Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации burkholderia pseudomallei



Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации burkholderia pseudomallei
Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации burkholderia pseudomallei

 


Владельцы патента RU 2556810:

Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации Burkholderia pseudomallei и дифференциации от возбудителя сапа методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией. Заявленное изобретение позволяет в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать возбудителя мелиоидоза и дифференцировать его от возбудителя сапа в пробах чистых культур и биологическом материале. 1 ил., 1 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано в медицине для выявления генетического материала возбудителя мелиоидоза Burkholderia pseudomallei в пробах как для диагностики в практическом здравоохранении и службе Роспотребнадзора, так и для научных исследований.

В списке инфекционных заболеваний мелиоидоз занимает место особо опасной инфекции (ООИ) с ареалом распространения в тропических и субтропических регионах мира. В основном это страны юго-восточной Азии: Малайзия, Сингапур, Таиланд, а также северные регионы Австралии. Возбудитель В. pseudomallei - аэробная грамотрицательная неферментирующая бактерия. В настоящее время проблема мелиоидоза приобрела значение не только для традиционно эндемичных районов, но и для стран, где заболевание ранее не регистрировалось (Западная Европа и Северная Америка). Это связано с расширением торгово-экономических, транспортных, культурных взаимоотношений между странами мира и развитием туризма. Распространение и укоренение возбудителя в «новых» районах его обитания возможно также и за счет завоза больных животных, зараженной почвы, воды, пищевых продуктов. Клинические проявления мелиоидоза разнообразны с возможностью перехода латентного и хронического в острое состояние. Отсутствие настороженности медицинского персонала определяет сложность при установлении диагноза в неэндемичных регионах, в частности в России.

Метод полимеразной цепной реакции является прямым методом выявления ДНК возбудителя мелиоидоза и обладает высокой специфичностью и чувствительностью. В основе реакции лежит механизм репликации, который характеризуется внутриклеточным удвоением молекул ДНК ферментом ДНК-полимеразой. Выбор специфического фрагмента ДНК и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения диагностики исследуемых микроорганизмов.

Внедрение в лабораторную диагностику метода ПЦР в режиме реального времени с флуоресцентной детекцией позволяет проводить выявление продуктов амплификации в процессе реакции и вести количественный учет ДНК. В одной пробирке протекает и детектируется реакция с использованием зондов, меченных различными флуоресцентными красителями, при помощи которых становится возможным автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Подобный подход дает возможность отказаться от стадии электрофореза, что ведет к резкому уменьшению вероятности контаминации исследуемых проб продуктами амплификации, а также позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР-лаборатории.

Известно использование зондов для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза с флуоресцентной детекцией на основе последовательностей генов 23S рРНК, BTTS, bfl (патент РФ 2435861, МПК С12Р 19/30, С12Q 1/68, опубл. 10.12.2011, Бюл. №34. Ткаченко Г.А., Савченко С.С., Зинченко О.В., Антонов В.А., Алексеева В.В.; патент РФ 2439159, МПК С12Р 19/30, опубл. 10.01.2012, Бюл. №1. Ткаченко Г.А., Савченко С.С., Зинченко О.В., Антонов В.А., Алексеева В.В.; патент РФ 2435860, МПК С12Р 19/30, C12Q 1/68, опубл. 10.12.2011, Бюл. №34. Ткаченко Г.А., Савченко С.С., Зинченко О.В., Антонов В.А., Алексеева В.В.).

В 2012 году опубликована статья Абрамова Д.Д., Воробьева А.А., Кузнецовского Д.А., Чухланцева Н.В. Праймеры и зонд, входящие в тест-систему, идентифицируют возбудителей мелиоидоза и сапа, но не дифференцируют друг от друга [Разработка и испытания молекулярно-биологической тест-системы для выявления ДНК патогенных видов буркхолдерий методом ПЦР в реальном времени // Молекулярная медицина. - 2012. - №3. - стр.16-22].

Наиболее близким аналогом являются специфичные праймеры, опубликованные в статье Janse I. с соавторами, входящие в тест-систему для дифференциации патогенных буркхольдерий на основе мультиплексной ПЦР. В качестве ДНК-мишени для идентификации возбудителя мелиоидоза использован ген psu [Janse I, Hamidjaja RA, Hendriks AC, van Rotterdam BJ. Multiplex qPCR for reliable detection and differentiation of Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei. BMC Infect Dis. 2013 Feb 14; 13:86. dot: 10.1186/1471-2334-13-86].

