Способ оценки влияния алюминия на иммунный статус



Способ оценки влияния алюминия на иммунный статус
Способ оценки влияния алюминия на иммунный статус

 


Владельцы патента RU 2629597:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (ФБУН "ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения") (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки влияния алюминия на иммунный статус. Для этого в пробе крови пациента определяют содержание алюминия, и в тех пробах крови пациентов, где содержание алюминия выше референтного значения, извлекают иммунокомпетентные клетки. Определяют мембранный маркер лимфоцитов CD11a/CD18 и количество внутриклеточного маркера апоптоза - белка bcl2. Затем рассчитывают интегральный коэффициент Ккр., равный отношению содержания CD11a/CD18 к содержанию белка bcl2: Ккр=(CD11a/CD18)/bcl2. При значении указанного интегрального коэффициента более 70 при одновременном содержании алюминия в крови пациента выше его референтного значения оценивают состояние иммунного статуса пациента от воздействия алюминия как соответствующее патологическому повышению иммунологической реактивности. Использование данного способа позволяет достоверно установить влияние алюминия на возникновение иммунодефицита за счет использования в качестве информативного критерия совокупности уровня контаминации алюминием и соотношения клеточного рецептора и белка, характеризующих инициируемый алюминием процесс клеточной гибели как маркер эффекта иммунотоксического действия. 2 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к биологическим исследованиям и медицине и предназначено для идентификации неблагоприятного воздействия алюминия, поступающего из окружающей среды, на иммунитет населения, проживающего на территориях с повышенным содержанием этого токсиканта в атмосферном воздухе и в питьевой воде, в частности, для прогнозирования степени вероятности возникновения изменений иммунного статуса.

В настоящее время большое внимание уделяется проблеме изучения влияния вредных химических факторов на формирование здоровья населения. Иммунная система является основной защитной системой организма, которая контролирует поддержание гомеостаза внутренней среды и обеспечивает нормальное функционирование организма в целом.

Под термином «иммунный статус» понимается комплексный показатель состояния иммунной системы - это количественная и качественная характеристика состояния функциональной активности органов иммунной системы.

В связи с широчайшим использованием химических технологий в различных производственных циклах и сферах человеческой деятельности пристальное внимание ученых и медиков привлекает проблема выявления пороговых критериев, позволяющих на ранних этапах оценить, что воздействие вредного химического вещества превышает компенсаторные возможности организма и наносит вред здоровью человека. Актуальность исследования неблагоприятного воздействия алюминия особенно обусловлена на территориях, вблизи которых размещены предприятия цветной металлургии.

Токсичность алюминия проявляется во влиянии на обмен веществ, в особенности минеральный, на функцию нервной системы, в способности действовать непосредственно на клетки - их размножение и рост. В основе механизма многих проявлений интоксикации лежит действие алюминия непосредственно на ядерный хроматин, а также косвенно - путем замещения других элементов или изменения активности ряда ферментных систем.

Для задач оценки степени воздействия среды обитания на здоровье, ранней диагностики нарушений здоровья, а также для оценки эффективности профилактики и лечения актуальным является выделение маркерных показателей изменения иммунного статуса человека под воздействием алюминия, которые могут использовать в качестве индикаторов нарушения гомеостаза и в качестве дополнительных диагностических критериев санитарно-эпидемиологической обстановки.

Иммунная система, являясь основной защитной системой организма, в первую очередь реагирует на воздействие ксенобиотических факторов, поэтому целесообразно оценивать степень воздействия химических токсикантов, в частности алюминия, основываясь на изменениях со стороны иммунной системы.

Из уровня техники известны три вида диагностики иммунодефицитных состояний:

по отклонению ряда клинико-лабораторных показателей, характеризующих иммунную систему, от нормы (например, изобретения по патентам РФ №№2058552, 2058553, 2179316);

- по изменению параметров организма в зависимости от воздействия химических веществ (например, изобретения по патентам РФ №№2111700, 2152618, 2494401, 2180116);

- по прогностическим диагностическим индексам, характеризующим сопряженные ответные реакции организма, в виде соотношения показателей компартментов гомеостатических систем (например, патенты РФ №2561599, 2546524).

Однако первый вид технических решений не позволяет достоверно и точно установить связь иммунного статуса населения с неблагоприятной экологической обстановкой среды проживания и негативными условиями производственной среды, т.к. этими способами устанавливается лишь факт ухудшения иммунного состояния человека без установления причины этого ухудшения. Поэтому последующие лечебные мероприятия могут оказаться безрезультатными, если не установить причину заболевания.

Что же касается технических объектов второго вида, то они являются более перспективными и точными при установлении влияния вредных химических факторов среды обитания на иммунный статус человека. Но и они не лишены недостатков.

Например, известный способ гигиенической оценки влияния содержащихся в воздухе вредных веществ на организм человека, согласно которому производят клинико-инструментальное обследование населения посредством определения кратности превышения среднерабочей величины максимальной нормируемой интенсивности легочной вентиляции над предельно допустимой концентрацией в воздухе, по которой судят об ухудшении состояния здоровья человека под воздействием экологической обстановки (патент РФ №2111700), позволяет установить ухудшение здоровья человека в целом лишь от экологически вредных веществ, находящихся в воздухе, и не применим для определения состояния иммунного статуса населения в зависимости от химических токсикантов, попадающих в организм человека другими путями.

