Молекулярно-генетический способ определения чувствительности опухоли у пациентов с раком легкого к терапии гефитинибом

Авторы патента:


Молекулярно-генетический способ определения чувствительности опухоли у пациентов с раком легкого к терапии гефитинибом
Молекулярно-генетический способ определения чувствительности опухоли у пациентов с раком легкого к терапии гефитинибом

 


Владельцы патента RU 2454464:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт онкологии имени Н.Н. Петрова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (RU)
Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научный центр "Научно-исследовательский институт органических полупродуктов и красителей" (ФГУП "ГНЦ "НИОПИК") (RU)

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной онкологии, и может быть использовано для молекулярно-генетической диагностики чувствительности опухоли у пациентов с раком легкого на терапию гефитинибом. Способ включает определение в 19 экзоне гена EGFR путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) при помощи прямого 5'-CTGTCATAGGGACTCTGGAT-3' и обратного 5'-CAGCAAAGCAGAAACTCACAT-3' праймеров с последующим определением длины амплифицированного фрагмента с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. При этом для детекции замены L858R в 21 экзоне гена используют аллель-специфическую ПЦР с использованием 5'-CACCCAGCAGTTTGGCCA-3', 5'-CACCCAGCAGTTTGGCCC-3' и 5'-GCATGAACTACTTGGAGGAC-3' праймеров. При выявлении у пациентов любой из двух типов мутаций в гене EGFR назначают им терапию гефитинибом. Изобретение обеспечивает высокую информативность и надежность определения чувствительности опухоли у пациентов с раком легкого на терапию гефитинибом при простоте и доступности способа. 2 ил.

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной онкологии, молекулярной диагностике.

Предложенный тест направлен на отбор пациентов с высокой чувствительностью опухоли к терапии Ирессой путем детекции наиболее частых мутации EGFR. Обоснованный отбор больных на лечение позволит сократить безрезультатное использование исключительно дорогостоящего препарата (стоимость 1 месяца лечения гефитинибом составляет примерно 100000 рублей).

На сегодняшний день описан ряд способов детекции интрагенных мутаций EGFR. Наиболее часто для поиска генетических нарушений EGFR используется прямое секвенирование 18-21 экзонов гена, позволяющее выявить весь спектр известных мутаций [Tokumo et al. The relationship between epidermal growth factor receptor mutations and clinicopathologic features in non-small cell lung cancers, Clin. Cancer Res. 2005 Feb 1; 11(3): 1167-73]. Данный метод имеет несколько существенных недостатков, препятствующих его широкому использованию в клинической практике. Во-первых, это относительно низкая чувствительность, обусловленная частой контаминацией опухолевых образцов нормальной тканью, не содержащей мутаций. Для обнаружения мутации при помощи секвенирования необходимо, чтобы образец содержал не менее 30% мутантной ДНК [Bosari et al. Detection of p53 mutations by single-strand conformation polymorphisms (SSCP) gel electrophoresis. A comparative study of radioactive and nonradioactive silver-stained SSCP analysis. Diagn Mol Pathol. 1995 Dec; 4(4): 249-55]. Во-вторых, данная методика достаточно дорогостоящая и трудоемкая.

