Способ определения содержания малонового диальдегида в вегетативных органах растений методом капиллярного электрофореза



Способ определения содержания малонового диальдегида в вегетативных органах растений методом капиллярного электрофореза
Способ определения содержания малонового диальдегида в вегетативных органах растений методом капиллярного электрофореза
Способ определения содержания малонового диальдегида в вегетативных органах растений методом капиллярного электрофореза
Способ определения содержания малонового диальдегида в вегетативных органах растений методом капиллярного электрофореза
Способ определения содержания малонового диальдегида в вегетативных органах растений методом капиллярного электрофореза
Способ определения содержания малонового диальдегида в вегетативных органах растений методом капиллярного электрофореза
Способ определения содержания малонового диальдегида в вегетативных органах растений методом капиллярного электрофореза
Способ определения содержания малонового диальдегида в вегетативных органах растений методом капиллярного электрофореза

 

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2596791:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства" (RU)

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способу определения малонового диальдегида в вегетативных органах черешни, винограда, ореха грецкого и проростках озимой пшеницы. Для этого проводят экстракцию биологического материала 96% спиртом и с последующим центрифугированием. Далее супернатант обрабатывают 0,5%-ным водным раствором тиобарбитуровой кислоты и инкубируют 30 мин при 50°C. После охлаждения реакционную смесь центрифугируют. Содержание малонового диальдегида определяют методом капиллярного электрофореза в кварцевом капилляре с внутренним диаметром 75 мкм и эффективной длиной 0,5 м. Анализ проводят при длине волны 254 нм в токе электролита, содержащего 0,33% масс. борной кислоты и 0,05% масс. тетрабората натрия при положительной полярности напряжения. Расчет проводят с учетом того, что на одну молекулу малонового альдегида расходуется две молекулы тиобарбитуровой кислоты. Изобретение позволяет проводить количественное определение концентрации малонового диальдегида, который служит маркером оксидативного стресса растений. 1 табл., 4 ил., 4 пр.

 

Изобретение относится к аналитической химии альдегидов, в частности к способу определения малонового диальдегида.

Малоновый диальдегид возникает в организме при деградации полиненасыщенных жиров активными формами кислорода и служит маркером перекисного окисления жиров и оксидативного стресса [Молекулярно-генетические и биохимические методы в современной биологии растений / под ред. Вл.В. Кузнецова, В.В. Кузнецова, Г.А. Романова. - М.: Бином. Лаборатория знаний, 2012. - 487 с.].

Известно, что для выделения и изучения малонового диальдегида используют различные методы, основанные на получении окрашенного триметинового комплекса малонового диальдегида с тиобарбитуровой кислотой, количество которого определяется по оптической плотности при 532 нм.

Для выделения малонового диальдегида в сыворотке крови ее инкубируют 30 мин при температуре 40°C, реакцию останавливают 3 мМ раствором дигидрокверцетина с последующим добавлением 1%-ного раствора трилона X-100, 0,6 М раствора HCl и 0,06 М рабочего раствора тиобарбитуровой кислоты, смесь которых нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин. Окраску раствора стабилизируют 5 мМ раствором трилона Б и смесью этанола с хлороформом в соотношении (7:3). В качестве контроля используют образец, содержащий 0,06 М рабочего раствора тиобарбитуровой кислоты и бидистиллированную воду, которую добавляют вместо экстракта ткани. Оптическую плотность растворов измеряют при 532 нм. Контролем служит пробирка, в которую добавляют все эти же растворы, а вместо сыворотки - бидистиллированную воду. В расчетах концентрации малонового диальдегида используют коэффициент поглощения 156 мМ-1см-1 [Рогожин В.В., Курилюк Т.Т. Повышение чувствительности метода определения концентрации малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Тезисы VII конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока - 2004». Устные доклады. Секция 5. Анализ биологических, медицинских и фармацевтических объектов // http:www.anchem.ru/literature/books/asbv-2004/095.asp].