Еще одним известным способом является способ определения лимфотоксичности лекарственных препаратов в реакции спонтанного Е-розеткообразования, согласно которому после 90 минут инкубации лимфоцитарной взвеси с лекарственным препаратом и 18 часовой инкубации с эритроцитами барана вычисляется индекс лимфотоксичности по отношению к контролю, и в случае его превышения 1,0 делается вывод о лимфотоксическом эффекте лекарственного препарата (патент РФ №2152618). Назначение указанного известного способа - определение необходимости и адекватности возможного использования лекарственных препаратов, т.е. химических веществ, на организм человека, учитывая иммунный статус последнего. Однако этот известный способ не направлен на диагностику иммунотропного действия уже имеющегося в организме вещества. Отсутствует количественный критерий наличия данного вещества в организме. В указанном способе нет упоминания о том, какая и по какому принципу подобрана вносимая in vitro концентрация лекарственного вещества. Данный способ не позволяет оценить влияние экологической ситуации на территории проживания пациента на иммунный статус. Способ по продолжительности слишком длителен, а оценочный индекс, с учетом стандартной погрешности метода до 25%, некорректно мал, что также снижает точность определения.

Из последних современных известных способов следует указать на способ диагностики нарушения иммунного статуса у детей в условиях химической контаминации (патент РФ №2494401), согласно которому производят отбор пробы крови у детей, проживающих в условиях химической контаминации. Затем выполняют клинико-лабораторные исследования крови на содержание вредных химических соединений. Далее у детей проводят ультразвуковое исследование (УЗИ) селезенки для оценки ее эхоструктуры с использованием датчика частотой не менее 10 МГц. При наличии в ультразвуковом срезе селезенки гипоэхогенных однородных округлых включений размером 0,3-1,0 мм, расположенных на расстоянии 1,5-2 мм друг от друга, а также при одновременном превышении концентрации вредного химического соединения в крови по сравнению с его референтным значением диагностируют реактивные изменения специфического иммунитета у детей. Изобретение обеспечивает создание информативного, безопасного и точного способа ультразвуковой диагностики при одновременной простоте и доступности для широкого практического применения. Однако указанный известный способ не обеспечивает диагностику ранних нарушений иммунного статуса в результате воздействия вредных химических соединений, так как УЗИ-признаки нарушений возникают и идентифицируются позже изменений молекулярно-клеточном уровне.

Известен способ оценки влияния химических токсикантов на состояние иммунного статуса населения (патент РФ №2180116). Согласно этому способу устанавливают в пробе венозной крови содержание токсиканта, обусловленного экологической средой обитания населения, выделяют из пробы лимфоциты (мононуклеарные клетки) и добавляют к ним установленный токсикант в концентрации, соответствующей норме, полученную смесь инкубируют при температуре, соответствующей нормальной температуре организма человека, далее методом иммунологического анализа устанавливают в пробе количество лимфоцитов, содержащих дифференцировочные антигены, обусловленных воздействием токсиканта, и при снижении количества соответствующих кластеров лимфоцитов в пробе под воздействием токсиканта не менее чем в 1,5 раза по сравнению с контрольной пробой без введенного в нее дополнительно токсиканта при одновременном обнаружении токсиканта в пробе крови в концентрации, превышающей норму, судят об ухудшении состояния иммунитета. Указанный известный способ повышает точность и достоверность установления оценки влияния химического токсиканта на состояние иммунного статуса населения.

Однако этот известный способ не обеспечивает идентификацию тонких и глубоких клеточных изменений ассоциированных с их гибелью, когда нарушения происходят на уровне внутриклеточных белков, что характерно для веществ обладающих мутагенной активностью, к которым относится, например, алюминий.

Третья группа патентов: №2561599 «Способ прогнозирования возникновения иммунных нарушений под воздействием стронция с использованием иммуногенетических критериев» и №2546524 «Способ оценки влияния метанола на иммунный статус работников химического производства», предусматривает установление диагностических критериев (индексов), по которым судят о нарушении иммунного статуса населения.

В первом патенте в качестве такого диагностического критерия используют индекс экспрессии, который устанавливают следующим образом: определяют содержание лимфоцитов CD8+ путем сепарации их из клеток крови, далее выделенную фракцию лимфоцитов CD8+ делят на две части, одну из которых подвергают инкубации со стронцием, а вторую оставляют в качестве контрольной, причем инкубацию осуществляют путем введения в пробу CD8+ 10 мг/л стронция, затем определяют в обеих пробах лимфоцитов CD8+ количество рибонуклеиновой кислоты РНК путем выделения ее из сепарированных клеток CD8+, проводят реакцию обратной транскрипции РНК в дезоксирибонуклеиновую кислоту ДНК, в которой определяют количество гена дефензина альфа, причем при этом определении в качестве внутреннего контроля используют ген домашнего хозяйства GAPDH, далее рассчитывают уровень относительной экспрессии гена дефензина альфа, принимая за спонтанную экспрессию уровень, относящийся к контрольной пробе CD8+, а за индуцированную экспрессию - уровень, относящийся к пробе CD8+, в которую введен стронций, и по индексу экспрессии, который равен отношению индуцированной экспрессии к спонтанной, судят об иммунных нарушениях у пациента, связанных с воздействием стронция, причем при указанном индексе меньше 0,7 прогнозируют развитие иммунодефицитного состояния, а при индексе более 3 - развитие пролиферативного статуса в иммунной системе.

Однако этот известный способ применим только для установления нарушения иммунного статуса под влиянием токсиканта - стронция.