Однако в настоящее время в России для ПЦР-диагностики существуют наборы реагентов, которые идентифицируют возбудителей мелиоидоза и сапа, но не дифференцируют их между собой.

Целью настоящего изобретения является разработка высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации возбудителя мелиоидоза, а также для дифференциации его от возбудителя сапа методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией.

Цель достигается конструированием видоспецифичных олигонуклеотидов для идентификации мелиоидоза и дифференциации его от возбудителя сапа, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, имеющих следующую структуру:

5′-TGCATTCGGCCTTCAACATTCCA-3′-Bps-gp68-f

5′-CGGATCGCGCCATCTTGCTAC-3′-Bps-gp68-r

Флуоресцентная детекция реализуется при помощи сконструированного видоспецифичного олигонуклеотидного зонда с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярного маяка»:

Bps-gp68-Pr 5′(TAMRA)-TGCGCTTCATGATTGTCGGTGCGCA-(BHQ2)3′,

где TAMRA - тетраметилкарбоксиродамин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 546 нм, а длина волны флуоресценции - 576 нм. BHQ2 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 550-650 нм.

Характеристика олигонуклеотидных праймеров, зонда и ДНК-мишени для гибридизации.

Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, США), для идентификации ДНК возбудителя мелиоидоза и дифференциации его от возбудителя сапа были подобраны праймеры, обозначенные Bps-gp68-f/Bps-gp68-r, и зонд Bps-gp68-Pr, комплементарные участку гена, кодирующего белок gp68 B. pseudomallei из региона RimL (ацетилтрансферазы, включающие N-ацетилазы рибосомальных белков). Расчетная длина специфического фрагмента составляла 221 п.н.

В качестве положительного контроля эксперименты проводили на типовом штамме В. pseudomallei 100, используя для выделения ДНК обеззараженные суспензии микроорганизма в концентрациях от 1×109 м.к./мл до 1×101 м.к./мл. Апробация праймеров была осуществлена на наборе штаммов возбудителей мелиоидоза и сапа коллекционного центра ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора.

Чувствительность реакции амплификации с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с праймерами Bps-gp68-f/Bps-gp68-r и зондом Bps-gp68-Pr оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений чистых культур возбудителей мелиоидоза, и составила 1×104 м.к./мл.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда для идентификации ДНК возбудителей мелиоидоза методом ПНР в режиме реального времени.

На основе анализа in silico нуклеотидных последовательностей возбудителей мелиоидоза, присутствующих в базах данных (EMBL, Genbank, DDBJ), для конструирования прямого Bps-gp68-f и обратного Bps-gp68-r праймеров был выбран участок генома В. pseudomallei размером 486 п.н. (GenBank NCBI, GeneID: 126221798), кодирующий белок gp68 и входящий в состав RimL региона (ацетилтрансферазы, включающие N-ацетилазы рибосомальных белков). Расчетная длина предполагаемого ампликона, фланкируемого предлагаемыми праймерами, - 221 п.н. (табл.1).

Сконструирован флуоресцентно-меченый зонд Bps-gp68-Pr размером 25 п.н., обладающий комплементарностью к продукту реакции амплификации с праймерами Bps-gp68-f/Bps-gp68-r, меченный с 5′-конца флуоресцентным красителем TAMRA и с 3′-конца - гасителем флуоресценции BHQ2. Концевые последовательности зонда гибридизуются между собой и образуют «шпильку» по принципу «молекулярного маяка».

При подборе праймеров и зонда руководствовались общими требованиями к олигонуклеотидным затравкам, используемым в ПНР. С помощью компьютерных программ была проанализирована структура выбранных пар праймеров и зондов (образование димеров, шпилек и других вторичных структур) и показана их теоретическая пригодность для успешной инициации реакции амплификации и гибридизации.

Праймеры Bps-gp68-f/Bps-gp68-r и зонд Bps-gp68-Pr были проанализированы с использованием компьютерной программы BLAST на web-сервере Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) для установления гомологии между ними и нуклеотидными последовательностями близкородственных буркхольдерий, в том числе с В. mallei и других гетерологичных микроорганизмов, присутствующих в базах данных (EMBL, GenBank, DDBJ, Pathema). На момент проведения компьютерного анализа гомологии выявлено не было.

