Способ получения производных тетрагидроизохинолина
Изобретение касается производных азотогетероциклических соединений , в частности соединений общей формулы I СЮЮУ СН-Ш-С-f-CH -CHi СН-СН- сCHi-N-CtObCRiRj-CRjpik-S-Rs , где Y - низший алкил; R, 4 зависимо друг от друга Н или С,-Cg-алкил; Ry-H, С -С -алконоил, которые как проявляющие противогипертензивную активность могут быть использованы в медицине. Для выявления активно сти у соединений указанного класса бьши получены новые соединения Т, Реакцию ведут из тетрагидроизохинолина и алкилирующей кислоты в присутствии дициклокарбодиимида с последующим гидролизом и выделением целевого со- .единения I с выходом до 91%. Соединения I являются активными ингибиторами ангиотензинпревращения энзима; токсичность LDj.Q 84 мг/кг живой массы. с S (У) 00 о 4 4 00
СО1ОЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК,SU„„
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ
GllHCAHHE ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н IlATEHTY (21) 3282548/23-04 (22) 11.05.81 (31) 148083 (32) 12,05.80 (33) US (46) 15.04,87. Бюл, 14 (71) ЮСВ Фармасьютикал корпорейшн (US) (72) Джон Т, Сах, Бруц Е. Вильямс и Джерри В, Скайлз (US) (53) 547,781,785,07(088,8) (56) Вейганд-Хильгетаг. Методы эксперимента в органической химии, М,:
Химия, 1964, с,445-450. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ
ТЕТРАГИДРОИЗОХИНОЛИНА (57) Изобретение касается производных аэотогетероциклических соединений, в частности соединений общей формулы 1 (ю 4 С 07 D 217/06//А 61 К 31/47 с(оит
CH CH-C--$ -СН вЂ” СН1
1 1 I сК CH- C - — --СН1-н-С101-C11(R CRpg- $-Bg где Y — низший алкил; R< - R< — независимо друг от друга Н или С, -С -алк -Н, С -Сб-amcoHo, которые как проявляющие противогипертензивную активность могут быть использованы в медицине, Для выявления активно" сти у соединений указанного класса были получены HOBbIe coe HHeHH 1. Реакцию ведут иэ тетрагидроизохинолина и алкилирующей кислоты в присутствии дициклокарбодиимида с последующим гидролизом и выделением целевого со,единения I с выходом до 91Х. Соединения I являются активными ингибиторами ангиотензинпревращения энэима; токсичность LD = 84 мг/кг живой массы.
1304748
Изобретение относится к способу получения новых производных тетрагидроиэохинолина, обладающих ценными фармакологическими свойствами, позволяющими их применять в медицине, Цель изобретения — синтез новых соединений, обладающих противогипертензивной активностью и активностью, ингибирующей превращение ангиотензин--1О превращающего энзима, Пример 1, L-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновая кислота.
Суспензию L — фенилаланина G(75 r > 15
0,455 моль) в концентрирова.иной соляной кислоте (488 мл) и 37Х-ный формалин (165 мл) медленно нагревают с обратным холодильником при интенсивном перемешивании в течение 30 мин. По 20 прошествии этого времени добавляют другую порцию 37Х-ного формалина (75 мл) и концентрированной соляной кислоты (165 мл), Перемешивание и нагревание продолжают в течение 4 ч °
Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и образовавшийся твердый осадок отфильтровывают и промывают небольшим количеством метанола; при этом получают гидрохлорид в 3> виде бесцветного твердого вещества (68,9 г, 71X), т,пл. 291-294 С, П p H M e p 2. L-бензилкарбетокси-L-1>2,3>4-тетрагидроиэохинолин- 5
-3-карбоновая кислота °
Гидрохлорид L-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3 — карбоновой кислоты (58,8 г, 0,275 моль) растворяют в
1 N гидроокиси натрия (600 мл) и по- 40 лучающийся раствор охлаждают в ледяной бане. Добавляют по каплям бензил хлороформат (39,0 мл, 0,263 моль) °
После этого добавляют бензил-хлороформат (30 мин) при перемешивании в 45 течение часа при комнатной температуре, а затем добавляют другую порцию N гидроокиси натрия (!00 мл), .Перемешивание продолжают в течение последуюц>их 2-2,5 ч, Реакционную смесь подкисляют до рН 4 концентрированной соляной кислотой и продукт экстрагируют хлороформом, Органическую фазу дважды промывают водой и сушат над сульфатом магния, Восле фильтрования и испарения растворителя получают бесцветное масло (86,3 г, 91,5X), которое можно использовать без дальнейшей очистки.