Второй патент рекомендует в качестве диагностического критерия информационный индекс, который определяют следующим образом. Производят отбор пробы венозной крови, устанавливают в ней фактическое содержания метанола и лабораторных иммунологических показателей, внутриклеточных маркеров апоптоза: белка bax и белка bcl2. После установления в пробе крови фактического содержания метанола производят его сравнение с величиной фоновой концентрации путем определения коэффициента, равного их соотношению: С1/С2, где С1 - фактическое содержание метанола в крови; С2 - фоновая концентрация метанола, затем рассчитывают критериальный коэффициент, равный соотношению указанных bax/bcl2, далее рассчитывают информационный индекс клеточной гибели по формуле: . И при значении указанного индекса клеточной гибели более 6 при одновременном содержании метанола в крови выше его фоновой концентрации оценивают состояние иммунного статуса от воздействия метанола как иммунодефицитное.

Однако и этот известный способ применим только для установления нарушения иммунного статуса под влиянием токсиканта - метанола.

При этом из уровня техники не были выявлены известные способы оценки иммунных нарушений, ассоциированных с внешнесредовым воздействием алюминия, поэтому сделать выбор ближайшего аналога к заявляемому объекту не представляется возможным.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в обеспечении достоверности установления оценки влияния алюминия на возникновение иммунодефицита за счет использования в качестве информативного критерия совокупности уровня контаминации алюминием и соотношения клеточного рецептора и белка, характеризующих инициируемый алюминием процесс клеточной гибели как маркер эффекта иммунотоксического действия алюминия.

Поставленный технический результат обеспечивается предлагаемым Способом оценки влияния алюминия на иммунный статус, заключающимся в том, что в пробе крови пациента определяют содержание алюминия, в тех пробах крови пациентов, где содержание алюминия выше референтного значения, извлекают иммунокомпетентные клетки, определяют мембранный маркер лимфоцитов CD11a/CD18 и количество внутриклеточного маркера апоптоза - белка bcl2, затем рассчитывают интегральный коэффициент Ккр., равный отношению содержания CD11a/CD18 к содержанию белка bcl2:

Ккр=(CD11a/CD18)/bcl2,

и при значении указанного интегрального коэффициента более 70 при одновременном содержании алюминия в крови пациента выше его референтного значения оценивают состояние иммунного статуса пациента от воздействия алюминия как соответствующее патологическому повышению иммунологической реактивности.

Указанный технический результат обеспечивается за счет следующего.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала пробы венозной крови, а также стандартных методик изучения таких параметров, как содержание в пробе крови мембранного маркера лимфоцитов CD11a/CD18 и белка bcl2, обеспечивается простота, надежность и доступность исследований, а также получение результатов нужной информативности.

При названии рецептора CD11a/CD18 используют несколько равнозначных вариантов (синонимов) - интегрин αLβ2, LFA-1 (Lymphocyte function-associated antigen 1), состоит из 2-х субъединиц - интегрин альфаL и интегрин бета-2, экспрессирован не только на Т- и В-лимфоцитах, но и на всех лейкоцитах (моноцитах, нейтрофилах), а также на фагоцитах, например на фагоцитах ЦНС - астроцитах, что очень важно в контексте влияния алюминия на клетки нервной системы и инициации аутоиммунной патологии центральной нервной системы (далее - ЦНС).

При реализации предлагаемого способа определяют экспрессию интегринового рецептора на Т-лимфоцитах (точнее, на CD8+T-лимфоцитах с использованием клона антител 2D7), но при этом теоретически экстраполируются полученные результаты на все клеточные популяции данного индивидуума, которые экспрессируют интегрины, в т.ч. клетки глии мозга.

Техногенное химическое воздействие оказывает негативное влияние на регуляторные системы и адаптационные возможности организма, что в свою очередь ведет к снижению резистентности иммунитета, сопротивляемости организма к инфекционным заболеваниям и повышению чувствительности к неинфекционной патологии. Механизмы реализации этих состояний часто ассоциированы с нарушениями запрограммированной гибели клеток (апоптоза), при которых наблюдается либо активация апоптоза, либо его торможение. Рецептор CD11a/CD18 при его активации характеризует включение агрессивных иммунных механизмов, повреждение мембраны и инициацию клеточной гибели, в то время как внутриклеточный белок bcl2 ассоциирован с антиапоптотическими процессами. Повышенная активация апоптоза является звеном нейродегенеративных и миелодиспластических заболеваний, а также ишемических повреждений разных органов. Ингибирование клеточной гибели определяет опухолевые поражения различной природы, аутоиммунные и вирусные заболевания.

При изучении влияния экзогенных химических факторов на возникновение дисбаланса иммунной системы, что часто выражается в нарушении регуляции апоптоза, особую значимость представляет оценка минорных белковых фракций и фенотипов клеточного иммунитета. Использование медико-химического и предложенного специфического иммунологического тестирования позволило подтвердить наличие особенностей процессов, ассоциированных с апоптозом, при воздействии техногенных химических факторов, а именно алюминия, на организм человека. При этом для идентификации показателей внутриклеточных маркеров регуляции апоптоза рекомендуется использовать метод проточной цитометрии сочетанных (комбинированных) фенотипов в суспензии клеток из периферической крови, к которым относится и маркер клеточной адгезии CD11a/CD18.

Токсичность алюминия проявляется во влиянии на обмен веществ, в особенности минеральный, на функцию нервной системы, в способности действовать непосредственно на клетки - их размножение и рост. В основе механизма многих проявлений интоксикации лежит действие алюминия непосредственно на ядерный хроматин, а также косвенно - путем замещения других элементов или изменения активности ряда ферментных систем.