Другой подход к выявлению генетических дефектов EGFR заключается в использовании разнообразных модификаций полимеразной цепной реакции (ПЦР): ПЦР с применением олигонуклеотидов с модифицированными основаниями (PNA-LNA PCR clamp) [Nagai et al. Genetic heterogeneity of the epidermal growth factor receptor in non-small cell lung cancer cell lines revealed by a rapid and sensitive detection system, the peptide nucleic acid-locked nucleic acid PCR clamp. Cancer Res. 2005 Aug 15; 65(16): 7276-82], TaqMan-зондов [Suzuki et al. Expression and mutation statuses of epidermal growth factor receptor in thymic epithelial tumors. Jpn J Clin Oncol. 2006 Jun; 36(6): 351-6], Scorpion-праймеров [Kimura et al. Detection of epidermal growth factor receptor mutations in serum as a predictor of the response to gefitinib in patients with non-small-cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2006 Jul 1; 12(13): 3915-21], ПЦР с обогащением мутантного варианта ДНК (mutant-enriched PCR) [Asano et al. Detection of EGFR gene mutation in lung cancer by mutant-enriched polymerase chain reaction assay. Clin Cancer Res. 2006 Jan 1; 12(1): 43-8] и др. Эта группа методов нацелена на поиск отдельных, наиболее часто встречающихся повреждений EGFR. Указанные методики обладают более высокой чувствительностью, но требуют использования комбинаций дорогих флюоресцентно-меченых олигонуклеотидов или дополнительных процедур анализа (рестрикционный анализ при mutant-enriched PCR).

Еще один вариант детекции мутаций EGFR - плавление ДНК с высоким разрешением (high resolution melting) [Heideman et al. A panel of high resolution melting (HRM) technology-based assays with direct sequencing possibility for effective mutation screening of EGFR and K-ras genes. Cell Oncol. 2009; 31(5): 329-33] - характеризуется высокой чувствительностью, но не может быть рекомендовано для рутинного использования ввиду высокой стоимости и небольшого распространения в нашей стране аппаратуры для проведения анализа.

Также, среди методов, основанных на ПЦР, необходимо отметить метод, описанный Pan et al., 2005 [Pan et al. Rapid polymerase chain reaction-based detection of epidermal growth factor receptor gene mutations in lung adenocarcinomas. J Mol Diagn. 2005 Aug; 7(3): 396-403]. Метод Pan позволяет обнаружить весь спектр делеций в 19 экзоне, но для детекции замены L858R предлагается дополнительно использовать этап рестрикционного анализа.

В качестве прототипа среди известных аналогов изобретения предлагается наиболее близкий способ выявления в образце опухоли наиболее частой делеций в 19 экзоне EGFR (delE746-A750) и миссенс-мутации L858R в 21 экзоне, описанный в работе OHNISHI H. et al. A simple and sensitive method for detecting major mutations within the tyrosine kinase domain of the epidermal growth factor receptor gene in non-small-cell lung carcinoma. Diagn Mol Pathol. 2006 Jun; 15(2): 101-8. Заявленный способ отличается от известного тем, что для определения делеций в 19 экзоне используют ПЦР с последующим определением длины амплифицированного фрагмента с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, а для детекции замены L858R в 21 экзоне гена используют аллель-специфичную ПЦР. При выявлении у больного любой из двух типов мутаций в гене EGFR назначают терапию гефитинибом.

Техническим результатом заявленного изобретения является повышение информативности и надежности детекции мутаций в гене EGFR у больных раком легкого, что позволяет определить чувствительность опухоли к терапии гефитинибом.

Изобретение направлено на отбор пациентов с раком легкого на терапию гефитинибом. Указанная цель достигается путем тестирования двух типов нарушений: всех возможных делеций в 19 экзоне и замены L858R в 21 экзоне EGFR. Эти мутации составляют 80-90% всех встречающихся при раке легкого повреждений EGFR. Детекция делеций в 19 экзоне осуществляется при помощи ПЦР с последующим разделением продуктов амплификации в полиакриламидном геле, а обнаружение варианта L858R-методом аллель-специфической ПЦР. Благодаря небольшому размеру используемых ПЦР-фрагментов предлагаемый тест может быть эффективно использован для определения статуса EGFR в архивных патоморфологических образцах опухолевой ткани.

Изобретательский уровень предлагаемого диагностического теста подтверждается, во-первых, спектром детектируемых повреждений EGFR, и, во-вторых, использованием сочетания двух недорогих и простых ПЦР-методик для выявления мутаций.

Описание изобретения

Тестирование рекомендовано всем пациентам с аденокарциномой легкого, а также может быть использовано у больных с другими гистологическими вариантами опухолей легкого.

