Средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота и способ его применения

Группа изобретений относится к ветеринарии и может быть использована для диагностики лейкоза крупного рогатого скота (КРС). Средство для диагностики лейкоза КРС содержит водорастворимую белковую фракцию клеточной линии почки эмбриона свиньи, контаминированной онкорнавирусами С и D и полученной при культивировании в анаэробных условиях, имеющую молекулярную массу от 75 до 82 кД в количестве 0,49-0,52 масс.% и характеризующуюся наличием пиков при длине волны 214 нм в ультрафиолетовой области спектра, и дополнительно содержит фосфатно-солевой буферный раствор. Способ заключается в отборе крови животного, приготовлении взвеси цитратной крови 0,25%-0,5% концентрации, смешивании взвеси со средством для диагностики при соотношении средства к взвеси 1:4-6, выдерживании смеси при температуре 4-8°С в течение 12-15 часов и учете результата реакции по характеру взаимодействия взвеси цитратной крови со средством для диагностики, при этом о наличии лейкоза судят при положительной реакции взвеси цитратной крови со средством. Использование изобретений позволяет расширить спектр диагностических препаратов, сформировать новые подходы к проблеме диагностики лейкоза КРС, быстро и с минимальными затратами проводить диагностику лейкоза КРС при сохранении эффективности диагностических исследований. 2.н.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр., 1ил.

 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к ветеринарной онкологии, и может быть использовано для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Изобретение расширяет арсенал средств заявленного назначения.

Известны средства для диагностики лейкоза крупного рогатого скота и способы диагностики заболевания с использованием этих средств.

В частности, известен набор для серологической диагностики, содержащий антиген вируса лейкоза, разбавитель антигена вируса лейкоза, специфическую преципитирующую сыворотку, солевую смесь агара, разбавитель солевой смеси агара (см. ).

Набор предназначен для постановки реакции иммунодиффузии, которую проводят в геле агара с целью выявления антител против гликопротеидного антигена вируса лейкоза.

Однако, реакция иммунодиффузии (РИД) не позволяет выявить животных-вирусоносителей, титр антител которых недостаточен для их идентификации.

На решение задачи выявления животных-вирусносителей с помощью реакции РИД с использованием данного набора направлен способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота (КРС), заключающийся в использовании инактивированной вакцины против лейкоза КРС, которую вводят трехкратно с интервалом 14 дней в дозе 2 мл (см. патент РФ №2264628 по кл. МПК G01N 33/53, опуб. 20.11.2005). Способ позволяет выявлять животных-вирусоносителей среди серонегативных коров и телок старше пятимесячного возраста. Данный способ заключается в повторном серологическом исследовании в РИД после провокации иммунного ответа путем трехкратного введения инактивированной вакцины.

Однако, любая провокация иммунного ответа приводит к выработке значительного количества антител, что может привести к необратимым изменениям организма животных и в, конечном итоге, их гибели.

Известен также набор для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, предназначенный для проведения иммуноферментного анализа (см. там же: http://www.biok.ru/vet_diagn).

Набор содержит 11 компонентов:

- компонент №1 - полистироловый 96-луночный цельный или стрипованный планшет с иммобилизованным в лунках гликопротеидным антигеном (gp51) BLV;

- компонент №2 - сыворотка крови крупного рогатого скота, содержащая антитела к gp51 BLV (положительный контроль);

- компонент №3 - сыворотка крови крупного рогатого скота, не содержащая антител к gp51 BLV (отрицательный контроль);

- компонент №4 - молоко, содержащее антитела к gp51 BLV (положительный контроль);

- компонент №5 - молоко, не содержащее антител к gp51 BLV (отрицательный контроль);

- компонент №6 - антивидовой конъюгат (моноклональные антитела к IgG крупного рогатого скота, меченные пероксидазой);

- компонент №7 - концентрат (×20) буферного раствора для разведения контрольных и испытуемых проб сывороток крови и конъюгата;

- компонент №8 - концентрат (×20) промывочного буферного раствора;

- компонент №9 - раствор субстрата (Н202);

- компонент №10 - раствор хромогена (ТМБ);

- компонент №11 - стоп-раствор (0,2 Μ раствор серной кислоты).

Набор предназначен для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в сыворотках крови и молоке крупного рогатого скота иммуноферментным методом (ИФА) (см. «Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота». МСХ РФ, Департамент ветеринарии №13-7-2/2130 от 23.08.00).

Известен также способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота с помощью иммуноферментного анализа (см. патент РФ №2425377 по кл. МПК G01N 33/487, опубл. 27.07.2011), заключающийся в предварительной перед проведением ИФА инкубации пробы обезжиренного молока или сыворотки крови, что повышает чувствительность ИФА диагностики до 20%.

Иммуноферментный метод обладает значительными преимуществами перед РИД: более высокой чувствительностью и специфичностью, возможностью автоматизации процесса и сокращения времени анализа.

Однако, набор и метод проведения ИФА с его помощью не позволяет выявлять антитела, которые могут быть нейтрализованы вирусом лейкоза в сыворотке крови и молоке инфицированных животных.