К важнейшим клиническим проявлениям нейротоксического действия алюминия относят нарушения двигательной активности, судороги, снижение или потеря памяти, психотические реакции - «миоклоническую энцефалопатию». Концентрация алюминия в головном мозге, особенно в сером веществе, достигает очень больших значений.

Имеются данные о мутагенной активности алюминия, а именно: при концентрации металла 1 мг/л число клеток с хромосомными аберрациями достигало 11%. Подкожная имплантация дисков или фольги из алюминия приводит к злокачественному перерождению тканей.

Нарушение адгезивных взаимодействий считают специфическим свойством иммунных нарушений, аутоиммунных и опухолевых процессов [Kato Y. et al., 2005; Lascombe I. et al., 2006].

Известно, что на поверхности многих типов клеток присутствуют молекулы межклеточной адгезии (ICAM - intercellular adhesion molecules). С одной стороны, они являются гистонеспецифическими контактными молекулами интеграции клеток в тканевых системах, с другой стороны, служат лигандами для функционально гомологичных молекул лейкоцитарных интегринов, в том числе LFA-1 (CD11a/CD18), обеспечивающих адгезию иммунных эффекторов и клеток-мишеней [Хаитов P.M. и др., 2011; Wong S. et al., 2007; Hynes R. et al., 2009].

Показано, что недостаток или избыток гистонеспецифических молекул адгезии на мембранах иммунных клеток (в том числе клеток глии) индуцирует изменение экспрессии соответствующих лейкоцитарных интегринов, что приводит к дисбалансу их взаимодействий.

Соли алюминия могут связываться с компонентом мембраноатакующего комплекса iC3b, а этот компонент является частью рецептора CD11a/CD 18. [Esin Güven, Karen Duus, Inga Laursen, Peter , and Gunnar Houen 'Aluminum Hydroxide Adjuvant Differentially Activates the Three Complement Pathways with Major Involvement of the Alternative Pathway //PLoS One. 2013; 8(9): e74445].

Такое взаимодействие объясняет влияние алюминия на гибель клеток мозга при болезни Альцгеймера [Qingyi Ma, Sheng Chen, Damon Klebe, John H. Zhang, Jiping Tang Adhesion Molecules in CNS Disorders: Biomarker and Therapeutic Targets CNS Neurol Disord Drug Targets. Author manuscript; available in PMC 2015 March 25. Published in final edited form as: CNS Neurol Disord Drug Targets. 2013 May 1; 12(3): 392-404].

К «генам жизни» относят систему bcl, а основной ее представитель - это белок bcl-2. Белок bcl-2 - главный ингибитор клеточной гибели и локализуется на наружной мембране митохондрий.

Индуцирующее влияние ионов (солей) алюминия на организм диктует необходимость углубленного изучения состояния иммунологического здоровья населения, проживающего в условиях его экспозиции, с целью обоснования маркерных показателей, свидетельствующих о ранних нарушениях иммунной регуляции, лежащих в основе нейродегенеративных и опухолевых иммуноопосредованных патологических процессов.

Для идентификации показателей мембранных (CD11a/CD18) и внутриклеточных (bcl2) маркеров иммунной регуляции, рекомендуется использовать метод проточной цитометрии сочетанных (комбинированных) фенотипов в суспензии клеток из периферической крови у населения.

Белок bcl2 является ведущим внутриклеточным супрессором апоптоза, служит фактором выживания клетки, защищая ее от запрограммированной гибели. При преобладании bcl2 клетка с большей вероятностью будет защищена от апоптоза.

В качестве критерия ранних иммунных нарушений в условиях контаминации алюминием в предлагаемом способе рекомендуется использовать интегральный коэффициент, представляющий соотношение маркера мембраноатакующего комплекса CD11a/CD18 с эффекторной внутриклеточной системой, реализующей действие алюминия, которую представляет маркер bcl2. В случае превышения величины интегрального коэффициента Ккр, равного отношению: CD11a/CD18/bcl2, более 70, идентифицируются ранние признаки формирования иммуноагрессивных состояний, характеризующихся клеточной гибелью, ассоциированных с экспозицией алюминием.

Таким образом, предлагаемый способ позволит охарактеризовать иммунотропный эффект поступления алюминия в организм на уровне всего организма в целом и принимать решения о коррекционных и профилактических мероприятиях по снижению контаминации алюминием как на индивидуальном уровне, так и на популяционном уровне.

Исходя из вышеизложенного можно сделать вывод, что поставленный технический результат обеспечивается за счет совокупности операций предлагаемого способа, их последовательности и режимов его реализации.

Способ оценки влияния алюминия на иммунный статус

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

1. Производят забор периферической венозной крови утром, натощак, в пробирку, содержащую этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА).

2. Для исследования кровь с ЭДТА разводят раствором хлорида натрия (9 г/л, рН=7,2) в два раза, наслаивают на 3 мл градиента плотности фиколла-урографина (концентрация фиколла составляла 9%, плотность градиента - 1,077 г/мл) и центрифугируют 30 мин при 1500 об/мин.

3. Образовавшееся в интерфазе «кольцо» мононуклеарных клеток отбирают пипеткой, полученную клеточную взвесь дважды отмывают раствором хлорида натрия (9 г/л, рН 7,2).

4. Полученную взвесь мононуклеаров ресуспендируют в рабочем растворе фосфатно-солевого буфера (PBS) до концентрации 1×106 клеток/мл. В состав фосфатно-солевого буфера PBS входит смесь солей: хлорида натрия, гидроортофосфата натрия, дигидроортофосфата натрия и азида натрия, с рН=7,2.