Пример 3, трет-Бутил N-бензилкарбетокси-L-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин)-.3-карбоксилат, N-бензилкарбетокси-L-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту (46,5 г, 0,150 моль) растворяют в метиленхлориде (1000 мл) и добавляют концентрированную серную кислоту (7 мл). Получающуюся смесь охлаждают в бане с сухим льдом и ацетоном о до -30 С, а затем через раствор в течение 3 ч пробулькивают изобутилен °
Реакционный сосуд закрывают пробкой с клапаном, сбрасывающим давление и хранят в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь осторожно подщелачивают, добавляя по каплям 10Х-ный раствор водного карбоната калия. Органическую фазу отделяют и еще раз промывают 10Х-ным К СО > а затем дважды водой. Органический экстракт высушивают над сульфатом магния. После фильтрования и выпаривания раствора получают светло-желтое масло (45,3 г, 82,4Х), которое можно использовать беэ дальнейшей очистки.
Пример 4. трет-Бутил N (1, 2,3,4-тетрагидроизохинолин)-3-карбоксилат, трет-Бутил N-бенэилкарбетокси-L†(1„2,3,4-тетрагидроизохинолин)-3-карбоксилат (45 г, 0,123 моль) растворяют в абсолютном этаноле (600 мл) и добавляют 10Х Рд/С (4 r) ° Получающуюся смесь гидрогенизируют в мешалке Парра низкого давления под давлением 50 футов на кв, дюйм в течение
16 ч. Катализатор отфильтровывают и растворитель выпаривают с получением неочищенного продукта в виде бледноголубого масла (24,8 г, 86,4Х), который используют без дапьнейшей очистки, У
Пример 5, трет-Бутил N-(3
> аце тил тио-2 -ме тилп ро па но ил) -L- (1, 2, 3, 4-тетрагид роиэ охинолин) -3-карбоксила т. !
К раствору трет-бутила L- (1, 2, 3, 4-тетрагидроизохинолина)-3-карбоксилата (8,1 r> 0,0349 моль) и 3-ацетилтио-2-метилпропионовой кислоты (5,6 г, 0,036 моль) в метиленхлориде (250мл), охлажденному в ледяной бане, добавляют дициклогексилкарбодиимид (7,2 г, 0,0350 моль), Получающуюся смесь перемешивают со внешним охлаждением в течение 30 мин, а затем примерно 3 ч
1304748 при комнатной температуре, Осажденную дициклогексилмочевину отфильтровывают .и промывают небольшим количеством метиленхлорида. При концентри— ровании фильтрата получают неочищенный продукт в виде бледно-желтого масла, который используют без дальнейшей очистки, Пример 6. N-(3 -Ацетилтио)
-2 -метилпропанил)-L-(1,2,3,4-тетра- >0 гидроизохинолин)-3-карбоновая кислота, )
Неочишенный трет-бутил М- (3 -аце— тилтио-2 -метилпропаноил) -L- (1, 2, 3, 4) -тетрагидроизохинолин)-3-карбоксилат (14 r, 0,371 моль) растворяют в смеси анизола (25 мл) и трифторуксус ной кислоты (75 мл). Получающийся раствор перемешивают при комнатной температуре примерно в течение часа, 20
Трифторуксусную кислоту удаляют под вакуумом и остаток распределяют между этилацетатом и насыщенным бикарбонатом натрия. Водную бикарбонатную фазу отделяют и дважды промывают этилацетатом, а затем осторожно под кисляют до рН 2-4 с помощью концентрированной соляной кислоты, Осажденный продукт несколько раз экстрагируют хлороформом и объединенный орга-30 нический экстракт дважды промываю водой и высушивают над сульфатом магния, фильтруют и выпаривают с получением бледно-желтого масла (7,3 r), Этот грубый продукт очищают с помо- 35 щью жидкостной хроматографии высокого давления с использованием смеси и-гексана: этилацетата; уксусной кислоты (30:60:1) в качестве элюанта для получения чистого продукта в виде40 бесцветного масла (5,9 r). Продукт был описан в виде его дициклогексиламиновой соли (ДЦГА), которую получали в эфире в виде бесцветных крисо таллов, т.пл, 161-163 С.
Пример 7, N-(3 -Меркапто-2 -метилпропаноил) -L- (1, 2,3,4-тетрагидроизохинолин)-3-карбоновая кислота.