Наиболее близким к заявляемому способу техническим решением является способ определения малонового диальдегида в растениях. Для этого растительный материал гомогенизируют в 20%-ной трихлоруксусной кислоте, центрифугируют и в супернатант добавляют 0,5%-ную тиобарбитуровую кислоту в 20%-ной трихлоруксусной кислоте и эту смесь инкубируют 30 мин при 95°C. В качестве контроля используют раствор тиобарбитуровой кислоты в трихлоруксусной кислоте [Молекулярно-генетические и биохимические методы в современной биологии растений / под ред. Вл.В. Кузнецова, В.В. Кузнецова, Г.А. Романова. - М.: Бином. Лаборатория знаний, 2012. - 487 с.].

Недостатки способа: при взаимодействии альдегидов с нуклеофилами образуются вещества, из которых альдегиды могут легко регенерироваться под действием кислоты, что снижает точность их количественного определения [Реутов О.А. Органическая химия. - Т. 3. - М.: Бином. Лаборатория знаний, 2004. - С. 10-134].

Малоновый диальдегид вступает в реакцию с тиобарбитуровой кислотой, образуя красный флуоресцентный состав, что позволяет проводить лишь приблизительный спектроморфометрический анализ содержания малонового диальдегида [Nair V., O′Neil C.L., Wang P.G. "Malondialdegyde" Enciclopedia for organic synthesis, 2008, John Wiley & Sons, New York. Doi: 10.1002/047084289X.rm013.pub 2 Article Online Posting Data: march 14. 2008].

Задачей изобретения является определение малонового диальдегида методом высокоэффективного капиллярного электрофореза для повышения точности обеспечения экспрессных и достоверных количественных результатов при минимальных затратах на пробоподготовку и выполнение анализа.

Техническим результатом при использовании предлагаемого изобретения является экспрессность и достоверность количественного определения малонового диальдегида методом капиллярного электрофореза с применением нетоксичных и доступных реактивов для проведения анализа.

Технический результат достигают за счет того, что способ определения малонового диальдегида предусматривает экстракционную пробоподготовку образца биологического материала 96%-ным этанолом, затем после экстракции и центрифугирования к супернатанту добавляют 0,5%-ный водный раствор тиобарбитуровой кислоты и реакционную смесь инкубируют 30 мин при 50°C, охлаждают, центрифугируют, содержание малонового диальдегида определяют по убыли количества тиобарбитуровой кислоты, пошедшей на реакцию, методом капиллярного электрофореза в кварцевом капилляре эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм с использованием для анализа водного ведущего электролита, содержащего 0,33% масс. борной кислоты, 0,05% масс. тетрабората натрия при положительной полярности напряжения и длине волны детектирования 254 нм.

Для калибровки прибора используют стандартные водные растворы тиобарбитуровой кислоты.

Способ отличается тем, что с целью обеспечения экспрессности и достоверности анализа для выделения малонового диальдегида из растительной ткани образец гомогенизируют в 96% этаноле, затем после экстракции и центрифугирования к супернатанту добавляют 0,5%-ный водный раствор тиобарбитуровой кислоты и содержание малонового диальдегида определяют по убыли количества тиобарбитуровой кислоты, пошедшей на реакцию, методом капиллярного электрофореза.

Поставленная задача достигается за счет того, что для выделения малонового диальдегида из растительной ткани используется 96% этанол с последующим определением содержания малонового диальдегида по убыли количества тиобарбитуровой кислоты, пошедшей на реакцию с образованием триметинового комплекса, с учетом того, что на одну молекулу малонового диальдегида расходуется две молекулы тиобарбитуровой кислоты.

В результате проведенных исследований и сравнения с аналогом установлено, что предлагаемый способ определения содержания малонового альдегида в вегетативных органах, включающий экстракцию малонового диальдегида из растительной ткани 96% этанолом в течение 30 мин с последующим центрифугированием и инкубированием реакционной смеси экстракта с 0,5%-ным водным раствором тиобарбитуровой кислоты в течение 30 мин при 50°C и определением содержания малонового диальдегида по убыли количества тиобарбитуровой кислоты, пошедшей на реакцию с образованием триметинового комплекса, с учетом того, что на одну молекулу малонового альдегида расходуется две молекулы тиобарбитуровой кислоты, позволяет достичь объективного, экспрессного определения массового содержания малонового диальдегида в биологических пробах.