5. Фенотипирование фракции мононуклеаров (фракция мононуклеаров представляет собой преимущественно лимфоцитарные клетки, и порядка 10-15% это циркулирующие моноциты крови) проводится методом проточной цитометрии на цитометре FACSCalibur фирмы «Becton Dickinson» («BD», USA) с использованием программы CellQuest-PrO («BD», USA). Этот известный метод подробно расписан в следующих источниках информации:

- [Kootstra CJ, Van Der Giezen DM, Van Krieken JH, De Heer E, Bruijn JA. Effective treatment of experimental lupus nephritis by combined administration of anti-CD11a and anti-CD54 antibodies. Clin Exp Immunol. 1997; 108(2):324-332];

- [Driessens MH, van Hulten P, Zuurbier A, La Riviere G, Roos E. Inhibition and stimulation of LFA-1 and Mac-1 functions by antibodies against murine CD18. Evidence that the LFA-1 binding sites for ICAM-1, -2, and -3 are distinct. J Leukoc Biol. 1996; 60(6):758-765. (Clone-specific: Blocking)];

- [Reed JC, Tsujimoto Y, Alpers JD, Croce CM, Nowell PC. Regulation of bcl-2 proto-oncogene expression during normal human lymphocyte proliferation. Science. 1987; 236(4806): 1295-1299.(Biology)].

Содержание внутриклеточного антиапоптотического маркера bcl2 (Oncoprotein bcl-2) (%) определяют с помощью меченых моноклональных антител (МКАТ), конъюгированных с FITC («eBioscience», США).

Содержание мембранного маркера лимфоцитов CD11a/CD18 (%) определяют с использованием панелей меченых моноклональных антител (МКАТ) к мембранным CD-рецепторам (РЕ Rat Anti-Mouse CD11a, клон 2D7 «BD», USA).

Эти маркеры (CD11a/18, bcl-2) во фракции мононуклеаров присутствуют у лимфоцитов и моноцитов. При определении не разделяют эти клетки на субпопуляции, но проводят гейтирование фракции лимфоцитов и определяют содержание позитивных по этим маркерам клеток от общего числа лимфоцитов.

6. Содержание алюминия в крови определяли по Методике «Методы контроля. Химические факторы. Определение содержания химических элементов в диагностируемых биосубстратах, препаратах и биологически активных добавках методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой», изложенной в МУК 4.1.1483-03, с использованием масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой Agilent 7500сх с октопольной реакционной/столкновительной ячейкой (USA).

7. Интегральный коэффициент Ккр (у.е.) рассчитывают как отношение содержания CD11a/CD18 (%) к содержанию bcl2 (%).

8. У тех обследуемых пациентов, у кого значение интегрального коэффициента Ккр превышало 70 при одновременном содержании алюминия в крови выше его референтного значения состояние иммунного статуса от воздействия алюминия оценивают соответствующим патологическому повышению иммунологической реактивности (это способность организма отвечать на антигенное раздражение выработкой гуморальных антител и комплексом клеточных реакций, специфичных по отношению к антигену), которое в дальнейшем может привести либо к «истощению» иммунной системы, либо к возникновению аутоиммунной патологии (http://www.studfiles.ru/preview/1472669/). Используя эту информацию, в дальнейшем осуществляют в отношении этих пациентов элиминационные и корректирующие иммунитет программы.

Для доказательства адекватности выбранного значения интегрального коэффициента и характеристики степени влияния алюминия на иммунный статус было обследовано 18 пациентов детского возраста 3-7 лет, проживающих на территории с повышенным содержанием алюминия (фактическое содержание алюминия в атмосферном воздухе указанной территории составляло 2.1 ПДК). У всех обследуемых была взята венозная кровь, исследование которой проводилось по вышеуказанной схеме. Из указанных детей 9 человек не имеют в пробах крови превышения референтного уровня алюминия (т.е. менее 0,006-0,007 мг/дм3), а 9 человек - имеют превышение референтного уровня (т.е. более 0,006-0,007 мг/дм3). Данные, полученные в результате исследований, приведены в таблицах 1 и 2.

В таблице 1 приведены данные о детях, у которых уровень контаминации алюминия в пробе крови не превышает уровень референтного значения. А в таблице 2 приведены данные о детях, у которых уровень контаминации алюминия в пробе крови превышает референтный уровень. Также для каждого пациента приведены значения вышеуказанного интегрального коэффициента Ккр., по которому оценивают иммунный статус.

Данные исследований показали, что во второй группе детей (таблица 2) с превышением уровня контаминации алюминием над референтным содержание CD11a/CD18 и количество белка bcl2 в пробе крови достоверно отличались (р<0,05) от аналогичных показателей в группе детей (первая группа) (таблица 1), имеющих уровень алюминия в крови, не превышающий референтный, что свидетельствовало о нарушениях иммунного статуса детей второй группы под влиянием высоких концентраций алюминия. Это подтверждается и высокими значениями интегрального коэффициента (более 70) у детей этой группы.

Таким образом, рекомендуемый к определению интегральный коэффициент (более 70) позволяет диагностировать наличие, степень и направленность нарушений здоровья при экспозиции алюминия по изменению самой чувствительной из систем - иммунной.

Наличие иммунных нарушений определяется отклонением от нормы мембранного (CD11a/CD18) и внутриклеточного (bcl2) параметров иммунного статуса, совокупным интегральным показателем которого выступает их соотношение - Ккр.

Степень нарушений характеризуется уровнем превышения величины интегрального показателя Ккр. - чем выше показатель, тем выраженнее нарушения.