Безводный аммиак пробулькивают в течение 15 мин через метанол (100 мл) и получающийся насыщенный раствор
) ) добавляют к N-(3 -ацетилтио-2 -метилпропаноил)-L-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3 — карбоновой кислоте (2,0 r 0,00623 моль) и помещают в атмосферу азота, Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение часа. Растворитель удаляют в вакууме и остаток наносят на колонку АС-50 М вЂ” Х2 катионобменной смолы и элюируют метанолом, Метанол выпаривают и остаток растворяют в хлороформе, Хлороформ вымывают водой один раз и высушивают над сульфатом магния, После фильтрования и выпаривания растворителя получают бесцветное масло (1,7 г, 987). Свободную кислоту переводят в ДЦГА соль в простом эфире с получением бесцветных кристаллов, т,пл. 146-147 С, Продукт -описывают в виде его ДЦГА соли.
Пример 8, 2-(3 -Ацетилтио)
-2 -метилпропанолил)-1-фенил-3-карбометокси-1,2,3,4-тетрагидро-P-карболин, 1 — Фенил-3-карбометокси-1,2,3,4-тетрагидро-1)-карболин (10 г, 0,04 моль) и триэтиламин (4,! г, 0,04 моль) растворяют в ацетонитриле (250 мл) и получающуюся смесь охлаждают в ледяной бане, 3-Ацетилтио-2-метилпропионилхлорид (6,5 r, 0,036 моль) добавляют небольшими порциями, После этого добавляют кислый хлорид и убирают ледяную баню; смесь перемешивают при комнатной температуре в атмосфере азота в течение
2,5 ч. Растворитель выпаривают и остаток растворяют в хлороформе. Хлороформ промывают водой, 57.-ным водным раствором NaOH, 5Х-ным водным раствором HCE и водой, Выпаривают хлороформ высушиванием над сульфатом магния, фильтруют и испаряют с попучением неочищенного продукта в виде слегка окрашенного масла, Продукт подвергают дальнейшей очистке хроматографией на силикагеле (CH Cf ) с получением чистого продукта в виде бесцветного масла (9,6 г, 657), Пример 9. 2-(3 -Меркапто)
-2 -метилпропаноил)-1-фенил-3-карбометокси-1,2,3,4-тетрагидро-P-карболин.
) )
2-(3 -Ацетилтио-2 -метилпропаноил)-1 фенил-3-карбометокси-1, 2, 3, 4-тетрагидро-Р-карболин (2 r, 0,0045 моль) растворяют в метаноле (75 мл) и через раствор пробулькивают безводный аммиак в течение 15 мин.
Реакционную смесь помещают в атмосферу азота продолжают перемешивание при комнатной температуре в течение часа. Метанол испаряют и остаток наносят на катион-обменную колонку (ьуе 130474
50 ределена путем измерения количества гиппуровой кислоты, образуемой за данное время. Для этой цели превращатанол) . Метанол испаряют и остаток растворяют в хлороформе, промывают водой, высушивают над сульфатом маг. ния, фильтруют и выпаривают с получением продукта в виде бесцветного масла (1,6 r, 88X).
Пример 10, N (3 -Ацетил7 тио-2 -метилпропаноил)-L-1,2,3,4)
-тетрагидроизохинолин) -3-карбоновая кислота, 10
К перемешанной суспензии L-1,2,3, .4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновой кислоты (40,0 г, 187,2 моль) примерно в литре р-диоксана и воды (200 мл) добавляют триэтиламин (78 Йл, 15
560,8 моль), а затем по каплям добавляют 3-ацетилтио-2-метилпропионилхлорид (33,8 r, 187,2 моль), По мере прохождения реакции смесь становится в основном гомогенной. По прошест-20 вии примерно 3 ч отфильтровывают небольшое количество растворимого материала и фильтрат концентрируют на вращающемся испарителе, Получающийся раствор разбавляют водой и подкисляют до рН 2 концентрированной HCE после чего экстрагируют в этилацетат.
Раствор этилацетата дважды промывают водой, один раз соляным раствором, высушивают над сульфатом магния, 30 фильтруют и испаряют с получением примерно .55 г масла, Неочищенный продукт отделяют методом препаративной хроматографии с элюированием 27;ной уксусной кислоты, 407-ным этилацета- 35 том и 603-ным гексаном с выходом30,2 г (50,2 ) чистого вещества, !