Известны средства и методы диагностики лейкоза КРС путем постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР), которую проводят в случаях, когда серологическими методами животные не выявляются, например, когда инфекция протекает «атипично» - без образования антител.

В частности, известен способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота (см, патент РФ №2445370 по кл. МПК C12Q 1/68, опубл. 20.03.2012), заключающийся в использовании олигонуклеотидных праймеров определенной структуры для выявления фрагмента гена pol повируса лейкоза КРС.

Однако, проведение ПЦР является очень дорогостоящим методом. Более того, эффективность ПЦР составляет от 58,3 до 72,6% (см., например, Двоеглазов Н.Г. Оценка эффективности различных методов диагностики инфекции вируса лейкоза крупного рогатого скота // Материалы диссертации - Новосибирск. - 2009 г, опубликована на сайте otsenka-effektivnosti-razlichnyh-metodov-diagnostiki-infektsii-virusa-leykoza-krupnogo-rogatogo-skota#ixzz3Ap0vf1Rx).

Наиболее близким к заявляемому является средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, содержащее белковую фракцию вируса лейкоза (гликопротеидный антиген gp51), используемое для проведения иммуноферментного анализа (см. ).

Однако, данный белковый компонент используется только в наборе для проведения иммуноферментного анализа. Сам набор многокомпонентен, а способ диагностики с использованием этого набора длителен и трудоемок в реализации.

Изобретение направлено на решение задачи расширения спектра диагностических препаратов и формирования новых подходов к проблеме диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Достигаемый при этом технический результат заключается в создании простого и недорогого средства для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, позволяющего быстро и с минимальными затратами проводить диагностику лейкоза КРС при сохранении эффективности диагностических исследований.

Указанный технический результат в части самого средства достигается тем, что средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, содержащее водорастворимую белковую фракцию, согласно изобретению, в качестве водорастворимой белковой фракции содержит белковую фракцию клеточной линии почки эмбриона свиньи, контаминированной онкорнавирусами С и D и полученной при культивировании в анаэробных условиях, имеющую молекулярную массу от 75 до 82 кД и характеризующуюся наличием пиков при длине волны 214 нм в ультрафиолетовой области спектра, и дополнительно содержит фосфатно-солевой буферный раствор при следующем соотношении компонентов, масс. %:

Водорастворимая белковая фракция клеточной линии
почки эмбриона свиньи СПЭВ,
контаминированной онкорнавирусами С и D,
имеющая молекулярную массу 75-82 кДа 0,49-0,52%
фосфатно-солевой буферный раствор остальное

Указанный технический результат в части способа применения этого средства достигается тем, что способ заключается в отборе крови животного, приготовлении взвеси цитратной крови 0,25%-0,5% концентрации, смешивании взвеси со средством для диагностики при соотношении средства к взвеси 1:4-6, выдерживании смеси при температуре 4-8°С в течение 12-15 часов и учете результата реакции по характеру взаимодействия взвеси цитратной крови со средством для диагностики, при этом о наличии лейкоза судят при положительной реакции взвеси цитратной крови со средством, представляющим собой водорастворимую белковую фракцию клеточной линии почки эмбриона свиньи, контаминированной онкорнавирусами С и D и полученной при культивировании в анаэробных условиях, имеющую молекулярную массу от 75 до 82 кД и характеризующуюся наличием пиков при длине волны 214 нм в ультрафиолетовой области спектра, и фосфатно-солевой буферный раствор при следующем соотношении компонентов, масс. %: белковая фракция - 0,49-0,52 мас. % и фосфатно-солевой буферный раствор - остальное.

Указанные признаки являются существенными и достаточными для получения требуемого технического результата.

В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота на основе водорастворимой белковой фракции клеточной линии почки эмбриона свиньи, контаминированной онкорнавирусами С и D и полученной при культивировании в анаэробных условиях, имеющей молекулярную массу от 75 до 82 кД и характеризующейся наличием пиков при длине волны 214 нм, содержащее дополнительно фосфатно-солевой буферный раствор при определенных соотношениях компонентов.

Также неизвестны способы диагностики лейкоза КРС, основанные на агглютинирующей способности взаимодействия двух компонентов: первого - это диагностикума, выполненного на основе водорастворимого белкового компонента из клеточной линии почки эмбриона свиньи, контаминированной онкорнавирусами С и Д (а не эритроцитарного диагностикума, как это общепринято в постановке реакции агглютинации), а в качестве второго компонента выступает кровь больного животного (взвесь цитратной крови определенной концентрации).

Исследования эффективности существующих методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота (РИД, ИФА и ПЦР) показали, что ни один из этих методов не позволяет полностью выявлять всех животных-вирусоносителей (см., например, http://www.pandia.ru/465284). Эффективность РИД составляет 76,1%, ИФА - 83,3%, ПЦР - от 58,3 до 72,6%. В настоящее время для достижения наилучшего диагностического эффекта исследователями предлагается комбинированное использование серологических и генно-молекулярных методов, что увеличивает время проведения и повышает стоимость диагностических исследований.