Пример 2. Амплификация и детекция специфических фрагментов ДНК с помощью разработанных праймеров Bps-gp68-f/Bps-gp68-r и флуоресцентно-меченого зонда Bps-gp68-Pr для идентификации возбудителя мелиоидоза методом ПНР в режиме реального времени.

В состав реакционной смеси помимо анализируемой ДНК входили разработанные комплементарные специфическому фрагменту ДНК В. pseudomallei олигонуклеотидный зонд Bps-gp68-Pr, прямой Bps-gp68-f и обратный Bps-gp68-r праймеры, а также дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буферный раствор и фермент Taq-F-полимераза (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора). Амплификацию продолжительностью 45 циклов проводили в объеме 25 мкл. В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь добавляли ТЕ-буфер.

Анализ продуктов ПЦР осуществляли в режиме реального времени на приборе «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия). Регистрацию результатов проводили в табличной и графической форме. Результат амплификации каждого штамма В. pseudomallei считался положительным, в случае если кривая накопления флуоресценции по каналу детекции пересекала пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции, на цикле, не превышающем граничное значение порогового цикла реакции (Ct) в соответствующей графе в таблице результатов (рис.1). Рисунок 1 отображает график нарастания флуоресцентных кривых, полученных при амплификации ДНК штаммов возбудителя мелиоидоза с праймерами Bps-gp68-f /Bps-gp68-r и зондом Bps-gp68-Pr (изображены кривые 1 - В. pseudomallei 100 в концентрации 105 м.к./мл; 2 - В. pseudomallei 100 в концентрации 104 м.к./мл, 3 - отрицательный контроль и кривые накопления флуоресценции проб В. pseudomallei в концентрации меньше 103 м.к./мл, не пересекающие пороговую линию).

Пример 3. Определение чувствительности и специфичности реакции амплификации с помощью разработанных олигонуклеотидных праймеров Bps-gp68-f/Bps-gp68-r и флуоресцентно-меченого зонда Bps-gp68-Pr для идентификации ДНК возбудителя мелиоидоза и дифференциации его от возбудителя сапа.

Чувствительность реакции амплификации с разработанными специфичными праймерами Bps-gp68-f/Bps-gp68-r и флуоресцентно-меченым зондом Bps-gp68-Pr оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из бактериальных взвесей клеток В. pseudomallei. Штаммы буркхольдерий выращивали на плотных питательных средах в течение 1-2 суток. Готовили бактериальные взвеси клеток в 4 мл 0,15 М раствора натрия хлорида в концентрации 1×09 м.к./мл по отраслевому стандартному образцу мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ОСО 42-28-85 П) и разводили таким образом, чтобы концентрации возбудителей сапа составляла от 1×109 до 1×101 м.к./мл.

Учитывая, что возбудитель мелиоидоза относится к агентам II группы патогенности, пробоподготовку и обеззараживание материала для проведения ПЦР осуществляли согласно МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» и МУ 4.2.2787-10 «Лабораторная диагностика мелиоидоза». Обеззараживание исследуемых проб проводили добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,01% и прогреванием в течение 30 мин при температуре 56°С. Выделение ДНК из чистых культур буркхольдерий, близкородственных и гетерологичных микроорганизмов проводили путем нуклеосорбции и лизиса клеток гуанидинтиоцианатом с помощью набора «ДНК-сорб-В» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией по применению.

Специфичность разработанных праймеров Bps-gp68-f/Bps-gp68-r и флуоресцентно-меченого зонда Bps-gp68-Pr оценена на коллекции из 84 штаммов, из которых 48 штаммов В. pseudomallei и 36 штаммов гетерологичных микроорганизмов (14 штаммов В. mallei, 10 штаммов В. cepacia, 5 штаммов В. thailandensis и по 1 штамму Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Bacillus anthracis, Echerichia coli). Оценка специфичности показала отсутствие перекрестных реакций с близкородственными гетерологичными штаммами, в том числе с ДНК В. mallei, и наличие специфической амплификации со всеми штаммами В. pseudomallei.

Чувствительность тест-системы оценивали на десятикратных разведениях бактериальных взвесей штаммов В. pseudomallei. В амплификационную смесь добавляли по 10 мкл ДНК, выделенной из разведений от 1×105 до 1×101 м.к./мл. Анализ результатов показал, что с помощью разработанных праймеров Bps-gp68-f/Bps-gp68-r и флуоресцентно-меченого зонда Bps-gp68-Pr обнаруживают ДНК возбудителя мелиоидоза при концентрации в пробе 1×104 м.к./мл.