Испытание in vitro на ингибирование ангиотензин-превращающего энзима (АСЕ).
Испытание на ингибирование ангиотензин-превращающего энзима, Введение, Этот тест обеспечивает метод идентификации ингибирования ангиотензин-превращающего энзима (АСЕ),, Активность энзима испытывают в присутствии и отсутствии испштуемого соединения и определяют процентное ингибирование активности энзима, Превращающий энзим катализирует гидролиэ трипептида, гиппурил-гистидил-лейцина (НН1.), Продуктами этой реакции являются гиппуровая кислота о и гистидил-лейцин.
Активность энзима может быть on8 6 ющий энзим инкубируют с HHL в течео ние 10 мин при 37 С. Реакцию энзима останавливают с помощью добавления соляной кислоты, Затем гиппуровую кислоту отделяют с помощью экстракции реакционной смеси этилацетатом, После выпаривания растворителя остаток, содержащий гиппуровую кислоту, растворяют в воде, Концентрацию гиппуровой кислоты определяют спектрофотометрически путем сравнения поглощения раствора при 228 нм с поглощением раствора известной концентрации чистого соединения ° Удельную активность энзима выражают в наномолях образуемой гиппуровой кислоты мин/мг протеина, Тестуемые соединения оценивают по их способности уменьшать удельную активность АСЕ, Препарат сырого ангиотензин-превращающего энзима, Экстракция ацетонового порошка из легкого кролика, Влили 80 мл холодного раствора 0,05 М КН РО, доведенного до рН 8,3 с помощью гидроокиси калия, в мини-контейнер из нержавеющей стали (емкость 100 мл), предварительно охлажденный льдом, Добавили 5,0 г ацетонового порошка из легкого кролика и гомогениэировали смесь в течение одной минуты с использованием смесителя Varing
Blender (установка 4), Контейнер охладили и продержали во льду в течение 2 мин, Повторили гомогенизацию и охлаждающую процедуру более двух раз.
Перенесли гомогенат в 250 мл лабораторный стакан, охлаждаемый льдом, Промыли мини-контейнер.20 мл холодного фосфатного буфера, рН 8,3, и объединили промывочную жидкость с гомогенатом. Перенесли гомогенат в поликарбонатные центрифугационные пробирки (27х103 мм), охлаждаемые льдом. Центрифугировали в течение
40 мин при 40000 g (21500 об/мин)в роторной И .30, предварительно охлажденной до 4 С центрифуге Beckmon
L 3-50, Перенесли верхний слой жид-. кости в 250 мл лабораторный стакан, охлаждаемый льдом, Влили 80 мл охлажденного раствора
0,05 М КН Р04 при рН 8,3 в мини-контейнер из нержавеющей стали, охлаждаемый льдом, Перенесли шарики иэ центрифугационных пробирок в миниконтейнер и повторили процедуру гомо13047
Образец, N, объем раствора, мл
Раствор
1 2 3 4 5 6 7 8
0,20 0,18 0,16 0,14 О,! 2 0,10 0,20 0,20
Вода
BSA 1 мг/мл
0,02 0,04 0,06 0,08 0,10
О 05М КН,РО| рН 8,3 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,03 0,01
Энзим в 0,05 M
КН Р04, рН 8,3
0,02 О, 04
Щелочной сульфат меди
1,О 1,О 1.0 1 ° О 1,О l 0 1,0 1,0
Инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре
Фенольный реагент О 1 О 1 О 1 О 1 0,1 0,1 0,1 О 1 генизации три раза, как это описано выше. Центрифугировали гомогенат, как это описано выше, и объединили поверхностные слои с поверхностным сло- . ем, полученным после первого центрифугирования, Хранили препарат при
4оС
После стояния н течение нескольо ких недель при 4 С раствор энзима мо- !0 жет становиться мутным и может иметь место седиментация в колбе ° Раствор энзима может быть очищен путем центрифугирования при 4 С без какого-лио бо существенного изменения его удель- 15 ной активности.
Диализ сырого экстракта, Превращающий энзим, который должен был ис пользоваться для целей скрининга, 20 диализовали для удаления низкомолекулярных ингибиторов, Для этой цели около 30-40 мл сырого экстракта поместили в диализирующую трубку Spectrapor ¹ 1 (отсекаемые молекулярные веса: 6000-8000), которую предвари- тельно промыпи 0,05 М буферным раствором фосфата калия с рН 8,3. Энзим диализовали в течение ночи (около
18 ч) против такого же буфера при 30
4 С, Диализованный энзим хранили о при 4 С; он. сохранял полную активность в течение трех недель, т
Определение концентрации протеина, 35
Концентрацию протеина энзимного препарата определяли согласно методу
Lowry (2).