Известно использование надосадочной жидкости, полученной при культивировании клеток СПЭВ, для экспресс-диагностики онкологических заболеваний человека (см. патент РФ №2383891 по кл. МПК G01N 33/49, опубл. 10.03.2010).

Однако, применение данного способа, в котором в качестве реагента используют надосадочную жидкость, полученную при культивировании клеток СПЭВ, для диагностики лейкоза крупного рогатого скота не дало никакого эффекта: реакции взаимодействия как отмытых эритроцитов, так и взвеси цитратной крови с надосадочной жидкостью не было.

Надосадочная жидкость является многокомпонентной структурой, в которой присутствуют и липиды, и полисахариды, и белок.

Именно поэтому была поставлена задача выявления такой белковой фракции, которая взаимодействовала бы (вступала в реакцию агглютинации) с кровью больного животного (эритроцитами - отмытыми и неотмытыми).

В ходе исследований были получены результаты взаимодействия 0,49%-0,52% фосфатно-солевого буферного раствора белковой фракции с молекулярной массой 75-82 кДа, выделенной из надосадочной жидкости клеточной линии СПЭВ, контаминированной онкорнавирусами С и Д, только с неотмытыми эритроцитами (т.е. со взвесью цитратной крови, причем определенной концентрации). При этом полученные результаты совпадали с результатами исследований крови одних и тех-же животных в РИД, ИФА и ПЦР.

Таким образом, авторами найден новый подход к диагностике лейкоза КРС путем использования реакции взаимодействия взвеси цитратной крови (неотмытых эритроцитов) инфицированных животных с белковой фракцией из клеточной линии СПЭВ при постановке диагноза.

Т.е. наряду с существующими методами диагностики лейкоза КРС (проведением серологических и генно-молекулярных исследований) авторами предложен новый подход к решению проблемы диагностики лейкоза КРС - определение инфицированности животных вирусом лейкоза по агглютинирующей способности эритроцитов цитратной крови с белковым компонентом определенной молекулярной массы, выделенным из надосадочной жидкости клеточной линии СПЭВ, контаминированной онкорнавирусами С и Д.

Сказанное позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию «изобретательский уровень».

Изобретение иллюстрируется рис. 1, на котором представлен результат жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC).

Средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота готовят следующим образом.

Культуру клеток СПЭВ, контаминированную онкорнавирусами С и Д, засевают на ростовую питательную среду и осуществляют культивирование при 37°С в течение 3-4 суток до формирования монослоя.

Затем ростовую среду сливают и добавляют раствор Версена с трипсином, который через 3-5 минут сливают и добавляют снова ростовую питательную среду.

Осуществляют подсчет дезинтегрированных клеток и доводят количество клеток в 1 мл среды до 100-120 тысяч.

Эту суспензию клеток помещают в стерильные пробирки и создают анаэробные условия (соотношение питательной среды к воздушной фазе 1:5).

Пробирки помещают в термостат и осуществляют культивирование также при 37°С в течение 3-4 суток до формирования монослоя в этих пробирках.

Ростовую среду сливают и добавляют в каждую пробирку поддерживающую среду.

Помещают пробирки в термостат при 37°С. Через 16-18 часов их просматривают и отбирают те пробирки, в которых произошло разрушение монослоя.

Пробирки с разрушенным монослоем однократно замораживают и оттаивают, а остальные пробирки выбраковывают. В результате получают суспензию из оттаявших разрушенных клеток СПЭВ, контаминированных онкорнавирусами С и Д.

Для исключения артефактов по неспецифическому разрушению монослоя клеток и накопления большего объема суспензии для получения диагностического средства полученную суспензию из оттаявших разрушенных клеток СПЭВ вносят в следующую партию пробирок с монослоем и поддерживающей средой, выращенных в аналогично описанных выше условиях, из расчета 20% суспензии и 80% поддерживающей среды с монослоем.

Через сутки пробирки с разрушенным монослоем клеток отбирают. Процедуру повторяют несколько раз до появления 90% количества разрушенных клеток в одной партии пробирок.

Суспензию клеток с разрушенным монослоем замораживают и оттаивают 2-3 раза, центрифугируют в течение 30 минут со скоростью 3000 об/мин и отбирают надосадочную жидкость.

Затем надосадочную жидкость осаждают солевым раствором (например, сульфатом аммония) в количестве 60% от насыщения, центрифугируют при 4500 об/мин в течение 20 мин. Надосадок удаляют, а осадок перерастворяют в минимальном объеме 0,01 Μ фосфатно-солевого буферного раствора при pН 7,4. Диализуют при помощи диализной мембраны с диаметром пор 3500 Да в 0,01М растворе фосфатно-солевого буфера при рН 7,4 в течение 24 часов. После чего определяют концентрацию белка общепринятыми методами.