Направленность ранних нарушений иммунной реактивности, ассоциированной с экспозицией алюминием, будет выражаться повышением агрессии иммунной системы за счет активации мембраноатакующего комплекса.

Установленные значения интегрального коэффициента позволят не только определить степень выраженности нарушений иммунного статуса, но и вовремя провести лечебные и профилактические мероприятия.

Для иллюстрации реализации предлагаемого способа и его достоверности приведены два примера по конкретным пациентам одного возраста и пола из группы детей с повышенным содержанием алюминия в крови и детей с содержанием алюминия в пределах референтной концентрации.

Пример 1.

Пациент, 4 года. Определяется уровень алюминия в крови выше референтного диапазона - 0,078 мг/дм3 (референтный уровень 0,006-0,007 мг/дм3). Количество в крови мембранного активационного маркера CD11a/CD18=72,57%; внутриклеточного маркера: bcl2=0,63. Критериальный коэффициент Ккр.=CD11a/CD18/bcl2 равен 115,19 (т.е. выше 70). Это говорит о том, что согласно предлагаемому способу у данного ребенка состояние иммунного статуса от воздействия алюминия оценивается как патологическое повышение иммунологической реактивности.

Для доказательства данного вывода были установлены следующие иммунологические показатели у данного ребенка, которые имели следующие значения: CD127--лимфоциты (Т-регуляторные клетки) - 3,09% (физиологическая норма 0,8-1,2%); CD3+CD25+-лимфоциты (активационный маркер) - 13% (норма 5-12%); IgG - 15,75 г/дм3 (норма 10,0-14,0 г/дм3); IgA - 1,98 г/дм3 (норма 1,2-1,8 г/дм3). IgM - 2,02 г/дм3 (норма 1,12-1,8 г/дм3).

Анализируя представленные данные, можно сделать вывод, что у пациента имеются изменения в иммунной системе, в частности наличие избыточной активности иммунной системы, которое в дальнейшем грозит либо истощением иммунной системы, либо переходом в нозологические формы аутоиммунной патологии. Такой вывод подкрепляется тем, что наблюдается повышенная экспрессия иммуноцитов с фенотипом регуляторных клеток (CD127--лимфоциты), активационных клеточных маркеров (CD3+CD25+-лимфоциты), а также гиперпродукция иммуноглобулинов класса A,M,G.

Пример 2.

Пациент, 4 года. Определяется уровень алюминия в крови ниже референтного диапазона - 0,005 мг/дм3 (референтный диапазон 0,006-0,007 мг/дм3). Значение в пробе крови мембранного активационного маркера CD11a/CD18=60,71%; внутриклеточного маркера: bcl2=1,33. Критериальный коэффициент Ккр.=CD11a/CD18/bcl2 равен 45,65 (т.е. ниже 70). Это говорит о том, что согласно предлагаемому способу у данного ребенка состояние иммунного статуса от воздействия алюминия не оценивается как патологически активированное.

Для доказательства данного вывода - отсутствие повышенной иммунной реактивности - были установлены следующие иммунологические показатели у данного ребенка, которые имели следующие значения: CD127--лимфоциты (Т-регуляторные клетки) - 0,93% (норма 0,8-1,2%); CD3+CD25+-лимфоциты (активационный маркер) - 7% (норма 5-12%); IgG - 10,75 г/дм3 (норма 10,0-14,0 г/дм3); IgA - 1,28 г/дм3 (норма 1,2-1,8 г/дм3). IgM - 1,22 г/дм3 (норма 1,12-1,8 г/дм3).

Анализируя представленные данные, можно сделать вывод, что у обследуемого пациента отсутствуют изменения в иммунной системе. Такой вывод подкрепляется тем, что отсутствует повышенный уровень иммуноцитов с фенотипом регуляторных клеток (CD127-лимфоциты) и активационных клеточных маркеров (CD3+CD25+-лимфоциты), а также не наблюдается превышения нормы содержания иммуноглобулинов класса A,M,G. Таким образом, при анализе мембранных и внутриклеточных маркеров иммунного статуса изменений показателей, обусловленных действием алюминия, выявлено не было.

Приведенные данные еще раз доказывают, что рекомендуемый в предлагаемом способе для оценки иммунного статуса интегральный коэффициент и его величина (более 70) позволяют достоверно диагностировать наличие нарушения здоровья при экспозиции алюминием по изменению иммунной системы (повышенной ее активации), причем по самым чувствительным ее параметрам - соотношения мембранных и внутриклеточных регуляторных показателей.

Способ оценки влияния алюминия на иммунный статус, характеризующийся тем, что в пробе крови пациента определяют содержание алюминия, в тех пробах крови пациентов, где содержание алюминия выше референтного значения, извлекают иммунокомпетентные клетки, определяют мембранный маркер лимфоцитов CD11a/CD18 и количество внутриклеточного маркера апоптоза - белка bcl2, затем рассчитывают интегральный коэффициент Ккр., равный отношению содержания CD11a/CD18 к содержанию белка bcl2:

Ккр=(CD11a/CD18)/bcl2,

и при значении указанного интегрального коэффициента более 70 при одновременном содержании алюминия в крови пациента выше его референтного значения оценивают состояние иммунного статуса пациента от воздействия алюминия как соответствующее патологическому повышению иммунологической реактивности.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биомедицины и касается способа диагностирования острого повреждения почек и применения in vitro набора, содержащего праймеры, необходимые для выполнения способа.

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и может быть использовано для диагностики периода инфекционного процесса, вызванного вирусом ветряной оспы.