Преимущества заявляемого способа заключаются в использовании нетоксичных и доступных реактивов при пробоподготовке, получении более стабильного триметинового комплекса вследствие использования водного раствора тиобарбитуровой кислоты, снижения температуры реакционной смеси с 95°C до 50°C, что снижает потери от испарения реактивов, и осуществлении анализа на системах капиллярного электрофореза, например серии «Капель», обеспечении объективности и достоверности анализа образцов, стабильности во времени ведущего электролита, позволяющего обеспечить эффективное разделение анализируемого компонента.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Определение содержания малонового диальдегида методом капиллярного электрофореза

Согласно способу прототипа 100 мг растительного материала гомогенизируют в 1,5 см3 20% трихлоруксусной кислоты, центрифугируют при 10000 g в течение 15 мин при 4°C. К отобранным 0,3 см3 супернатанта добавляют 1,2 см3 0,5% тиобарбитуровой кислоты в 20% трихлоруксусной кислоте. Реакционную смесь инкубируют 30 мин при 95°C, охлаждают, центрифугируют 15 мин при 10000 g. Оптическую плотность супернатанта определяют при 532 нм и 600 нм. В качестве контроля используют раствор тиобарбитуровой кислоты в трихлоруксусной кислоте. Расчет содержания малонового диальдегида проводят по формуле:

где Cx - содержание малонового диальдегида, мкмоль/г сырой массы; E - оптическая плотность раствора; Ve - объем экстракта, мл; Va - объем экстракта, взятый для анализа, мл; k - коэффициент молярной экстинкции МДА=156 мМ-1 × см-1; mв - масса образца для экстракции, г.

По заявляемому способу. Образец листьев массой 0,1 г заливали 1,5 см 96%-ного этанола и тщательно гомогенизировали. Затем экстракцию проводили на шейкере в течение 30 минут. Полученный экстракт центрифугировали 15 мин при 10000 g. К 0,3 см супернатанта добавляли 1,2 см 0,5% водного раствора тиобарбитуровой кислоты в бидистиллированной воде и полученную реакционную смесь инкубировали 30 минут при 50°C, затем охлаждали и центрифугировали 15 мин при 10000 g. Содержание остаточной тиобарбитуровой кислоты в супернатанте определяли методом капиллярного электрофореза. В качестве контроля использовали 1,2 см3 0,5% водного раствора тиобарбитуровой кислоты в бидистиллированной воде в смеси с 0,3 см 96% этанола. Полученные растворы переносили для анализа в систему капиллярного электрофореза. Анализ осуществляли согласно описанным выше параметрам.

Расчет содержания малонового диальдегида проводили с учетом того, что на одну его молекулу при образовании триметинового комплекса приходится две молекулы тиобарбитуровой кислоты

где Cx - содержание малонового диальдегида, мкмоль/г сырой массы; Ак - содержание тиобарбитуровой кислоты в контрольном образце; Аоб - содержание тиобарбитуровой кислоты в опытном образце; Ve - объем экстракта, мл; Va - объем экстракта, взятый для анализа, мл; m - масса образца для экстракции, г.

Контролем служило определение малонового диальдегида этих же растительных образцов согласно способу-прототипу.

Полученные результаты приведены в таблице. Электрофореграммы определения малонового диальдегида в экстракте листьев черешни, винограда, в проростках пшеницы.

Пример 2. Определение содержания малонового диальдегида в листьях винограда

Аналогично примеру 1, кроме того, что пробоподготовке подвергали листья винограда сорта Красностоп АЗОС. Полученные результаты приведены в таблице.

Пример 3.

Аналогично примеру 1, кроме того, что пробоподготовке подвергали листья проростков озимой пшеницы сорта Краснодарская 99. Полученные результаты приведены в таблице.

Пример 4.

Аналогично примеру 1, кроме того, что пробоподготовке подвергали листья ореха грецкого.

Полученные результаты приведены в таблице.