Для определения молекулярной массы полученного белка проводили жидкостную хроматографию высокого давления (HPLC), в частности, на жидкостном хроматографе «Стайер», с использованием спектрофотометрического детектора А214 (длина волны 214 нм). Для разделения использовали колонку BioSep-SEC-S 2000 5 мкм 145А, 300×7,8 мм. В качестве элюента применяли 0,01М фосфатно-солевой буфер, скорость потока составляла 1 мл в минуту.

В качестве стандартов использовали бычий сывороточный альбумин с молекулярной массой 64-70 кДа, лактоферрин с молекулярной массой 75-80 кДа и папаин с молекулярной массой 20 кДа.

Пример приготовления средства для диагностики лейкоза КРС - №1.

Берут культуру клеток СПЭВ, контаминированную онкорнавирусами С и Д, в концентрации 100-120 тысяч клеток в 1 мл ростовой питательной среды, засевают культуру на матрасики объемом 50 мл на ростовую питательную среду Игла с добавлением 10% аллогенной сыворотки в количестве 10 мл и осуществляют культивирование при 37°С в течение 3-4 суток до формирования монослоя.

Затем ростовую среду сливают и добавляют раствор Версена с трипсином в соотношении 1:1 в количестве 3-5 мл, которую через 3-5 минут сливают и снова добавляют ростовую питательную среду Игла с 10% аллогенной сывороткой.

Матрасики встряхивают для снятия монослоя, осуществляют подсчет дезинтегрированных клеток и доводят (путем добавления той же ростовой среды) количество клеток в 1 мл среды до концентрации 100-120 тысяч клеток в 1 мл среды.

Эту суспензию клеток в количестве 1 мл помещают в 10 стерильных пробирок Флоринского объемом 5 мл по 1 мл в каждую и создают анаэробные условия (соотношение суспензии к воздушной фазе 1:5).

Пробирки помещают в термостат и осуществляют культивирование также при 37°С в течение 3-4 суток до формирования монослоя.

Ростовую среду сливают и добавляют в каждую пробирку по 1 мл поддерживающей среды Игла. Помещают пробирки в термостат при 37°С, через 16-18 часов их просматривают и отбирают те пробирки, в которых произошло разрушение монослоя - 2 пробирки. Остальные 8 пробирок выбраковывают.

Отобранные 2 пробирки с разрушенным монослоем однократно замораживают и оттаивают, в результате чего получают суспензию из оттаявших разрушенных клеток СПЭВ, контаминированных онкорнавирусами С и Д, в количестве 2 мл.

Полученную суспензию из оттаявших разрушенных клеток СПЭВ вносят в следующую партию из 10 пробирок с монослоем и поддерживающей средой, выращенных в аналогично описанных выше условиях, из расчета 0,2 мл суспензии и 0,8 мл среды.

Через 16-18 часов пробирки с разрушенным монослоем клеток снова отбирают. Процедуру накопления большего объема суспензии повторяют несколько раз до появления 90% количества разрушенных клеток в одной партии пробирок.

Окончательно берут 120 пробирок, в каждую из которых вносят по 0,2 мл суспензии и 0,8 мл среды с монослоем. В итоге получают 100 мл суспензии.

Суспензию клеток с разрушенным монослоем замораживают и оттаивают 2-3 раза, затем центрифугируют в течение 30 минут со скоростью 3000 об/мин и отбирают надосадочную жидкость.

Берут 100 мл надосадочной жидкости, добавляют 42 г сульфата аммония для осаждения белка, центрифугируют при 4500 об/мин в течение 20 мин. Надосадок удаляют, а осадок перерастворяют в 1 мл 0,01 Μ раствора фосфатно-солевого буфера при pН 7,4. Диализуют при помощи диализной мембраны с диаметром пор 3500 Да в 0,01 Μ растворе фосфатно-солевого буфера при рН 7,4 в течение 24 часов, после чего определяют концентрацию белка методом Лоури на биохимическом анализаторе StatFax 3300. Она составляла 5 мг/мл.

Для обоснования граничных значений концентрации белка был проведен ряд экспериментов, аналогично описанному в примере 1. Во всех случаях концентрация белка была в пределах от 4,9 мг/мл до 5,2 мг/мл.

Результаты HPLC - хроматографии показали (см. рис. 1), что основные белки (пики 1 и 2) имели молекулярную массу от 75 до 82 кДа и составляли 93% от всей массы входящих в надосадочную жидкость белков.

В таблице 1 представлен результат жидкостной хроматографии.

Способ применения средства осуществляется следующим образом.

В пробирки со стабилизатором (лимонно-кислым натрием или гепарином) отбирают 2-5 мл крови от одного животного.

Из цитратной крови готовят 0,25%-0,5% взвеси на физиологическом растворе.

Постановку реакции осуществляют на специальных планшетах с лунками. Ряды лунок заполняют 0,25%-0,5% взвесями цитратной крови. Одни из рядов лунок с разными концентрациями взвесей цитратной крови заполняют физраствором в каждой лунке (контроль), а в другие ряды с теми же разными концентрациями взвесей добавляют средство для диагностики лейкоза КРС, полученное по примеру 1 данного изобретения, в том же количестве, как и физраствора.

