Способ определения концентрации жизнеспособных спор бактерий

 

Изобретение относится к микробиологической промьшшенности и может быть использовано для количественного определения жизнеспособных спор микроорганизмов в различных препаратах , в частности энтомопатогенных. Цель изобретения - упрощение способа и сокращение длительности определения . Готовят суспензию спор в дистиллированной воде, гомогенизируют до получения однородной мелкодисперсной суспензии, прогревают при сублетальной температуре 69-75 С, вводят в питательную среду, выдерживают 10-30 мин, отбирают пробу, устанавливают в термостатируемую ячейку полярографа, измеряют скорость поглощения кислорода и рассчитывают концентрацию (Т) жизнеспособных спор микроорганизмов по формуле: T K VjQ j где К - эмпирический коэффициент, характеризующий культуру микроорганизмов , кл-мин/мл м; (Ог скорость поглощения кислорода, м/мин. 1 з.п. . ф-лы, 5.ил., 2 табл. о с (Л со о 00 О5

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ . К А ВТОРСКОМ,Ф СВИД .:ТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3771185/31-13 (22) 11.06.84 (46) 15.04.87. Бюл. ¹ 14 (71) Институт тепло- и массообмена им. А.В. Лыкова и Институт фотобиологии АН БССР (72) Э.Г. Тутова, А.В. Воробей, И.В. Жавнерко, П.С. Куц, Е.А. Черницкий и А.И. Попов .(53) 576.8(088.8) (56) Фихман Б.A. Микробиологическая рефрактометрия, М, 1967, с. 172, 179, 220-223, 240-244. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ

ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ СПОР БАКТЕРИЙ (57) Изобретение относится к микробиологической промьппленности и может быть использовано для количественного определения жизнеспособных сйор микроорганизмов в различных препара(gg 4 С 12 G 1/00, С 12 И 3/00 тах, в частности энтомопатогенных.

Цель изобретения — упрощение способа и сокращение длительности определения. Готовят суспензию спор в дистиллированной воде, гомогенизируют до получения однородной мелкодисперсной суспензии, прогревают при субо летальной температуре 69-75 С, вводят в питательную среду, выдерживают

I0-30 мин, отбирают пробу, устанавливают в термостатнруемую ячейку полярографа, измеряют скорость поглощения кислорода и рассчитывают концентрацию (Т) жизнеспособных спор микроорганизмов по формуле: Т=К.V(> где К вЂ” эмпирический коэффициент, характеризующий культуру микроорганизмов, кл мин/мл м; V(g ) — скорость поглощения кислорода, м/мин. 1 з.п. ф-лы, 5.ил., 2 табл.

1303610

25

Изобретение отн логической промьыл быть использовано го определения жиз микроорганизмов в ратах.

Целью изобретен щение способа и со ности процесса опр

На фиг. I изобр установки для осущ на фиг. 2 — зависи поглощения кислоро держивания после а

70 С в течение 10зависимость скорос лорода спорами от при 60, 70 и 80 С; висимость скорости рода от концентрац изменение силы ток

Способ заключае

Биомассу, в зав центрации спор мик (0,1-1 г сухого ко

10 г пасты, или 10 ной жидкости), сус дистиллированной в

Нижние пределы от чувствительност верхние определяют ности измерений пр поглощения кислоро терных для высокой роорганизмов.

Полученную сусп низируют на микрои лучения однородной суспензии, При исп измельчителя РТ-2 ществляют 1,5-2 ми реактивируют путем сублетальной темпе питательную среду оптимальной для ро

Отбирают пробу, ус мостатируемую ячей рость поглощения к тывают концентраци ных спор микроорга

Т=К V(, где К вЂ” эмпирическ характериз микроорган

V, — скорость п

,о ) рода. сится к микробионности и может я количественно еспособных спор азличных препая является упроращение длительделения. ена блок-схема ствления способа; ость скорости а от времени вытивации их при

0 мин; на фиг. 3и поглощения кисремени активации на фиг. 4 — запоглощения кислои спор; на фиг ° 5во времени. ся в следующем. симости от коноорганизмов в ней центрата или 1100 r культуральендируют в 100 мл ды ° азведений зависят установки, а я снижением точвысоких скоростях а в ячейке, харакконцентрации мик- 35 нзию спор гомогемельчителе до по40 льзовании микроомогенизацию осуЗатем споры прогрева их при атуре, ВВодят В выдерживают при та температуре. анавливают в теру, измеряют скослорода и рассчи(Т) жизнеспособизмов по формуле

1)

Й коэффициент„ щий культуру змов; глощения кислоКоэффициент К определяют экспериментально. Для этого определяют ! титр одного образца Т микробиоло1 гическим способом и скорость поглощения кислорода V(1 данным способом. о,1

Коэффициент К рассчитывают по формуле 1 и

К= —, — у (0,) где n — количество образцов.