Таблица - Содержание малонового диальдегида в листьях растений, мкмоль/г сырой массы

Применение заявляемого способа позволило получить воспроизводимый результат в обоих случаях для примеров 1-4.

Для проверки надежности метода капиллярного электрофореза использовали метод добавки тиобарбитуровой кислоты в пробу биологического материала. Установлено, что степень извлечения тиобарбитуровой кислоты для анализируемых образцов составила 103,5-104,1%.

Эти данные свидетельствуют о возможности корректного определения малонового диальдегида согласно заявляемому способу.

Предлагаемый способ практически лишен таких недостатков, как необходимость дополнительного разбавления проб для корректного анализа, влияние мешающих веществ биологической природы - фенольные соединения, водный раствор ведущего электролита стабилен во времени и не загрязняет внутреннюю поверхность капилляра.

При реализации способа получены количественные результаты определения массовой концентрации малонового диальдегида, превосходящие по своему качеству прототип, так как экстракцию проводят при комнатной температуре для снижения интенсивности окисления липидов. Реакцию малонового диальдегида с 0,5%-ным раствором биобарбитуровой кислоты в водно-спиртовом 20%-ном растворе проводят при температуре 50°C, что позволяет снизить регенерацию малонового диальдегида из триметинового комплекса.

Способ определения малонового диальдегида, характеризующийся тем, что предусматривает экстракционную подготовку пробы биологического материала, центрифугирование, взаимодействие выделенного малонового диальдегида с тиобарбитуровой кислотой, отличающийся тем, что для выделения малонового диальдегида из растительной ткани используется 96% этанол, затем после экстракции и центрифугирования к супернатанту добавляют 0,5%-ный водный раствор тиобарбитуровой кислоты и реакционную смесь инкубируют 30 мин при 50°С, охлаждают, центрифугируют, содержание малонового диальдегида определяют методом капиллярного электрофореза в кварцевом капилляре эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм с использованием для анализа водного ведущего электролита, содержащего 0,33% масс. борной кислоты, 0,05% масс. тетрабората натрия при положительной полярности напряжения и длине волны детектирования 254 нм по убыли количества тиобарбитуровой кислоты, пошедшей на реакцию.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике, и может быть использовано для определения угрозы нарушения ферментативной активности в плаценте и развития плода при снижении содержания пирувата на фоне обострения цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для оценки угрозы нарушения формирования фетоплацентарной системы и развития плода в период гестации при снижении количества эстрадиола в связи со снижением содержания андростендиона в синцитиотрофобласте плаценты на фоне обострения цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре беременности.

Изобретение относится к медицине и касается способа диагностики тяжести течения бронхиальной астмы. Способ осуществляют путем выявления пероксидазной активности миоглобина гистохимическим методом после фиксации биоптатов слизистой бронхов в 10% растворе формалина в течение 5 дней, замораживания их и приготовления срезов толщиной 5 мк, которые помещают на 1 мин в бензол и окрашивают 5-8 мин при 80°C в растворе, состоящем из 100 мг бензидина в 0,85% NaCl, раствор охлаждают и фильтруют, добавляют к 9 мл раствора 1 мл 40% раствора хлористого аммония и 1 каплю 3% раствора перекиси водорода, после проведенной реакции срезы споласкивают в 0,85% NaCl и заключают в глицерин-желатину для последующего изучения пероксидазной активности миоглобина по программе «Scion».

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для внутрипортальной озонотерапии при распространенном перитоните. Озонирование проводят посредством медицинского озонатора с концентрацией озона в озонокислородной смеси не менее 1000 мкг/л.
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для персонализированного назначения неоадъювантной химиотерапии (НАХТ) больным люминальным В раком молочной железы.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу диагностики псориаза. Сущность способа состоит в том, что он включает исследование показателей системы свертывания крови и тромбообразования пациента: скорость роста сгустка крови, и/или задержку роста сгустка, и/или начальную скорость роста сгустка, и/или стационарную скорость роста сгустка, и/или размер сгустка.

