Способ выделения стероидных веществ из кулбтуралбных жидкостей

 

ОПИСАНИЕ l9I547

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Сова Советских Социалистических

Республик

Зависимое от авт. свидетельства №

Кл. 12о, 25/02

Заявлено 06Х!1.1962 (№ 785792/31-16) с присоединением заявок ¹ 811481/31-16, 854152/31-16, 875600/31-16, 875612/31-16, 875613/31-16

Приоритет

МПК С 07с

УДК 615.45: 54(.92(088.8) Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

Опубликовано 26.1.1967. Бюллетень № 4

Дата опубликования описания 2Х1.1967

Авторы изобретения М. А. Романчук, 3. В. Калинкина, А. С. Тевлина, Л. В. Соколова, 3. А. Ярославцева, Л. Б. Шагалов, О. К. Никифорова, Е, Г. Балашо

H. H. Суворов, E. Б. Тростянская, С. И. Антонова, Ф. Я. Лейбельма

Н. А. Щукина, Т. И, Гринюк, Л, А. Краснова и H. Ф. Ковылкина

Всесоюзный научно-исследовательский химико-фармацевтический институт им. Серго Орджоникидзе

Заявитель

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ СТЕРОИДНЫХ ВЕЩЕСТВ

ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ЖИДКОСТЕЙ.

Изобретение касается способов выделения стероидных веществ из культуральных жидкостей.

Известные способы выделения стероидных веществ из культуральных жидкостей, основанные, как правило, на использовании многократной экстракции органическими растворителями (хлористый метилен, хлороформ, дихлорэтан, этилацетат) с последующим упариванием и перекристаллизацией, весьма сложны и не позволяют получать стероиды достаточно высокого качества с удовлетворительным выходом.

Сущность настоящего изобретения заключается в том, что исходную культуральную жидкость пропускают через сильно набухающий катионит, например СБС-2 и СБС-3, с последующей десорбцией стероидов органическим растворителем.

Для регенерации катионита обычно используют 10% -ный раствор соляной кислоты.

Пример 1. Преднизолон. В адсорбционную колонку диаметром 97 лм помещают 2300 мл катионита СБС-2 в водородной форме в набухшем виде. Поскольку в исходной культуральной жидкости наряду с растворенным преднизолоном содержится и кристаллический стероид, а также взвесь белковых веществ, ее предварительно пропускают через путч-фильтр, на дно .которого помещают небольшой слой (50 г) катионита СБС-2. Отфильтрованную жидкость (70 л) пропускают через адсорбционную колонку со скоростью

240,тел/мин, фильтрат сливают в дренаж.

5 Десорбцию производят пропусканием 10—

11 л технического водного (82 (о) изопропилового спирта со скоростью 80 ил/нин. Элюат пропускают через нутч-фильтр для растворения кристаллического стероида и десорбци

10 его с катионита. Полученный раствор фильтр)þò через 20 г активированного угля и упаривают в вакууме. После отгопкн спирта водный раствор охлаждают до 0"С, отфильтровывают выпавшие кристаллы и получают 48 г

15 преднизолона с т. пл. 228,5 — 230 - C. Из маточного раствора можно дополнительно получить

9 г продукта. Общий выход 57 г, что составляет 81Я от теоретического количества, считая на исходный гидрокортизон.

20 Пример 2. Л 1,4-а н д р о с т а д и е н д и о и3,17. В адсорбционную колонку диаметром

42 ял помещают 600 нл катионита СБС-2 в натриевой форме в набухшем виде. Культуральную жидкость, отфильтрованную через

25 путч-фильтр, как это было описано в примере

1, пропускают через адсорбционную колонку сверху вниз со скоростью 50 лт.т/лшн, сливая фнльтрат в дренаж. Всего пропускают 11,7 л культуральной жидкости, полученной в про30 цессе микробиологического превращения 12 г

191547

10

65 прогестерона. Десорбцию осуществляют пропусканием технического водного (60% ) изопропилового спирта со скоростью 30 мл/мин.

Элюат пропускают через нутч-фильтр для растворения кристаллического стероида и десорбции его с катионита. Полученный раствор в течение 1 час перемешивают с 5 г активированного угля, фильтруют и упаривают в вакууме. Водный раствор после отгонки спирта охлаждают до 2 С, отфильтровывают выпавший осадок и промывают фильтрат 0,5 л дихлорэтана, в котором затем растворяют полученные кристаллы. Дихлорэтановый раствор дважды промывают (по 200 мл 1%-ным едким натрием и затем водой до нейтральной реакции) и упаривают в вакууме досуха. Остаток растирают с 16 мл серного эфира, охлаждают, отфильтровывают выпавшие кристаллы, три раза промывают (по 5 мл) охлажденным серным эфиром и сушат в вакууме при 50 С.

Получают 8,48 г Л 1,4-андростадиендиона с т. пл. 138 — 139,5 С. Выход 78,15% от теоретического количества, считая на исходный прогестерон.