При этом соотношение средства к взвеси (а также физраствора к взвеси) выбирают из условия: одна часть средства и четыре-шесть частей взвеси.

Выдерживают эти смеси при температуре 4-8°С в течение 12-15 часов, после чего производят учет реакции.

За положительный результат реакции принимают наличие осадка в виде зонтика с неровными краями по всей поверхности лунки.

За отрицательный результат реакции принимают наличие осадка в виде пуговки или точки на дне лунки.

Концентрация взвеси цитратной крови (0,25-0,5%), соотношение вводимого средства к цитратной крови (1:4-6), а также температурный режим (4-8°С), при котором выдерживают смесь в течение 12-15 часов, были подобраны экспериментальным путем.

Так, при концентрации ниже 0,25% и количестве средства для диагностики менее одной части реакция с цитратной кровью практически отсутствовала, а при концентрации выше 0,5% и количестве средства более одной части реакции были не выражены, трудно учитывались.

Температурный режим, при котором происходило взаимодействие средства со взвесями цитратной крови, подбирался также экспериментально. Было апробировано 3 режима: при комнатной температуре (22°С), при 37°С и 4-8°С. При комнатной температуре и при 37°С реакции были плохо выражены, трудно учитывались.

Пример осуществления способа - №2

В пробирки со стабилизатором (лимонно-кислым натрием или гепарином) отбирают 2-5 мл крови от одного животного.

Из цитратной крови готовят 0,25%-0,5% взвесь на физиологическом растворе. Ставят реакцию на планшетах с лунками.

Ряды лунок заполняют 0,25%-0,5% взвесями цитратной крови, которые берут в количестве 0,5 мл в каждой лунке: ряд лунок заполняют взвесью 0,25% концентрации, другой - 0,5% концентрации и т.д.

Одни из рядов лунок с разными концентрациями взвесей цитратной крови заполняют физраствором в количестве по 0,1 мл в каждой лунке (контроль), а в другие ряды с теми же концентрациями взвесей добавляют средство для диагностики лейкоза КРС, полученное по примеру 1 данного изобретения, также в количестве 0,1 мл.

Соотношение средства к взвеси в данном примере составляет 1:5.

Выдерживают все смеси при температуре 4-8°С в течение 12-15 часов, после чего производят учет реакции.

Результат реакции - положительный (наблюдалось наличие осадка в виде зонтика по всей поверхности лунки).

Аналогично описанному в примере 2 было исследовано еще 50 проб крови животных, из них 32 пробы были положительными, а 18 - отрицательными.

Дополнительно был проведен эксперимент, аналогично описанному в примере 2, но с отмытыми эритроцитами, приготовленными общепринятым методом из цитратной крови животных. Способ проводился при тех же концентрациях и режимах как в примере 2.

Было исследовано также 50 проб. Положительных результатов при использовании отмытых эритроцитов получено не было. Все результаты были отрицательными и не совпадали с общеизвестными методами.

Была произведена сравнительная оценка эффективности заявляемого способа диагностики лейкоза крупного рогатого скота и тестов РИД, ИФА, ПЦР при диагностике лейкоза крупного рогатого скота.

Исследования проводились в одном из неблагополучных хозяйств на коровах 3-летнего возраста. В эксперимент были отобраны 10 коров, инфицированных вирусом лейкоза КРС, которые одновременно реагировали положительно в РИД, ИФА и ПЦР, и 10 голов животных, не реагирующих одновременно ни в одной из указанных реакций.

Все исследования были выполнены в двукратной повторности с целью подтверждения совпадения результатов исследования и выявления возможных ошибок. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 следует, что заявляемый способ позволяет эффективно выявлять инфицированных животных и совпадает с результатами всех общепринятых методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота, что доказывает специфичность заявляемого средства.

Таким образом, заявляемое изобретение решает задачу расширения спектра диагностических препаратов в отношении лейкоза крупного рогатого скота. Средство позволяет быстро и с минимальными затратами проводить диагностику лейкоза КРС при сохранении эффективности диагностических исследований.

1. Средство для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, содержащее водорастворимую белковую фракцию, характеризующееся тем, что в качестве водорастворимой белковой фракции оно содержит белковую фракцию клеточной линии почки эмбриона свиньи, контаминированной онкорнавирусами С и D и полученной при культивировании в анаэробных условиях, имеющую молекулярную массу от 75 до 82 кД и характеризующуюся наличием пиков при длине волны 214 нм в ультрафиолетовой области спектра, и дополнительно содержащее фосфатно-солевой буферный раствор при следующем соотношении компонентов, масс. %:

Белковая фракция клеточной линии
почки эмбриона свиньи СПЭВ,
контаминированной онкорнавирусами С и D,
имеющая молекулярную массу 75-82 кДа 0,49-0,52%
Фосфатно-солевой буферный раствор остальное