Группа изобретений относится к способу калибровки составного анализа, включающему: добавление калибровочного реагента, включающего по меньшей мере две различные связывающие молекулы, где каждая молекула обладает способностью специфичного связывания с агентом захвата и способностью связываться с детектирующей молекулой и где по меньшей мере две из связывающих молекул имеют различные специфичности и присутствуют в различных концентрациях, добавление детектирующей молекулы, детектирование связанной детектирующей молекулы, создание калибровочной кривой, включающей ряд калибровочных точек/интервалов.

Настоящая группа объектов изобретения относится к области биотехнологии. Предложен рекомбинантный мультимерный скаффолд на основе 3 домена FnIII тенасцина (Tn3), который специфически связывается с рецептором 2 TRAIL (TRAIL R2).

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлен рекомбинантный ген, кодирующий белок L1 вируса папилломы человека 16 типа, с кодонами, оптимизированными для гетерологичной экспрессии в штаммах Е.

Изобретение относится к области биохимии. Предложено антитело к рецептору эпидермального фактора роста 2 (HER2) человека, а также включающие указанное антитело фармацевтические композиции, предназначенные для профилактики и лечения злокачественной опухоли и для индуцирования апоптоза.

Изобретение относится к медицине и касается способа получения селективного иммуносорбента для удаления антител к десмоглеину 3 типа (Dsg3) из крови больных пузырчаткой, при котором приготавливают раствор Dsg3 в фосфатном буфере.

Настоящее изобретение относится к акушерству и касается прогнозирования угрозы невынашивания инфекционного генеза на ранних сроках гестации. Сущность способа: в сыворотке крови беременных со сроком 6-11 недель гестации с помощью иммуноферментного анализа определяют уровень интерфероноподобного цитокина IL-28B.
Изобретение относится к медицине, а именно к ветеринарии, и может быть использовано для получения антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для иммуногистохимического выявления антигенов в препаратах органов продуктивных и непродуктивных животных длительного хранения в фиксаторах.

Изобретение относится к медицине и представляет собой способ диагностики параимплантарного воспаления после эндопротезирования крупных суставов, характеризующийся тем, что производят забор крови, готовят образцы сыворотки крови, осуществляют исследование сыворотки крови с помощью иммуноферментного анализа, определяя количественные значения показателей: фактора, ингибирующего миграцию макрофагов (MIF), и белка, стимулирующего макрофаги (MSP), а также интерлейкинов 1, 4, 8, 10 (IL1, IL4, IL8, IL10), рассчитывают коэффициент выраженности макрофагальной реакции и коэффициент выраженности гуморального ответа , определяют показатель развития параимплантарного воспаления К, равный (К1+К2)-2.7, и при его отрицательных значениях констатируют регресс патологического процесса, при положительных значениях - прогресс патологического процесса. Изобретение позволяет повысить чувствительность и специфичность диагностики направленности развития параимплантарного воспаления. 2 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии и клинической иммунологии. У больных определяют клинико-анамнестические и лабораторно-инструментальные критерии диагностики псориатического артрита и присваивают им баллы. При возрасте старше 40 лет присваивают 1 балл, кожном зуде - 1 балл, псориазе ногтей - 1 балл, индексе массы тела (ИМТ) больше или равном 25 кг/м2 - 1 балл, скорости оседания эритроцитов (СОЭ) больше или равной 7 мм/ч - 1 балл, уровне общего холестерина более 4,2 ммоль/л - 1 балл, уровне цитокина TNFα выше 8,1 пг/мл - 1 балл, выявлении генотипа С-597 IL10 - 1 балл, гепатомегалии по результатам УЗИ - 1 балл. Суммируют полученные баллы, и при сумме баллов равной 5 или более диагностируют псориатический артрит. Способ позволяет достоверно диагностировать псориатический артрит у больных псориазом за счет определения клинико-анамнестических и лабораторно-инструментальных критериев диагностики. 1 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, педиатрии и аллергологии, и может использоваться для прогнозирования степени тяжести атопического дерматита у детей. Сущность способа: в сыворотке крови у ребенка с атопическим дерматитом при поступлении в стационар определяют концентрацию неоптерина, и при концентрации неоптерина от 2,6 нг/мл до 4,0 нг/мл прогнозируют легкую степень тяжести атопического дерматита, при концентрации от 4,1 нг/мл до 5,9 нг/мл прогнозируют среднюю степень, а при концентрации 6,0 нг/мл и выше прогнозируют тяжелую степень тяжести атопического дерматита. Изобретение обеспечивает повышение точности прогноза атопического дерматита у детей. 3 пр.