Таким образом, разработанные праймеры Bps-gp68-f/Bps-gp68-r и флуоресцентно-меченый зонд Bps-gp68-Pr могут быть использованы для обнаружения ДНК возбудителя мелиоидоза и позволяют в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать возбудителя мелиоидоза и дифференцировать его от возбудителя сапа в пробах чистых культур и биологическом материале.

Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации Burkholderia pseudomallei и дифференциации от возбудителя сапа методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией, комплементарных участку гена, кодирующего белок gp68 В. pseudomallei из региона RimL ацетилтрансферазы, включая N-ацетилазы рибосомальных белков, обладающие активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, и зонда с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярного маяка», обеспечивающего флуоресцентную детекцию, имеющие следующую структуру:
5′-TGCATTCGGCCTTCAACATTCCA-3′-Bps-gp68-ƒ
5′-CGGATCGCGCCATCTTGCTAC-3′-Bps-gp68-r
5′(TAMRA)-TGCGCTTCATGATTGTCGGTGCGCA-(BHQ2)3′-Bps-gp68-Pr,
где TAMRA - тетраметилкарбоксиродамин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 546 нм, а длина волны флуоресценции - 576 нм; BHQ2 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 550-650 нм.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, молекулярной биологии и биотехнологии. Предложен способ определения полиморфизма гена GP6 человека, кодирующего гликопротеин VI, по полиморфной позиции rs 1613662, основанный на снятии кривых плавления с флуоресцентно-мечеными аллель-специфичными олигонуклеотидными пробами.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к интернализации терапевтических молекул внутрь клетки, и может быть использовано в медицине. Получают композицию для доставки молекул нуклеиновых кислот в клетки, содержащую по меньшей мере один пептид с по меньшей мере 92% идентичностью к GAAEAAARVYDLGLRRLRQRRRLRRERVRA (SEQ ID NO: 2); IREIMEKFGKQPVSLPARRLKLRGRKRRQR (SEQ ID NO: 3); или YLKVVRKHHRVIAGQFFGHHHTDSFRMLYD (SEQ ID NO: 4), присоединенный к одной или нескольким молекулам нуклеиновых кислот.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу анализа пригодности РНК, экстрагированной из ткани или клетки (клеток), фиксированных с помощью фиксатора, для анализа экспрессии генов.

Группа изобретений относится к области лизиса клеток. Предложен способ избирательного лизиса животных клеток, а также прибор для обнаружения микроорганизмов.

Изобретения относятся к области медицинской микробиологии и касаются способа дифференциации токсигенных генетически измененных штаммов V.cholerae биовара Эль Тор и тест-системы.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу выявления мутаций в гене MYO7A, сопровождающихся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты или синдрома Ушера.
Изобретение относится к области биотехнологии и касается специфических олигонуклеотидных праймеров. Представленные праймеры включают сайты эндонуклеазного расщепления, фланкирующие участки генома, кодирующие гликопротеины Gn и Gc, а также нуклеопротеин N, для получения библиотеки генов, кодирующих гликопротеины Gn и Gc и нуклеопротеин N вируса лихорадки долины Рифт.

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются олигонуклеотидных праймеров и способа выявления ДНК Mycobacterium avium с их использованием. Охарактеризованные олигонуклеотидные праймеры комплементарны специфичной области mig-гена Mycobacterium avium и имеют следующий нуклеотидный состав: 5'-CGT CAA AAG CGA ACT GCA-3' и 5'-ТАА ТТС GTT GCC CGA СТС-3'. Способ выявления ДНК Mycobacterium avium выключает выделение ДНК, проведение амплификации ДНК с использованием олигонуклеотидных праймеров, перенос продукта амплификации на гель с последующим детектированием результатов анализа на трансиллюминаторе.