48 8
Требуемые растворы получены в стекле с применением дистиллированной воды, 1, 27-ный CuS0< 5Н О. Растворили
5,0 r CuS04 5Н О в воде и добавили достаточное количество воды для получения 250 мл раствора °
2. 47-ный натрий калий тартрат.
Растворили 10,0 г натрий калий тартрата в воде и разбавили водой до
250 мл.
3, 27-ный карбонат натрия в 0,1 М гидроокиси натрия, Растворили 20,0 г карбоната натрия и 4,0 г едкого натра в воде и разбавили раствор до
1000 мл водой.
4. Щелочной раствор сульфата меди.
В день определения протеина смешали
0,1 мл 27 †но раствора сульфата меди, 0,1 мл натрий калий тартратного раствора и 20 мл 27-ного раствора карбоната натрия и 0,1 М раствора гидроокиси натрия в 25 мл.мерной мензурке.
5, Фенольный реагент. Разбавили
1 мл реагента (Sigma Chemical Со)
l мл в день определения протеина.
6, Альбумин бычьего серума (BSA).
Растворили 25 мг BSA (Sigma Chemical Со) в воде и разбавили до 25 мл о водой, Хранение раствора при 4 С.
Методика. Концентрация протеина растворов энзима определяется с помощью стандартной кривой, полученной с BSA.
Растворы добавляли к испытуемым пробиркам 13х10 мм в порядке, перечисленном в табл.1.
Таблица 1 .1304748
Проводили смешивание сразу же после добавления фенольного реагента и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, Прослеживали поглощение (А5оо каждого образца относительно воды, Образец 1 был контрольным, Образцы 2 — 6 были стандартными, используемыми для получения стандартной кривой в диапазоне 20-100 мкг BSA, Образцы 7 и 8 были неизвестными.
Расчеты, Провели вычитание А 00 для образца 1 из А 0 неизвестного образца. Дпя этого из стандартной кривой нашли количество протеина в мкг согласно формулы: мг/мл протеина
= мкг протеина х х мл, использование для испытания х фактор разбавления.
Определение активности ангиотен- зин-превращающего энзима и действие ингибиторов.
Для определения коэффициента экстинкции гиппуровой кислоты приготовили пять образцов (аналогичных), содержащих 0,98, 0,96, 0,94, 0,92- и
0,90 мл..воды добавили 0,02Ä 0,04, 0,06, 0,08 и 0,1 мл водного раствора гиппуровой кислоты до 1 мл в такой же последовательности, Это привело к получению образцов, содержащих 20, 40, 60, 80 и 100 мкМ гиппуровой кислоты соответственно, зарегистрировали поглощение каждого образца относительно водного контроля при, 228 нм на ультрафиолетовом спектрометре. Использовали 1 мл кварцевую ячейку, Отложили зависимость поглощения каждого образца от соответствующей концентрации гиппуровой кислоты, График имел вид прямой линии, проходящей через нуль, Наклон прямой линии равен микромолярному коэффициенту экстинкции и имел величину
0,0103+5X. Эта величина используется для, расчета концентраций гиппуровой кислоты в эксперименте с превращающим энзимом, Методика измерения активности ангиотензин-превращающего энзима в присутствии и отсутствии потенциальных ингибиторов, Реагенты для испытания, Неорганические реагенты и этилацетат были марки ХЧ, Гиппуровая кислота была получена от Sigma Chemical Со. Гиппуриллистиднн-лейцин являлся продуктом, поставляемым Reseoreh Plus, Inc.
Требуемые растворы были получены в стеклянной посуде с использованием дистиллированной воды, 1, 3М NaC1, Растворили 175 г хлористого натрия в 800 мл воды. Перенесли раствор в мерный цилиндр и до1О вели объем до 1000 mr, 2 ° 0,3 M KH PO - 1,5 М NaC1, рН
8,3 ° Растворили 12,2 г фосфата калия в 120 мл воды в лабораторном стакане.
Добавили 150 мл 3М хлористого натрия„
Перемешали раствор магнитной мешалкой и добавили разбавленную гидроокись калия для доведения рН раствора до 8,3. Перенесли раствор в мерный цилиндр и довели объем до 300 мл
20 водой.