2. Способ применения средства для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, включающий отбор крови, приготовление 0,25-0,5% взвеси цитратной крови, смешивание взвеси со средством при соотношении средства к взвеси 1:4-6, выдерживание смеси взвеси цитратной крови со средством при температуре 4-8°С в течение 12-15 часов и учет результатов реакции по характеру взаимодействия смеси взвеси цитратной крови со средством, при этом о наличии лейкоза судят при положительной реакции взвеси цитратной крови со средством, включающим в себя водорастворимую белковую фракцию клеточной линии почки эмбриона свиньи, контаминированной онкорнавирусами С и D и полученной при культивировании в анаэробных условиях, имеющую молекулярную массу от 75 до 82 кД и характеризующуюся наличием пиков при длине волны 214 нм в ультрафиолетовой области спектра, и дополнительно фосфатно-солевой буферный раствор при следующем соотношении компонентов, масс. %:

Водорастворимая белковая фракция клеточной линии
почки эмбриона свиньи СПЭВ,
контаминированной онкорнавирусами С и D,
имеющая молекулярную массу 75-82 кДа 0,49-0,52%
Фосфатно-солевой буферный раствор остальное



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине и описывает способ оценки хирургического риска у больных с атеросклеротической окклюзией бедренно-подколенно-берцового сегмента в стадии критической ишемии, включающий балльную оценку сопутствующих заболеваний сердечно-сосудистой системы, где каждому фактору риска присваивают определенное количество баллов, присвоение баллов происходит следующим образом: возраст более 70 лет - 1 балл, острое нарушение мозгового кровообращения или транзиторная ишемическая атака в анамнезе - 2 балла, постинфарктный кардиосклероз - 1 балл, фракция выброса левого желудочка от 46% до 50% - 2 балла, фракция выброса левого желудочка от 41% до 45% - 4 балла, фракция выброса левого желудочка 40% и менее - 6 баллов, ишемическая болезнь сердца: хроническая коронарная недостаточность I функциональный класс - 1 балл, ишемическая болезнь сердца: хроническая коронарная недостаточность II функциональный класс - 2 балла, ишемическая болезнь сердца: хроническая коронарная недостаточность III функциональный класс - 7 баллов, пароксизмальная форма фибрилляции-трепетания предсердий, эктопический ритм, частые (>5 в минуту) наджелудочковые экстрасистолы - 3 балла, постоянная форма фибрилляции-трепетания предсердий - 2 балла, желудочковые экстрасистолы >30 в час - 1 балл, баллы складывают, оценивают уровень хирургического риска данного больного, при сумме баллов 8 и более присваивают высокий хирургический риск, рекомендуют выполнение эндоваскулярной интервениции, при сумме баллов от 0 до 3 присваивают низкий хирургический риск, рекомендуют шунтирующую операцию, в случае суммы баллов от 4 до 7 присваивают средний хирургический риск, возможно использование обоих методов артериальной реконструкции.

Настоящее изобретение относится к отбору проб жидкости, которая находится в эластичном закрытом контейнере, например, в контейнере для сбора мочи или крови. Устройство для отбора жидкости, находящейся в эластичном контейнере (13, 14), содержит первую секцию (20), имеющую базовую поверхность (21), и элемент (22) для перфорирования пленки, выступающий от базовой поверхности (21).

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к набору для детекции спор, происходящих из микобактерий в образце. Набор содержит антитело, которое специфически связывает относящийся к спорам пептид из микобактерий, где относящийся к спорам пептид из микобактерий выбран из группы, состоящей из CotA, CotD, CotT, SpoVK, CotSA, YrbC, SpoVE, Soj, SpoIIIE и SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 24 и 26, где указанное антитело получают иммунизацией человека или организма, не являющегося человеком, указанным относящимся к спорам пептидом.

Изобретение относится к средствам для анализа белков и может найти применение в клинических и биологических лабораториях. Подложка для биочипа в соответствии с настоящим изобретением выполнена из халькогенидного стекла на стеклянной основе и имеет функциональное покрытие из неорганического материала.

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для прогнозирования риска формирования приобретенной устойчивости микобактерий туберкулеза к препаратам группы фторхинолонов в ходе лечения больных туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и позволяет сформировать группу женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья России, с повышенным риском развития изолированного эндометриоза.
Заявленное изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для ранней диагностики болезней органов дыхания у телят. Способ включает отбор проб крови у телят.
Изобретение относится к медицине, а именно к детской гастроэнтерологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики неспецифического язвенного колита и болезни Крона у детей.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу диагностики биполярного аффективного расстройства. Сущность способа состоит в том, что выявляют достоверные различия в спектре распределения белков сыворотки крови без белков альбумина, иммуноглобулина G, иммуноглобулина А, антитрипсина, трансферина и гаплоглобина у больных эндогенным психозом.
Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике бесплодия женщин. Для этого проводят определение цитотоксичности сыворотки женщин к мужским лимфоцитам, включая их совместное культивирование с контрольной мужской и исследуемой женской сывороткой в лунках 96-луночного планшета в присутствии питательной среды RPMI 1640 в СО2-инкубаторе.