Изобретение относится к области кардиологии и касается набора синтетических олигонуклотидов. Представленный набор используется для выявления мутаций кодирующей части генов NKX2.5, CFC1, GATA4, ассоциированных с орфанной моногенной патологией, лежащей в основе семейных форм врожденных пороков сердца.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к паре синтетических олигонуклеотидных праймеров, применяемых для выделения ДНК провируса и РНК вируса иммунодефицита кошек, и к способу диагностики вирусного иммунодефицита кошек с использованием данных праймеров.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к ингибиторам сигнального пути AXL, и может быть использовано в медицине. Получают растворимый вариант полипептида AXL без трансмембранного домена AXL, который содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении номер n, где n выбран из 32, 72, 87, 92 или 127 или их сочетание, где n+7 соответствует нумерации SEQ ID NO: 1 - последовательности AXL дикого типа, в котором указанная модификация повышает сродство связывания полипептида AXL со специфически задерживающим рост белком 6 (GAS6), которое, по меньшей мере, примерно в 2 раза сильнее, чем сродство полипептида AXL дикого типа. Полипептид может быть слит с Fc фрагментом и использован в способе лечения, снижения или предотвращения метастазирования или инвазии опухоли у пациента-млекопитающего. Изобретение позволяет эффективно ингибировать сигнальные пути AXL/GAS6. 6 н. и 2 з.п. ф-лы, 15 ил., 6 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в диагностике кардиомиопатий различной природы. Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления мутаций кодирующей части гена десмина (DES), ассоциированных с кардиомиопатиями. Мутации выявляют путем определения полной нуклеотидной последовательности кодирующей части гена DES. Осуществляют амплификацию кодирующей части гена DES с помощью 7 пар синтетических олигонуклеотидов при одной температуре и времени отжига, с последующим секвенированием полученных продуктов амплификации с помощью одной пары универсальных праймеров. Предложенное изобретение позволяет чувствительно и специфично определять мутации гена DES, при этом сокращаются время реакции амплификации, количество манипуляций, время внесения реактивов для реакции секвенирования и снижается вероятность ошибки при постановке реакции. 2 з.п. ф-лы, 1 ил.
Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу идентификации изменений в экспрессии генов, характерных для старения, в выбранной ткани. Выбранная ткань представляет собой сердечную, мышечную, мозговую или жировую ткань. Способ включает отбор одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в ткани старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, с применением двух критериев. Указанными критериями являются изменение экспрессии по меньшей мере в 50% линий, пород или этнических групп тестируемых видов на заранее определенном уровне значимости в р<0.10, а также по меньшей мере частичное обращение изменений в экспрессии генов путем ограничения в калорийности. Изобретение обеспечивает получение надежных тканеспецифических биомаркеров старения. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 11 табл., 5 пр.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины, молекулярной биологии и биотехнологии. Предложен способ определения чувствительности клеток рака легкого к цисплатину, включающий определение уровня экспрессии генов MLH1, ERCC1, DDB2, AKR1B1, FTL в зависимости от IC50 цисплатина для известных клеточных линий, построение градуировочной прямой зависимости IC50 цисплатина для этих клеточных линий от полученного уровня экспрессии указанных генов и гибридизацию на микрочипе. Предложен также набор олигонуклеотидных зондов, представленных SEQ ID NO: 9-13. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективные средства и методы для определения чувствительности клеток рака легкого к цисплатину. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 3 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу прогнозирования развития профессиональных гиперкератозов. Сущность способа состоит в том, что выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, проводят генотипирование полиморфизма rs1625895 гена ТР53 методом полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом. При выявлении генотипа G/A и аллеля А прогнозируют риск развития профессиональных гиперкератозов. Использование изобретения дает возможность прогнозировать развитие профессиональных гиперкератозов при воздействии на организм вредных производственных факторов. 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для определения риска развития рака тела матки у женщин с гиперпластическими процессами эндометрия. Осуществляют выделение ДНК из периферической венозной крови, проводят генотипирование гена APOE, выявляют полиморфные аллели APOE*2, APOE*3, APOE*4 и при наличии генотипов, содержащих аллели APOE*2 прогнозируют высокий риск рака эндометрия. Изобретение обеспечивает высокоспецифичный критерий для оценки прогноза риска развития гиперпролиферативных заболеваний эндометрия, в том числе эндометриоидной аденокарциномы у женщин с гиперпластическими процессами эндометрия. 2 ил., 10 табл., 4 пр.