Детекция делеций в 19 экзоне EGFR осуществляется путем ПЦР-амплификации всей последовательности экзона при помощи прямого 5'-CTGTCATAGGGACTCTGGAT-3' и обратного 5'-CAGCAAAGCAGAAACTCACAT-3' праймеров с последующим электрофоретическим разделением продуктов ПЦР. Реакционная смесь состоит из 1 мкл раствора ДНК (10-100 нг ДНК) и 9 мкл смеси для ПЦР. Смесь для ПЦР содержит 1-кратный ПЦР-буфер, 2.5 мМ MgCb, 200 мкМ дЦТФ, 200 мкМ дТТФ, 200 мкМ дГТФ, 200 мкМ дАТФ, 1 мкМ каждого праймера (конечная концентрация - 0.1 ОЕ/л или 0.5 пмоль/мкл) и 0,5 ед. "hot-start" ДНК-полимеразы. ПЦР-реакция начинается с 10-минутной активации ДНК-полимеразы при 95°С; для накопления ПЦР-продукта проводится 45 циклов амплификации (денатурация: 15 сек при 95°C; отжиг: 30 сек при 57°С; синтез: 30 сек при 72°С). Каждый сет амплификации должен включать контрольный образец с делецией, а также негативный контроль. Полученный продукт разделяют методом электрофореза в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) в вертикальной камере. Аллелю дикого типа соответствует фрагмент 127 п.о., а в случае делении наблюдается дополнительный фрагмент меньшего размера (размер дополнительного фрагмента определяется типом делеции). На рисунке 1 приведены примеры детекции делеции EGFR.

Тестирование миссенс-мутации EGFR L858R в 21 экзоне проводится методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени с использованием следующих праймеров: 5'-CACCCAGCAGTTTGGCCA-3' (праймер, специфичный для последовательности дикого типа), 5'-CACCCAGCAGTTTGGCCC-3' (праймер, специфичный для последовательности с мутацией), и 5'-GCATGAACTACTTGGAGGAC-3' (общий праймер) (размер ПЦР-продукта - 120 п.о.). ПЦР в режиме реального времени ("real-time PCR") проводится на оборудовании iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules) и состоит из 50 циклов амплификации (денатурация: 15 сек при 95°С; отжиг: 30 сек при 63°С; синтез: 30 сек при 72°С). Смесь для ПЦР (суммарный объем 20 мкл) содержит 1 мкл раствора ДНК (10-100 нг ДНК), 1,0 ед. ДНК-полимеразы, 1-кратный ПЦР-буфер (pH 8.3), 2.5 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого из нуклеотидтрифосфатов, 0,3 мкМ каждого праймера, SYBR green I в концентрации 0,2х (исходный раствор 10 000х; Molecular Probes). Каждый сет амплификации должен включать контрольный образец (гетерозигота по исследуемой мутации), а также негативный контроль.

Для контроля специфичности фрагментов используется анализ кривых плавления. На рисунке 2 приведены примеры детекции мутации EGFR L858R.

Детекция замены L858R основана на динамике амплификации фрагментов с олигонуклеотидами, специфичными к нормальному и мутантному аллелям, что находит отражение в определенном значении Ct (Cycle threshold, точка пересечения пороговой линии) кривых амплификации, соответствующих нормальному (wt) и мутантному (mt) аллелям. Генотип исследуемого образца устанавливается по формуле: ΔCt=Ct(mt)-Ct(wt). В случае, если образец гомозиготен по нормальному аллелю, ΔCt составляет 6 циклов и более, в случае гетерозиготы по мутации ΔCt≤l. Промежуточные значения ΔCt свидетельствуют о неоптимальных условиях ПЦР.

Преимуществами предлагаемого теста являются простота в исполнении, доступность, а также высокая информативность и надежность. При помощи двух несложных методик (обычная ПЦР в сочетании с электрофорезом и аллель-специфическая ПЦР) удается детектировать до 90% встречающихся мутаций EGFR. Использование коротких ПЦР-фрагментов позволяет применять данный тест для поиска мутаций в архивных патоморфологических образцах опухолей легкого.