3. 0,05 М КН РО,„, рН 8,3. Раство- . рили 1,701 r фосфата калия в 220.мл воды, Довели рН раствора до рН 8;3 с помощью добавления разбавленной гидроокиси калия, Перенесли раствор в мерный цилиндр и довели объем раствора до. 250 мл, 4. 0,001 М гиппуровой кислоты—
0,05 M KH P04, рН 8,3, Растворили
30 1,701 г КН Р04 в 200 мл воды. Доба- . вили 0,0448 г гиппуровой кислоты.
Раствор перемешивали магнитной мешалкой и добавили разбавленной гидроокиси калия, чтобы довести рН раст35 вора до рН 8,3,-Перенесли раствор в мерный цилиндр и довели объем раствора до 250 мл водой, 5, 0,001 N гиппуровой кислоты.
Растворили 0,0448 r гиппуровой кис40 лоты в 200 мл воды, Довели объем раствора до 250 мл водой, б. 0,025 М гиппурил-гистидил-лейцина (HHL) — 0,04 М КН<РО<, рН 8,3.
Растворили 0,170 r КН РО в 20 мл
45 воды, Добавили 0,2685 r HHL и перемешивали раствор магнитной мешалкой, Добавили разбавленной гидроокиси калия для доведения рН раствора до рН
8 3, 50
7, 1 М НС8, Добавили 83 мл 37Х-ной соляной кислоты к 500 мл воды в мерном цилиндре. Раствор смешали и доцели объем раствора до 1000 мл водой, 8. 0,001 М SQ 20,881, Растворили
3,0 мг SQ 20,881 в 2,72 мл воды, 9, 4 мкМ SQ 20,88!. Разбавили
0,О1 мл раствора 8 2,49 мл 0,05 М
КН РО4э рН 8,3, 1!
Растворы 2, 3, 4, 5, 6, 8 и 9 хр о, нили при 4 С.
Метод. Разбавили диализированн
АСЕ до 2 мг/мл раствором 0,05 М
1304748 !2 а- KH PO — КОН, рН 8,3 и хранили во льду, Растворы внесли пипеткой в исую пытуемые пробирки 13х100 мм в порядке, указанном в табл.2.
Таблица 2
Образец, N, объем, мл
Раствор
Е )
05 M KH P04
NaC1, рН 8,3
-0 05 0 05 0 05 0 05 0.05 О 05 О 05
0,045 0,095 0,07 0,095 0,095 0,095 0,07
0,05 М КН РО рН 8,3
1 мМ гиппуровая кислота — 0,05 М КН PO рН 8,3
0,05
0,025 Y. HHl — 0,05 М
Р04 р
002 002 002 002 002 002 002
4 микромоля 8Ц 20,881
0,05 M КН РО4, рН 8,3
0,025
0,025
5 мМ ингибитор (в
95 -ном этаноле) 0,005
О, 005
95 -ный этанол
0,005 0,005
0,005 0,005 0,005
Опыт с каждым образцом дублировался, Образец 1 использовали для определения извлечения гиппуровой кислоты, Образец 2 — контроль активности
АСЕ, Образец 3 — активность АСЕ в присутствии стандартного ингибитора.
Образец 4 — активность АСЕ в присутствии спирторастворимого ингибитора.
0,25 0,25 0,25
0,25
Диализованный АСЕ, 2 мг/мл
Оь08 Ов08 Ое08 Ов08 Оа08 Ое08 Ое08
0 25 0 25 . О 25
HCE 1 M и 7 удаляли из добавления энзи4 инкубировали
10 мин перед доОбразцы 1, 5, 6 водяной бани после ма. Образцы 2, 3 и при 37 С в течение бавлением HCE.
Образцы 5, 6 и 7 — эталоны сравнения в начальный момент времени для образцов 1 и 2, 3 и 4 соответственно, I
Вышеуказанные образцы и разбавленные растворы энзима инкубировали (2 мг/мл) при 37 С в водяной бане в
40 течение 5 мин перед добавлением ра-. створов, приведенных в табл.3.
Таблица 3 Конечная концентрация компонентов смеси составляла фосфат, 0,01 М, гиппуровой кислоты, 50 мкМ хлористого натрия, 300 мкМ и НН1 2 мМ. Концентрация стандартного ингибитора
Доля чистое поглощение при 228 нм извлечения микромолярный коэффициент 50 экстинкции
Активность энзима, Вычитают погло- 25 дорастворимый ингибитор и образце, щение образцов 5, 6 и 7 из поглоще" содержащем спирторастворимый ингибиния образцов 2, 3 и 4 соответственно, тор.
