров и зондов, являющихся вырожденными по отношению друг к другу. А также то, что каждый вырожденный зонд имеет сигнальную группировку, каждая из которых излучает сигнал, обнаружимый на одном и том же канале. При этом третий набор праймеров и зондов не является вырожденным по отношению к двум другим наборам праймеров и зондов и является отличительным для третьего серотипа, не относящегося к серотипам, к которым преимущественно происходит отжиг вырожденных наборов праймеров и зондов и где третий набор праймеров и зондов имеет сигнальную группировку, которая излучает сигнал при длине волны, которая является такой же или отличается от длины волны, излучаемой сигнальной группировкой вырожденных зондов. Представлены соответствующие праймеры и зонды. Изобретение позволяет обнаруживать большее количество типов ВПЧ, чем существует каналов детекции в системе анализа. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 табл.

Представленное изобретение относится к области биотехнологии и касается способа обнаружения провируса лейкоза крупного рогатого скота. Охарактеризованный способ включает выявление фрагмента LTR (Long Terminal Repeat) - последовательности провируса лейкоза. Определение размера амплифицированного фрагмента нуклеотидной последовательности путем электрофоретического разделения в агарозном геле. В качестве праймеров используются олигонуклеотиды: BL1.F 5-GAGTTAGCGGCACCAGAAGC-3 и BL1.R 5-ATAGAGCTCGCGGTGGTCTC-3. Продукт синтеза составляет 175 пар нуклеотидов. Геномную ДНК выделяют сорбентным методом с последующим элюированием в буфере ТЕ, а амплификацию проводят в режиме: 95°С - 3 минуты 1 раз, 94°С - 20 секунд денатурация, 66°С - 20 секунд - отжиг праймеров, 74°С - 25 секунд элонгация, 45 раз, 74°С - 3 минуты - достраивание цепей. В качестве положительного контроля прохождения реакции используют препарат положительного контроля антигена ВЛКРС. Изобретение может быть использовано в молекулярно-генетической диагностике болезней животных и научных исследованиях в ветеринарии. 2 ил., 1 табл.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ выделения коротких РНК из биологических жидкостей. Способ включает обработку образца денатурирующим буферным раствором, сорбцию коротких РНК на стекловолоконном сорбенте в присутствии хаотроптного агента с последующей отмывкой сорбента от несвязавшихся биополимеров и химических реагентов и элюцией целевого продукта. Образец биологической жидкости подвергают двухстадийной денатурации, при этом на первой стадии к образцу добавляют два объема денатурирующего буферного раствора, а на второй стадии к полученной смеси добавляют два объема 96% этанола и равный объем хлороформа с последующим перемешиванием и отделением осадка центрифугированием. Отмывку сорбента от несвязавшихся биополимеров осуществляют дважды буферным раствором, а элюцию целевого продукта с сорбента осуществляют буферным раствором. Изобретение обеспечивает упрощение способа, сокращение его длительности и повышение выхода коротких РНК. 2 з.п. ф-лы, 3 табл., 4 пр.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для детекции гриба Microsporum canis. Осуществляют выделение тотальной нативной ДНК из образца кожи и волос, проводят полимеразную цепную реакцию и амплификацию фрагмента гена 5.8S рРНК Microsporum canis с использованием специфических праймеров. При электрофоретическом обнаружении продукта амплификации размером 182 п.н. определяют наличие возбудителя. Изобретение обеспечивает специфическую детекцию Microsporum canis в клиническом материале и может быть использовано для диагностики микроспории. 2 пр.

Настоящее изобретение предоставляет способ предсказания ответа трижды негативного рака молочной железы на терапию противоопухолевым средством. Способ включает: (a) лизирование опухолевых клеток, взятых от трижды негативной опухоли молочной железы, для получения клеточного экстракта; (b) определение уровня экспрессии VEGFR2 в клеточном экстракте; и (c) сравнение уровня экспрессии VEGFR2 в клеточном экстракте, полученном на стадии (b), с эталонным уровнем экспрессии VEGFR2. Наличие низкого уровня экспрессии VEGFR2 предсказывает ответ на терапию противоопухолевым средством, где противоопухолевое средство представляет собой комбинацию бевацизумаба (Авастин®), карбоплатина и паклитакселя. 15 з.п. ф-лы, 14 ил., 7 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Система состоит из следующих элементов: а) модуля подготовки образца, выполненного с возможностью захвата аналита из биологического образца в немикрожидкостном объеме на захватывающей частице, реагирующей на магнитное поле, и направления связанной с аналитом захватывающей частицы, реагирующей на магнитное поле, через первый микрожидкостный канал; б) реакционного модуля, включающего реакционную камеру, имеющую жидкостное сообщение с первым микрожидкостным каналом, и выполненного с возможностью иммобилизации связанной с аналитом захватывающей частицы, реагирующей на магнитное поле, и проведения реакции амплификации множества STR-маркеров аналита. При этом модуль подготовки образца и реакционный модуль интегрированы в одноразовый картридж, который состоит из: 1) по меньшей мере одной совокупности жидкостных камер, 2) платы с реагентами или картриджа с реагентами и 3) одного или более чем одного пневматически активируемого MOVe-клапана; в) модуля анализа. Причем система сконфигурирована для захвата аналита, для проведения химической или биохимической реакции с аналитом и для проведения анализа продукта реакции менее чем за 4 часа. За счет использования в данной системе MOVe-клапанов осуществляется перенос текучих средств, устойчивый к утечкам, и появляется возможность уменьшить размеры устройства для подготовки образцов. Также с помощью данной системы можно отбирать организмы мишени из образцов с большим количеством фоновых примесей, различать два разных штамма бактерий, эффективно захватывать клетки и токсины, значительно уменьшить объем целевого образца. 1 н. и 29 з.п. ф-лы, 104 ил., 3 пр.
Наверх