Изобретение относится к области медицины. Изобретение представляет способ прогнозирования неразвивающейся беременности путем выявления факторов риска в сыворотке крови с помощью иммуноферментного анализа и дальнейшей обработки полученных результатов методом бинарной логистической регрессии. Изобретение обеспечивает упрощение и повышение чувствительности способа прогнозирования неразвивающейся беременности. 4 табл., 1 ил., 2 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантологии, и может быть использовано для мониторинга состояния пациента после трансплантации органа. Для этого, после трансплантации производят мониторинг редокс потенциала (РП) плазмы крови пациента. При этом ежедневно определяют РП плазмы крови пациента с помощью платинового электрода относительно хлорсеребряного электрода. Платиновый электрод предварительно обрабатывают с помощью катодно-анодного сканирования в растворе неорганического восстановителя в циклическом потенциодинамическом режиме. Проводят ежедневный мониторинг величины РП плазмы крови пациента и выявляют изменения величин РП в одном направлении за сутки или несколько суток. При выявлении изменения РП более 25 мВ за сутки или несколько суток судят о наличии дисфункции трансплантата или высоком риске развития криза отторжения трансплантата. При выявлении изменения величины РП менее 25 мВ судят о нормальном состоянии пациента. Изобретение позволяет осуществить прогноз исходов трансплантации и обеспечить своевременную коррекцию лечения пациентов.1 табл., 4 пр., 3 ил.