Молекулярно-генетический способ определения чувствительности опухоли у пациентов с раком легкого на терапию гефитинибом, включающий исследование опухолевой ткани, отличающийся тем, что для определения делении в 19 экзоне гена EGFR используют полимеразную цепную реакцию (ПНР) при помощи прямого 5'-CTGTCATAGGGACTCTGGAT-3' и обратного 5'-CAGCAAAGCAGAAACTCACAT-3' праймеров с последующим определением длины амплифицированного фрагмента с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, а для детекции замены L858R в 21 экзоне гена используют аллель-специфическую ПЦР с использованием 5'-CACCCAGCAGTTTGGCCA-3', 5'-CACCCAGCAGTTTGGCCC-3' и 5'-GCATGAACTACTTGGAGGAC-3' праймеров, и при выявлении у пациентов любой из двух типов мутаций в гене EGFR назначают им терапию гефитинибом.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, онкологии и гематологии и может быть использовано для определения кардиотоксических осложнений у больных хроническим лимфолейкозом, получающих полихимиотерапию.
Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики увеита при ревматоидном артрите и болезни Бехтерева.
Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и касается способа прогноза перехода острого бактериального конъюнктивита в затяжное или хроническое течение.

Изобретение относится к прикладной биохимии, медицине, ветеринарии и клинической лабораторной диагностике и касается способа определения активности тканевых, бактериальных, вирусных и грибковых протеиназ, расщепляющих иммуноглобулины различных классов.
Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и касается способа прогнозирования клинического течения бактериального конъюнктивита. .
Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, и может быть использовано для прогнозирования осложненного течения у больных внебольничной пневмонией.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу диагностики развития мультиорганной дисфункции в раннем послеоперационном периоде у больных острой абдоминальной хирургической патологией (острым осложненным холециститом, острым деструктивным панкреатитом, острым осложненным аппендицитом, острой обтурационной тонкокишечной непроходимостью).
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано в урологии и нефрологии. .
Изобретение относится к области медицины, в частности к пульмонологии, и может быть применено для оценки течения и степени тяжести муковисцидоза. .

Изобретение относится к области медицины и описывает способ прогнозирования пыльцевой бронхиальной астмы путем иммуногенетического исследования, при этом в венозной крови методом полимеразной цепной реакции определяют гены локусов DRB1 и DQB1 системы HLA и при наличии специфичностей HLA-DRB1*01 и/или DQB1*05 прогнозируют высокий риск развития пыльцевой бронхиальной астмы у больных сезонным аллергическим ринитом; при наличии специфичности HLA-DQB1*06 прогнозируют резистентность к развитию пыльцевой бронхиальной астмы у больных сезонным аллергическим ринитом.
Изобретение относится к медицине, онкологии и гематологии и может быть использовано для определения кардиотоксических осложнений у больных хроническим лимфолейкозом, получающих полихимиотерапию.
Изобретение относится к области медицины, а именно к инфектологии, и касается способа диагностики хронической скрытой хламидийной инфекции в центральной нервной системе (ЦНС).

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике. .
Изобретение относится к области клинической лабораторной диагностики и может быть использовано для прогнозирования перехода облигатного предрака в ранний рак гортани у мужчин.

Изобретение относится к медицине, а именно к лепрологии, и может быть использовано для диагностики лепры. .

Изобретение относится к медицине, в частности, может быть использовано в качестве одного из критериев выявления излеченности больных лепрой. .

Изобретение относится к иммунологии, в частности к методу количественного имму-ноэлектрофореза, и может быть использовано для изучения количественных изменений антигенов.

Изобретение относится к иммунологическим методам исследования и может быть использовано для выявления активации В-системы иммунитета. .

Изобретение относится к области медицины. .
Наверх