Изобретения относятся к области ДНК-генеалогии и касаются способа определения гаплогрупп Y-хромосомы человека, тест-системы и олигонулкотидных праймеров. Охарактеризованный способ осуществляют в два этапа. На первом этапе производят генотипирование по основным гаплогруппам R,N,J,I,Q,C,E,D,G,O Y-хромосомного древа путем мультиплексной ПЦР с использованием специфичных олигонуклеотидных праймеров первого и второго наборов тест-системы. На втором этапе, если мутация выявлена, проводят дополнительную мультиплексную ПЦР для типирования по субгаплогруппам. Если на первом этапе мутация не выявлена, проводят мультиплексную ПЦР для типирования по редким гаплогруппам A,C3,F,H,K,L,O3 и Т. Последовательностям из первого набора тест-системы соответствует область отжига праймеров вне зон мутаций в пределах видовой специфичности. Последовательностям из второго набора тест-системы соответствует область отжига олигонуклеотидных праймеров, непосредственно примыкающая к зоне мутации в пределах видовой специфичности. Изобретения могут быть использованы для установления гаплогрупп Y-хромосомы человека. 3 н.п.ф-лы, 2 ил.,7 табл., 2 пр.

Изобретение относится к биохимии. Описан способ обнаружения присутствия или отсутствия нескольких серотипов вируса папилломы человека (ВПЧ) в биологическом образце с помощью многоканальной системы анализа, где указанная система анализа обнаруживает большее количество серотипов, чем существует каналов обнаружения. Особенностью способа является то, что используются первый и второй наборы праймеров и зондов, являющихся вырожденными по отношению друг к другу. А также то, что каждый вырожденный зонд имеет сигнальную группировку, каждая из которых излучает сигнал, обнаружимый на одном и том же канале. При этом третий набор праймеров и зондов не является вырожденным по отношению к двум другим наборам праймеров и зондов и является отличительным для третьего серотипа, не относящегося к серотипам, к которым преимущественно происходит отжиг вырожденных наборов праймеров и зондов и где третий набор праймеров и зондов имеет сигнальную группировку, которая излучает сигнал при длине волны, которая является такой же или отличается от длины волны, излучаемой сигнальной группировкой вырожденных зондов. Представлены соответствующие праймеры и зонды. Изобретение позволяет обнаруживать большее количество типов ВПЧ, чем существует каналов детекции в системе анализа. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 табл.

Представленное изобретение относится к области биотехнологии и касается способа обнаружения провируса лейкоза крупного рогатого скота. Охарактеризованный способ включает выявление фрагмента LTR (Long Terminal Repeat) - последовательности провируса лейкоза. Определение размера амплифицированного фрагмента нуклеотидной последовательности путем электрофоретического разделения в агарозном геле. В качестве праймеров используются олигонуклеотиды: BL1.F 5-GAGTTAGCGGCACCAGAAGC-3 и BL1.R 5-ATAGAGCTCGCGGTGGTCTC-3. Продукт синтеза составляет 175 пар нуклеотидов. Геномную ДНК выделяют сорбентным методом с последующим элюированием в буфере ТЕ, а амплификацию проводят в режиме: 95°С - 3 минуты 1 раз, 94°С - 20 секунд денатурация, 66°С - 20 секунд - отжиг праймеров, 74°С - 25 секунд элонгация, 45 раз, 74°С - 3 минуты - достраивание цепей. В качестве положительного контроля прохождения реакции используют препарат положительного контроля антигена ВЛКРС. Изобретение может быть использовано в молекулярно-генетической диагностике болезней животных и научных исследованиях в ветеринарии. 2 ил., 1 табл.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ выделения коротких РНК из биологических жидкостей. Способ включает обработку образца денатурирующим буферным раствором, сорбцию коротких РНК на стекловолоконном сорбенте в присутствии хаотроптного агента с последующей отмывкой сорбента от несвязавшихся биополимеров и химических реагентов и элюцией целевого продукта. Образец биологической жидкости подвергают двухстадийной денатурации, при этом на первой стадии к образцу добавляют два объема денатурирующего буферного раствора, а на второй стадии к полученной смеси добавляют два объема 96% этанола и равный объем хлороформа с последующим перемешиванием и отделением осадка центрифугированием. Отмывку сорбента от несвязавшихся биополимеров осуществляют дважды буферным раствором, а элюцию целевого продукта с сорбента осуществляют буферным раствором. Изобретение обеспечивает упрощение способа, сокращение его длительности и повышение выхода коротких РНК. 2 з.п. ф-лы, 3 табл., 4 пр.
Наверх