Изобретение относится к онкологии и касается способов прогнозирования достижения полных морфологических регрессий (ПМР) у больных операбельным трипл-негативным раком молочной железы. Проводят иммуногистохимическое исследование ткани опухоли. Значение уравнения регрессии Y определяют по формуле: Y=7,0-4,1X1-0,15Х2+1,8Х3-4,8Х4+1,78Х5+0,56Х6, где: X1 - размер первичного опухолевого узла: 1 - менее 30 мм, 2-30 мм и более; Х2 - состояние регионарного лимфатического аппарата: 0 - отсутствие метастатического поражения лимфатических узлов, 1 - поражение до 4 лимфатических узлов, 2 - поражение 4-9 лимфатических узлов, 3 - поражение 10 и более лимфатических узлов; Х3 - схема химиотерапии: 1 - FAC, 2 - САХ, Х4 - уровень экспрессии EGFR1 в биопсийном материале опухолевой ткани: 1 - менее 10%, 2 - 10% и более; Х5 - уровень экспрессии Ki-67 в биопсийном материале опухолевой ткани: 1 - менее 20%, 2 - 20% и более; X6 - уровень экспрессии VEGFR-2 в биопсийном материале опухолевой ткани: 1 - менее 70%, 2 - 70% и более. Значение вероятности достижения ПМР рассчитывают по формуле: Р=eY/(1+eY). При Р<0,5 прогнозируют низкую, а при Р>0,5 высокая вероятность ПМР. Способ прогнозирования позволяет повысить точность и информативность. 6 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к неврологии, и может быть использовано для диагностики тяжести дисциркуляторной энцефалопатии у мужчин. Определяют уровень липопротеинов высокой плотности, коэффициенты коморбидности Cirs и Kaplan-Feistein. Выявляют неврологические синдромы мозжечковой атаксии, определяют тромбиновое время, выявляют наличие вредных привычек и профессиональных вредностей, оценивают расстройства высших мозговых функций, выявляют болевой синдром при поражении пирамидной системы, синдромы поражения пирамидной системы, поражение V-VII пар черепных нервов. Рассчитывают значение дискриминантной функции по определенной формуле. Способ позволяет диагностировать тяжесть дисциркуляторной энцефалопатии у мужчин за счет комплексного анализа наиболее информативных показателей, полученных с помощью построения математической модели. 4 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и пульмонологии. Изобретение позволяет прогнозировать анемический синдром во втором триместре гестации при обострении хронического обструктивного бронхита у женщин с гриппом A(H3N2) в первом триместре беременности. Предлагаемый способ заключается в том, что для прогнозирования анемического синдрома во втором триместре гестации определяют величину титра антител в парных сыворотках крови к вирусу гриппа A(H3N2) (в качестве показателя используют величину титра антител во второй сыворотке) (А), концентрацию 2,3-ДФГ в эритроцитах крови (мкмоль/л) (В) и содержание серомукоида (ед. опт. плот.) (С). С помощью дискриминантного уравнения прогнозируют развитие анемического синдрома во втором триместре беременности: D=+0,007×А+1,435×В+209,281×С, где D - дискриминантная функция с граничным значением, равным +35,31. При D меньше граничного значения дискриминантной функции прогнозируют отсутствие анемического синдрома при обострении хронического обструктивного бронхита у женщин с гриппом Α(Η3Ν2) в первом триместре беременности, а при D, равном или больше граничного значения, прогнозируют развитие анемического синдрома у женщин при обострении хронического обструктивного бронхита у женщин с гриппом Α(Η3Ν2) в первом триместре беременности. 2 пр.
Изобретение относится к медицине и предназначено для диагностики обострения язвенного колита. Проводят исследование иммунного статуса в сыворотке крови, определяют уровень циркулирующих иммунных комплексов и при повышении циркулирующих иммунных комплексов C1q до 60,8 ед./мл и выше уровня циркулирующих иммунных комплексов C3d до 39,0 ед./мл и выше и С-реактивного белка до 10,2 мг/л и выше диагностируют обострение язвенного колита. Способ позволяет повысить точность определения обострения язвенного колита. 2 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики высокодифференцированной эндометриоидной аденокарциномы тела матки. Способ включает исследование экспрессии эзрина и процесса метилирования генов в эндометрии. При повышенной экспрессии эзрина в цитоплазме клеток от 4 до 6 баллов и снижении процесса метилирования генов под воздействием О6-метилгуанил-ДНК метилтрансферазы (MGMT) до уровня не более 2 баллов определяют возможность злокачественного течения патологического процесса и возникновения эндометриоидной аденокарциномы. Использование изобретения позволяет повысить эффективность дифференциальной диагностики и прогнозирования рака эндометрия у пациенток перименопаузального периода. 4 ил., 1 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к микологии и дерматовенерологии, и может быть использовано для диагностики микроспории. Способ включает выделение тотальной нативной ДНК из кожи и волос, специфическую амплификацию фрагмента гена 5.8S рРНК Trichophyton verrucosum с использованием праймеров следующей структуры: 5′ CCACGATAGGGATCAGCGTT 3′, 5′ GAAAGTTTTAACTGATTTTGCTTG 3′. Затем при электрофоретическом обнаружении продукта амплификации размером 231 п.н. определяют наличие возбудителя. Использование изобретения позволяет установить факт инфицированности человека Trichophyton verrucosum при различных клинических формах заболевания, в том числе стертых и атипичных. 2 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к способу прогнозирования рецептивности эндометрия в циклах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Сущность способа состоит в том, что определяют оптическую плотность экспрессии лейкемия ингибирующего фактора (LIF) в поверхностном и железистом эпителии эндометрия в период окна имплантации в цикле, предшествующем проведению экстракорпорального оплодотворения, и дополнительно определяют содержание сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) в цервикальной слизи в день трансвагинальной пункции фолликулов, систолодиастолическое отношение (S/D) и индекс резистентности (IR) спиральных артерий в день введения триггера овуляции, а затем рассчитывают значение регрессионной функции (Z) по формуле. При значении Z>0 прогнозируют, что эндометрий рецептивен, а при Z<0 - эндометрий не рецептивен. Использование заявленного способа позволяет прогнозировать рецептивность эндометрия и наступление беременности в результате цикла ЭКО с высокой степенью точности. 2 пр.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики опухолей головного мозга (ОГМ). Для этого путем электронной феноменологической спектроскопии измеряют оптическую плотность плазмы крови человека в видимой и ультрафиолетовой области спектра. При этом предварительно осуществляют измерение оптической плотности плазмы крови у группы доноров с диагностированной ОГМ и группы доноров, не имеющих такого диагноза. Рассчитывают интегральную силу осцилляторов в видимой (ИСО vis) и ультрафиолетовой (ИСО uv) областях спектра для каждого донора. Проводят построение графика зависимости ИСО vis от ИСО uv для обеих групп доноров и фиксацию результирующих прямых этих зависимостей на обоих графиках. Диагностику осуществляют путем измерения расстояния показателя конкретного больного на графике зависимости ИСО vis от ИСО uv до результирующих прямых доноров с диагнозом ОГМ (d1) и доноров, не имеющих такого диагноза (d2), и при d1<d2 делают вывод о вероятности наличия ОГМ. Изобретение позволяет осуществить первичную диагностику ОГМ у пациентов. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

Группа изобретений относится к ветеринарии и может быть использована для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Средство для диагностики лейкоза КРС содержит водорастворимую белковую фракцию клеточной линии почки эмбриона свиньи, контаминированной онкорнавирусами С и D и полученной при культивировании в анаэробных условиях, имеющую молекулярную массу от 75 до 82 кД в количестве 0,49-0,52 масс. и характеризующуюся наличием пиков при длине волны 214 нм в ультрафиолетовой области спектра, и дополнительно содержит фосфатно-солевой буферный раствор. Способ заключается в отборе крови животного, приготовлении взвеси цитратной крови 0,25-0,5 концентрации, смешивании взвеси со средством для диагностики при соотношении средства к взвеси 1:4-6, выдерживании смеси при температуре 4-8°С в течение 12-15 часов и учете результата реакции по характеру взаимодействия взвеси цитратной крови со средством для диагностики, при этом о наличии лейкоза судят при положительной реакции взвеси цитратной крови со средством. Использование изобретений позволяет расширить спектр диагностических препаратов, сформировать новые подходы к проблеме диагностики лейкоза КРС, быстро и с минимальными затратами проводить диагностику лейкоза КРС при сохранении эффективности диагностических исследований. 2.н.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр., 1ил.

Наверх