Изобретение относится медицине, а именно к дерматологии, и может быть использовано для определения субпопуляционного состава клеток кожи. Способ определения субпопуляционного состава клеток кожи и получения цитоиммунограммы кожи включает забор биоптата кожи на глубину 2 мм, гомогенизацию ткани в 0,9%-ном водном растворе хлорида натрия при температуре +23…+25°С, извлечение гомогената, фильтрование гомогената через инертную фильтровальную перегородку с диаметром пор 20 мкм, центрифугирование гомогената при 400 g в течение 5 минут при температуре +23…+25°С. После центрифугирования определяют жизнеспособность клеток кожи, инкубируют в течение 20 минут клетки кожи с моноклональными антителами для проточной цитометрии меченые флюорохромами, проводят фенотипирование клеток кожи, определяют количество клеток кожи определенного фенотипа - цитоиммунограмму кожи: кератиноциты CD49f+, из них активированные CD49f+HLA-DR+; фибробласты (фиброциты) CD45-CD14-CD44+, из них активированные CD45-CD14-CD44+CD80+; тучные клетки CD249+, из них активированные CD249+CD63+; моноциты (макрофаги) CD45+CD14+, из них активированные CD45+CD14+HLA-DR+; внутриэпидермальные макрофаги CD207+, их них активированные CD207+CD80+, CD207+HLA-DR+, CD207+CD80+HLA-DR+; эндотелиальные клетки CD146+, их них активированные CD146+CD34+, CD146+HLA-DR+, CD146+CD54+, CD146+CD54+HLA-DR+; лимфоцитарные популяции: Т-лимфоциты CD45+CD3+, Т-хелперы CD45+CD3+CD4+CD8-, Т-супрессоры CD45+CD3+CD4-CD8+, В-лимфоциты CD45+CD3-CD19+, NK-лимфоциты CD45+CD3-CD16+CD56+. Использование данного способа позволяет составить количественную и функциональную характеристику всех составляющих элементов кожи для использования в диагностике. 1 табл.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкоурологии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития стеноза везикоуретрального анастомоза после радикальной простатэктомии. Для этого проводят гистологическое исследование парапростатических тканей области шейки мочевого пузыря, включающее подсчет клеток воспалительного инфильтрата: лимфоциты, моноциты, плазмоциты в парапростатических тканях области шейки мочевого пузыря. А также определяют площадь распространения фиброза в препаратах, окрашенных азокармином по Гейденгайну. При количестве лимфоидных клеток свыше 30 в поле зрения при объективе 40 и окулярах 10 (×400) и при замещении соединительнотканными волокнами более 2/3 площади препарата в поле зрения прогнозируют высокий риск развития стеноза. Использование данного способа позволяет снизить послеоперационные осложнения путем прогнозирование риска развития стеноза везикоуретрального анастомоза после радикальной простатэктомии и выбора тактики лечения пациента. 2 пр.

Изобретение относится к области медицинской вирусологии и микробиологии и касается штамма вируса Эбола Заир. Представленный штамм вируса Эбола Заир H.sapiens-wt/GIN/2015/Kalidie-Kindia-1022 выделен из крови больного лихорадкой Эбола во время эпидемии в Гвинее 2014-2015 гг. путем 3 последовательных пассажей на мышах-сосунках линии BALB/c и 6 последовательных пассажей на культуре клеток Vero и депонирован в государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под номером V-695. Изобретение позволяет получить антиген - компонент иммуноферментной тест-системы для выявления антител классов G и М к вирусу Эбола с титром не менее 2⋅106 ТЦПД50/мл. 6 табл., 6 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике гастроэнтерологии, может быть использовано для диагностики степени тяжести цирроза печени смешанной этиологии.Способ диагностики степени тяжести цирроза печени смешанной этиологии с помощью анализа крови заключается в том, что у пациентов в сыворотке крови определяют уровень интерлейкина-6, и при значении интерлейкина-6 менее или равном 12,7 пг/мл диагностируют легкую (компенсированную) степень цирроза печени, при концентрации интерлейкина-6 более 12,7 пг/мл и менее или равной 26,2 пг/мл диагностируют умеренную (субкомпенсированную) степень, при уровне интерлейкина-6 более 26,2 пг/мл - тяжелую (декомпенсированную) степень цирроза печени.Технический результат: повышение доступности и простоты выполнения при высокой чувствительности, специфичности и объективности способа. 3 пр., 1 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для определения цитотоксической активности NK-клеток в отношении клеток трофобласта. Способ включает выделение фракции мононуклеарных клеток, содержащих NK-клетки, из периферической крови. Проводят инкубацию в культуральной среде мононуклеаров в присутствии клеток-мишеней с последующей оценкой количества погибших клеток путем проточной цитофлуометрии. При этом мононуклеары периферической крови, содержащие NK-клетки, инкубируют в культуральной среде DMEM в течение 4 часов в присутствии клеток трофобласта линии Jeg-3. Часть клеток трофобласта инкубируют в культуральной среде DMEM без мононуклеаров в течение 4 часов. Затем определяют количество нежизнеспособных и жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови, и базовое количество нежизнеспособных и жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без мононуклеаров периферической крови. Определяют цитотоксический эффект NK-клеток в отношении клеток трофобласта по формуле: ЦЭ=(X1/Х2)×100-(Х1баз/Х2баз)×100, где ЦЭ - цитотоксическая активность NK-клеток, X1 - количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови, Х2 - количество жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови, Х1баз. - базовое количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров; Х2баз. - базовое количество жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров. Использование данного способа позволяет получить количественную оценку цитотоксической активности NK-клеток, что дает возможность проводить мониторинг течения беременности. 6 ил., 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к медицине и предназначено для выделения и исследования иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности (ИК-ммЛНП), из сыворотки крови человека. Агрегируют из сыворотки крови человека множественно модифицированные ЛНП в условиях 9,1% ПВП-35000 при комнатной температуре, осаждают центрифугированием, тщательно декантируют. Полученный супернатант инкубируют при 4°С в течение 30 мин. Образовавшиеся агрегаты ИК-ммЛНП осаждают повторным центрифугированием, декантируют, растворяют преципитат в буфере без ПВП и определяют содержание холестерина, триацилглицеринов. Определяют содержание IgG в составе преципитата. Исследуют комплемент-связывающую способность иммунных комплексов, содержащих ммЛНП. Способ может применяться для ранней диагностики субклинического атеросклероза. 1 ил., 5 табл., 3 пр.
Наверх