Это приводит к величине чистого пог- 2, Расчет образуемой гиппуровой лощения за счет гиппуровой кислоты в кислоты, нм, проводят следующим обконтрольном образце, содержащем во- 30 разом:
Гиппуровая чистое поглощение при 228 нм 1 х1,5х кислота, мм микромолярный коэффициент извлеченная экстинкции доля .
Активность превращающего энэима выражается в наномаля образуемой гиппуровой кислоты/мин. Удельная
35 активность выражается в наномолях гиппуровой кислоты/мин/мг протеина .
Удельная ак тив но с ть = ак тив но с ть х мг протеина в образце 0,16
Е ингибирования рассчитывается следующим образом: удельная активность — удельная активность
Е ингибирования — х 100, удельная активность контроля
/ Ъ
Концентрация испытуемого соедине- контрольный образец, извлекаемый обния Для целей скрининга все соедине- разец и образец в начальный момент ния были испытаны при концентрации, 50 времени должны содержать одинаковое
100 мк оо м, количество органического растворитеВ качестве стандартного ингибито- ля, Не обнаружено существенного влияра .активности АСЕ использовали нона- ния на активность АСЕ.5Х-.íîãî этанопептид SQ 20,881. Воздействие стан- ла или 27.-ного диметилсульфоксида. о дартного ингибитора на активность 55 Повышение концентрации этих раствориACE определяют каждый раз при испы- телей приводят к ингибированию активтании неизвестного соединения. ности энзима.
При растворении испытуемых соеди- Влияние испытуемого соединения на нений в органических растворителях, . рН реакционной смеси определяют раз13 13047
SQ 20,881 составляла 0,4 мкм, Удельная активность препарата АСЕ, использованного в этой методике составила, 48 нм/мин/мг, После добавления ко всем образцам HC 3 к каждому образцу добавили
1,5 мл .этилацетата и смешали в вихревом смесителе (установка б) в течение 15 с. Центрифугировали образцы в течение 5 мин на верхнем столе, 10 центрифугировали для отделения двух слоев жидкости, Отделили 1,0 мл из этилацетатного слоя каждого образца и перенесли в испытуемые пробирки
13х100 мл, Поместили испыту& ые про- 15 бирки в аналитический испаритель (0rganomation Associates, Inc.) с температурой воды 65 С„ Выпарили образцы досуха в потоке азота чисто48 14 той 99,997. (10 мин). Удалили образцы из испарителя. Добавили 1 мл воды к каждой испытуемой пробирке и мешали в течение 20 с на вихревом смесителе (установка 6).для растворения осадка. Зарегистрировали поглощение при 228 нм (А ) относительно воды. Использовали 1 мл кварцевую кювету.
Расчеты, Извлечение гиппуровой кислоты.
Вычитают величину поглощения образца 5 из величины поглощения образца 1. Чистое поглощение при 228 нм, обусловленное 50 нм гиппурой кислоты, добавляют к образцу 1, Долю гиппуровой кислоты, извлекаемую из образца 1 рассчитывают следующим образом;
16!
5 304748 бавлением 0,02 мл 5 мМ раствора испытуемого соединения О,"- мл 0,05 М
КН РО - 1,5 М NaC1, рН 8,3 и 0,78 мл о
О, 05 М КН РО ., рН 8, 3, Концентрации и испытуемого соединения, буферного 5 ц раствора, органического растворителя и хлористого натрия в этом разбавлен- Н ном растворе равны концентрациям этих компонентов в реакционной смеси. Если Р рН разбавленного раствора находится !О 2 между 8,2 и 8,5, то 5 мМ раствор испытуемого соединения в органическом растворителе используется для испытания на воздействие на активность
АСЕ, Если рН разбавленного раствора меньше 8,2 или больше 8,5, то аликвоту 5 мМ раствора разбавляют в 0 05М
КН РО и рН доводят до 8,3.
Ак тив ные соединения, Соединения, которые содержат активные группы и потенциально воздействуют как активные целенаправленные необратимые ин- 30 л гибиторы ACF. испытываются на их спо 9 м собность к необратимому ингибироэанию АСЕ, Такие соединения предварительно инкубируют с ACF, в 0,05 М о л
КН РО, рН 8,3 при 37 Г, В различные моменты времени отделяют аликвоты и испытывают на активность превращающего энзима, как это описано вьппе.