Пр имер 3. П р едни зон. Очищенную с помощью центрифуги (20000 об/мин) культуральную жидкость в количестве 11,8 л подкисляют соляной кислотой до рН 3 и пропускают через адсорбционную колонку, описанную в примере 2, со скоростью 60 мл/мин. Десороцию осуществляют техническим водным (60% ) изопропиловым спиртом со скоростью 30 мл/мин. Злюат (3 л) в течение 1 час перемешивают с 5 г активированного угля, фильтруют и отгоняют спирт в вакууме. Выпавшие кристаллы отфильтровывают, тщательно перемешивают с 10 мл охлажденного 40%-ного водного изопропилового спирта, снова отфильтровывают и сушат в вакуум-сушильном шкафу. Получают 2,89 г преднизона, что составляет 72% от теоретического количества, считая на исходный ацетат кортизона, взятый в количестве 4,5 г.

Пример 4. Диана бол. Через адсорбционную колонку, заполненную 600 мл катионита СБС-2 в Н-форме, сверху вниз со скоростью 100 мл/мин пропускают 14,64 л культуральной жидкости, полученной в процессе ферментационного дегидрирования 3 г метилтестостерона. Десорбцию осуществляют снизу вверх пропусканием 70%-ного водного изопропилового спирта со скоростью 30 мл/мин.

Элюат (2 л) на холоду обрабатывают 5 г активированного угля и упаривают в вакууме до появления кристаллов. После охлаждения осадок дианабола отфильтровывают, а маточный раствор упаривают в вакууме при температуре не выше 50 С до объема 180 — 200 мл. После охлаждения вновь отфильтровывают кристаллы стероида, а фильтрат дважды промывают (по 100 мл) горячим четыреххлористым углеродом, в котором затем растворяют полу. ченный из маточного раствора осадок. К раст25

60 вору добавляют 0,5 г активированного угля, кипятят 15 мин, отфильтровывают уголь и промывают его горячим растворителем. Раствор упаривают до объема 20 мл и оставляют при комнатной температуре на сутки, Выпавший дианабол отфильтровывают, промывают охлажденным четыреххлористым углеродом и сушат в вакуум-сушильном шкафу при 50 С.

Получают 2,48 г (83,5% от теоретического количества, считая на исходный метилтестостерон) дианабола с т. пл. 163 †164.

Пример 5. Вещество ЗПИ-F, 11 л культуральной жидкости, содержащей 0,042% вещества ЭПИ-F и имеющей рН 5,34, пропускают через 4 колонки, в каждую из которых загружено по 15 г катионита СБС-3 в Н-форме, со скоростью 1,4 мл/мин на 1 cJB2. Десорбцию осуществляют пропусканием 770 мл водного (82%) изопропилового спирта с той же скоростью. Из полученного элюата отгоняют спирт и получают 3,4 г (92",/ от теоретического количества) вещества ЭПИ-F.

Пример 6. Г и д р о к о р т и з о н. 13 4 г культуральной жидкости, содержащей смесь гидрокортизона и вещества ЭПИ-F, пропускают через колонку с 900 мл смолы СБС-2 со скоростью 3,3 мл/мин на 1 см . Десорбцию осуществляют пропусканием нагретого до

55 С технического водного (76%) изопропилового спирта со скоростью 1,6 мл/мин на 1 см .

Водно-спиртовой элюат (4 л) фильтруют через

10 г активированного угля, который затем промывают горячим изопропиловым спиртом (3 раза по 25 мл). После упаривания в вакууме при 50 С отфильтровывают выпавшие кристаллы, добавляют к фильтрату хлороформ и вновь выпавшие кристаллы объединяют с основным веществом. Получают 3,88 г смеси гидрокортизона с веществом ЭПИ-F. Эту смесь растворяют при нагревании с обратным холодильником в 150 мл метанола, добавляют активированный уголь, кипятят 20 мин, фильтруют, промывая уголь кипящим метанолом (3 раза по 15 мл) и упаривают в вакууме до

20 мл. После суточной выдержки в холодильнике и дополнительного часового охлаждения в охлаждающей смеси отфильтровывают выпавший осадок через бязь, промывая его охлажденным эфиром (2 раза по 15 мл), и дважды перекристаллизовывают из метанола (30--35 мл) . Перекристаллизованный гидрокортизон промывают охлажденным эфиром (2 раза по 10 — 15 мл) и сушат при 60 — 70 С в сушильном шкафу в течение суток. Получают

1,97 г стероида. Из маточных растворов дополнительно выделяют еще 0,63 г гидрокортизона, таким образом общий выход составляет

2,6 г.

Предмет изобретения

Способ выделения стероидных веществ из культуральных жидкостей, отличающийся тем, 191547

Составитель В, А. Таратута

Техред Л. Вриккер Корректоры: Е. Ф. Полионова и Г. И. Плешакова

Редактор П. Л. Вербова

Заказ !483 б Тираж 535 Подписное

ЦНИИПИ Комитета ис делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, Центр, пр, Серова, д. 4

Типографии, пр. Сапунова, 2 что, с целью упрощения процесса, увеличения выхода и повышения качества целевых продуктов, культуральцую жидкость пропускают через сильно набухающий катионит, например

СБС-2 и СБС-3, с последующей десорбцней стероидов органическим растворителем.