Данный способ может быть осуществлен для определения количества жизнеспособных спор различных видов микроорганизмов„

Предлагаемый способ осуществляется на установке,, представленной на фиг.1, Установка состоит из ячейки 1 с мембранными датчиками типа Кларка, полярографа 2, самописца 3, термостата 4 и магнитной мешалки 5.

К рабочему электроду термостатируемой ячейки от полярографа подается напряжение, и после выдерживания

t суспензии реактивированных спор в ячейке в течение 20-30 мин при постоянном перемешивании магнитной мешалкой на самописце регистрируют

I изменение в ячейке силы тока, которое прямо пропорционально изменению концентрации кислорода в образце.

Скорость поглощения кислорода в образце находят по формуле

М Т Тг г (0>) Т Тс Ч Ч1 где (ОД вЂ” концентрация кислорода в дистиллированной воде при услоВиях (температура,, давление) измерения М;

I, I — значения силы тока для контрольных растворов соответственно дистиллированной воды и бескислородного раствора (0,1 г сульфита натрия на. 100 мл воды), мкА;

Т I — значения силы тока для ! Р исследуемого образца соответственно в моменты времени, и . (ОЛ

Величина =A (константа

Ii Тг ячейки) характеризует чувствительность используемых датчиков ячейки к кислороду.

-V — скорость измене"1 ния силы тока в образце в единицу времени, которую находят из полярограммы, т.е, v(q ) 1303610 рабочий режим установки) записывают полярограмму-(рис. 5).

Рассчитывают концентрацию жизнеспособных спор следующим образом.

Находят значение силы тока в моменты времени о =21 мин; I =0,8 мкА;

=25 мин; I2=0,4 мкА;

0,8-0 4

V< z = — — — -О,! мкА/мин;

-4 -4

V,, =2 27 10 0,1=0,227 1О м/мин; где 2,27 10 м/мкА — константа ячейки.

Коэффициент К для спор бактерий .Bacillus thuringiensis 49-8 равен (О, 35 О, 04) ° 1 0 кл ° мин/м мл; Тспор

=0,35 10 2,27. 10 =7,9 10 кл/мль

С учетом сделанных разведений титр сухого концентрата Тс„о в концентрате равен 79,2 10 кл/мг.

Пример 2. Для определения концентрации жизнеспособных спор используют препарат из Bacillus thuringiensis штамм 98, Для этого 1 г концентрата внесли в IOO мл дистиллированной воды. Дальнейшие операции повторили, как в примере 1.

Экспериментально установлено, что коэффициент К для спор Bacillus thurin iensis 11 - 98 равен 1,17+0,08 » х10 кг мин/мл м. э

Из полярограммы контрольных растворов находят

Т в-1с — О, 936 мкА. (0,,1

По формуле А= находят

I ь-lc

С помощью установки, описанной .выше, была исследована зависимость скорости дыхания спор бактерий Bacillus thuringiensis от времени.

Выявленная зависимость скорости поглощения кислорода от времени активации представлена на фиг. 2.

Из представленных данных видно, что через 20 мин для различных образцов, независимо от времени активации, 10 наблюдается постоянная скорость дыхания.

Было исследовано влияние температуры и времени активации спор на скорость поглощения кислорода (фиг. 3). 1S

Установлено, что при активации спор о при 60 С скорость поглощения кислорода достигает максимума через 50 мин нагрева.

Скорость поглощения кислорода при 20 о обработке спор при 70 С в течение

20-50 мин максимальная, при увеличении продолжительности более 50 мин отмечается снижение скорости погло= щения что обусловлено гибелью час- 25

Э о ти спор. Активация же спор при 80 С происходит быстрее, но уже через

lO мин клетки начинают гибнуть.

В связи с полученными данными оптимальными условиями активации спор 30 бактерий Bacillus thuringiensis являются: температура 70 С+1, время 2050 мин.

Было установлено, что максимальная скорость поглощения кислорода 35 спорами пропорциональна конструкции клеток в исследуемом образце (фиг ° 4).

Пример 1. Концентрацию жизнеспособных спор определяют в сухом 4 препарате, полученном культивированием штамма Bacillus thuringiensis

var dendro1imus 49-8 ° Для этого навеску концентрата (0,2 г) разводят в 100 мл дистиллированной воды, го- 45 могенизируют на микроизмельчителе

PT-2 в течение 2 мин. Полученную суспензию прогревают в водяной бане при о

70 С в течение 20 мин, затем охлаждают проточной водой.

В пробирку заливают 5 мл суспензии обработанных спор и 5 hut водной питательной среды, содержащей 0,9Х

NaC1, 0,9Х глюкозы и 0,1347. инозина.