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ оценки литогенности желчи, включающий определение в желчи у обследуемого (i) показателей холестерина (ХС, ммоль/л) в сравнении со средними значениями, принятыми за норму (k), отличающийся тем, что в желчи определяют комплекс общих липидов (ОЛ, г/л), суммарную антиокислительную активность (АОА) электрохимическим методом (в нА·с), максимум вспышки хемилюминесценции (МВХЛ, в усл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу прогнозирования чувствительности к химиотерапии у больных с лимфопролиферативными заболеваниями. Сущность способа состоит в том, что в сыворотке крови определяют количественные уровни маркеров тимидинкиназы-1 (TK-1) и β2-микроглобулина (β2-МГ), а также после первого курса химиотерапии активность TK-1.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике и гепатологии во внутренних болезнях, и может быть использовано для оценки состояния печени у больных хроническим вирусным гепатитом С.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для оценки индивидуального генетического риска атеросклероза. Осуществляют взятие крови, выделение ДНК и генотипирование митохондриальной ДНК.
Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике, и может быть использовано для оценки появления признаков позднего токсикоза. Способ включает определение содержания магния в эритроцитах периферической крови и при снижении его до 0,402±0,002 ммоль/л появляются на 7 месяце гестации признаки позднего токсикоза.

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ определения обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой, отличающийся тем, что проводят определение уреазной активности следующим образом: в одну из лунок микропланшета вносят водный раствор мочевины с фосфатным буфером, в две другие вносят водные растворы мочевины с фосфатным буфером, содержащие уреазу с известной концентрацией 5 и 10 Ед/л соответственно, а в остальные лунки вносят водный раствор мочевины с фосфатным буфером и образцами ротовой жидкости, затем во все лунки вносят фенол/нитропруссидный реагент и гипохлорит, после чего измеряют оптическую плотность на микропланшетном ридере при длине волны 546 нм и рассчитывают концентрацию уреазы в образцах ротовой жидкости в Ед/л, при значении уреазной активности выше 15,85±2,11 Ед/л регистрируют обсемененность полости рта уреазопозитивной микробиотой. Осуществление изобретения позволяет выявить необходимость противомикробной терапии для профилактики образования твердых зубных отложений и воспалительных заболеваний пародонта. 2 пр.

Группа изобретений относится к области медицины и иммунологии. В частности, группа изобретений относится к способам иммунологической диагностики, включающим применение как нативной молекулы, так и пептидных последовательностей фрагментов плазминогена, которые могут быть использованы в качестве универсальной системы детекции продуктов протеолиза с образованием на COOH-концах пептидной цепи лизина при проведении анализа для выявления у человека заболеваний, ассоциированных с повышенной активностью протеолитических ферментов. Группа изобретений касается также тест-системы, содержащей в качестве детектора как нативную молекулу, так и указанные пептидные последовательности. Технический результат заключается в достижении необходимой степени диссоциации комплекса антиген-антитело, присутствующего в образце, взятом у субъекта, а также в изменении конформации белков, что, в свою очередь, позволяет существенно повысить чувствительность метода определения уровня протеолитических фрагментов с C-концевым лизином, способных связываться с плазминогеном или его фрагментами. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ). У индивидуумов русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья России, из периферической венозной крови выделяют ДНК, после чего проводят анализ полиморфизмов генов TNFα, Ltα, TNFR1 и TNFR2. Среди индивидуумов без сопутствующей патологии глаз в случае выявления комбинации -308G TNFα и +1663G TNFR2 либо комбинации +36G TNFR1 и +1663G TNFR2 или при наличии сопутствующей патологии глаз как миопия, катаракта или возрастная макулярная дегенерация сетчатки в случае выявления +36A TNFR1 либо комбинации +36AA TNFR1 и +1663A TNFR2 либо +250G Ltα и +36AA TNFR1 прогнозируют повышенный риск развития ПОУГ. У индивидуумов с сопутствующей патологией глаз при выявлении +250A Ltα и +36G TNFR1 либо -308G TNFα и +36G TNFR1 прогнозируют низкий риск развития ПОУГ. Изобретение обеспечивает раннее выявление больных с ПОУГ, что позволит предупредить прогрессирование заболевания. 6 ил., 2 табл., 7 пр.
Наверх