Полученную суспензию помещают в водяную баню и выдерживают 15 мин. Затем отбирают 1,5 мл суспензии, заливают в ячейку полярографа и через

10 мин (минимальное время выхода на 2,05 10

А- 0 936 — 2,19 10 м/мкА;

V; =0,09 мкА/мин (из полярограммы исследуемой суспензии); Ч(, ) =О, 19 1О м/мин

Титр водной суспензии спор

Тс=0,19.10 1,17 "10 =0,22 х10 кл/мл, при пересчете на сухой концентрат с учетом разведений Т„=44 10 кл/мг.

Пример 3. Исследовали споры

Вас. subtilis, выращенные на косяках мясо-пептонного агара. Суспензию спор гомогенизировали и выдерживали в водяной бане при t=75 С в течение

15 мин для активации, затем охлаждали и разводили в отношении 1:1 питательной средой следующего состава:

0,9 г NaC1+0,09 r глюкозы + 0,2 r

1303610 дистиллированной помещали в термос

0 С ячейку поляро"

25 мин и регистрилощения кислорода

Продолжение табл.1

Т 10 кл/мг по

9 способу

Vt0111 х

«10» м/мин

Опыт пред- микробиолагае- логичесмому кому

0,22

77,0 67,5

0,21

74,5

А/мин

72,8

Среднее значе22,9

80,33 74,48 ние ения кислорода в

Средняя квадратичная ошибка

10,11 — +8,01 яции результатов предлагаемым и изв частности микроводили двумя путя" а спор Вас. thuoro образца в семи еляли титр микроедлагаемым спосоТаблица2

5,36

6,38

0,11

6,12

6,95

0,12

Таблица 1

20,47

21,02

15,64

13,72

19,14

19,14

15,08

0,33

Т 10 кл/мг по

9 способу

Опыт V tp q

«10 м/мин

0,33

0,26 микробиологичеспредлагае14,5

0,25 кому мому

50 Данный способ позволяет н 1520 раз ускорить процесс определения концентрации жизнеспособных спор, снижает трудоемкость и исключает субъективность, 55

Формула изобретения

70,2

85,7

0,24

89,1

84,7

0,24

79,4 80,3

0,23

63,5

83 3

0,24

1, Способ определения концентрации жизнеспособных спор бактерий, 78,0

77,7

0,22

L-g-аланина на 10 воды. Затем образе статированную при гр афа, выдерживали ровали скорость по в образце.

Экспериментальн эффициент К для сп равен: K=0,58 0,04

Из полярограмм ров получено I 1--I рограмм исследуемо

"г

10 j =28 турные данные.

Скорость погло образце равна:

2 85 . IО

,Л о,e соответственно ти

7=K 7 0д 0,58 1О х10 кл/мл.

Проверку корр определения титра вестным способами биологическим, пр ми. Для концентра

ringiensis для од повторностях опре биологическим и и бами.

Сравнительные нию концентрации бактерий Bacillus лярографическим и способами предста определенный кор Вас. subtilis

10 кл мин/мл.м.

Ц онтрольных раство- 10

=0 9 мкА. Из полясуспензии:

4 " 15

< 10 м — литера,04=0,12 ° 10 м/мин, 20 р образца равен:

0,12" 10 =7 х

25 анные по определе- 35 знеспособных спор

thuringiensis помикробиологическим лены в табл. 1.

Для спор Bacillus subtilis (три образца в двух повторностях) определяли титр микробиологическим и предлагаемым способами. Результаты экспериментальных данных приведены в табл. 2.

1303610 предусматривающий активацию спор путем выдержки их в питательной среде в течение 15-30 мин и термообработки с последующим определением количества спор расчетным путем, о т л и ч а — 5 ю шийся тем, что, с целью упрощения способа и сокращения длительности процесса определения, перед вьщерживанием спор в среде споры вносят в дистиллированную воду, го- 10 могенизируют, термообработку спор осуществляют при сублетальной температуре в водной суспензии перед внесением в питательную среду, а после выдерживания в среде отбирают сус- 15 пензию спор и измеряют в ней скорость поглощения кислорода, а концентрацию жизнеспособных спор рассчитывают по формуле

1 К (о,) где Т вЂ” концентрация жизнеспособных спор, кл/мг;

К вЂ” эмпирический коэффициент, характеризующий культуру, кл мин/м мл;

V. - скорость поглощения кислоро(Ох! да, м/мин.

2. Способ по п. 1, о т л и ч аю шийся тем, что при определении количества жизнеспособных спор бактерий Bacillus thuringiensis в качестве питательной среды используют среду, содержащую 0,97 хлористого натрия, 0,097 глюкозы, 0,134Х. инозина, остальное — вода, а термообработку осуществляют при 69-71 С в течение 20-50 мин.

Мр

1303610

УИ

Hag

М

МЮ

35 Ф Гмм

Составитель Т. Полянская

Редактор M. Циткина Техред, Л.Олейник Корректор С. Шекмар

Заказ 1278/29 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, .4