Параллельно проводят опыт с контрольной предварительно инкубированной 40 г смесью без испытуемого соединения, с
Заключения об активности — Менее
20Х ингибирования АСЕ, Соединения, вызывающие менее 20Х ингибирования
АСЕ активности рассматриваются как 45 неактивные и далее не испытываются, Соединения, вызывающие 20-50Х-ное ингибирование активности АСЕ, рассматриваются как соединЕния средней активности. Такие соединения вновь испытываются для подтверждения процента ингибирования.
Соединения, которые имеют воспроизводимое ингибирование активности
ACF. более 50Х при концентрации
100 мкМ, рассматриваются как активные, Такие соединения испытываются при различных концентрациях для того, чтобы определить Iz или К, соосн с-снснрссн, I! I !! осн о
19 мМ соосн, С вЂ” СНСН2,ЬН ! о си
245 мМ
Соединения, которые являются активными ингибиторами АСЕ, испытываются при нескольких, различных концентрациях ингибитора для того, чтобы определить Iyp или константу ингибирования, К, (4) Соединения, которые необратимо инибируют ACF., испытываются далее для пределения минимальной концентрации нгибитора, необходимой для инактиваии АСЕ и скорости инактивации, Активность соединения при О,! мМ. еактивное L 20Х ингибирования.
Получение сырого ангиотензин-преващающего энзима. (Реl — Freer) в
О мл 0,03 M 1-0-н-октил-8-D-глюкопи- . ранозид — 0,05 М КН РО, рН 8,3 в
30 мл измельчителе ткани Potbr Elvehjem, охлаждаемом льдом. Гомогенизовали,суспензию с прИменением механического тефлонового пестика (Х) 3 прохода.
Гомогенат перенесли в охлажденную поликарбонатную пробирку (50 мл) для центрифугирования и центрифугировали в течение 25 мин при скорости
20000 об/мин (36900 х) в центрифуге
SS-34 с использованием Sorval RC
5В при 4 Г. Перенесли верхний слой жидкости в лабораторный стакан 50 мл, охлаждаемый льдом, Вновь суспендировали шарики в
10 мл охлажденного 0,03 M 1-0-н-октил-P-D-глюкопиранозид — 0,05 М
КН РО<, рН 8,3 в дробилке и повтории методику, описанную вьппе для гоогенизации и центрифугирования, Объединенные поверхностные слои жидкости, как было найдено, содержали окоо 70Х активности, присущей первоначальному гомогенату. Знзим диалиэовали перед использованием.
Следующие соединения были испытаны in vitro на ингибирование ангиотензин-превращающего энэима, прилааемому здесь, Ингибирование предтавлено в виде величин I
Соединение
17
N- (3 -Меркаптопропаноил)—
"L-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин)-3-карбоновая кислота
N-(3 -Ацетилтио-.2 -метил) ) пропаноил)-L-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин)-3-карбоновая кислота
N-(3 -Меркапто-2 -метил) 7 пропаноил) - - (1, 2, 3, 4-тетрагидроизохинолин)"3-карбоновая кислота 1304748 18
3,8
0,04
0,045 для лакримации, расширения зрачков и птоэа, и на активность по отношению к центральной нервной системе, тремор, конвульсии, моторную активность, атаксию и потерю рефлекса выпрямления. Наблюдали также одышку и цианоз, Там, где э);о возможно, указаны также ЕП ди LD
Приложение А. Первичный фармакологический отбор, Испытание 100 особей на сильную реакцию в интервале доз, Испытывали соединение (-) Р 3371 (1 ч), N- (3-Меркапто-2 -ме тилпр паноил)—
- .-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин)-3-карбоновая кислота;
И-(3 -Ацетилтио-2 -метилпропано) ) ил)-L-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин)-3-карбоновая кислота, Это испытание дает предваритель ные данные, указывающие на присутствие активности, направленной на центральную нервную систему и автономной активности, а также косвенно указывающие на циркуляторную активность соединения, В этом испытании получают также предварительные данные по смертности, в результате чего можно выбрать нелетальные дозы для исполь" зования в каких-либо дальнейших нужных фармакологических испытаниях, Для каждой дозы используют группу из 4 мышей, которым внутрибрюшинно инъекцией вводят соединение в количестве 160 мг/кг ° Животных наблюдают для определения сильных явных симптомов в течение 1,5 ч после введения лекарства, Симптомы фиксируют и эти данные анализируют для проведения определения в том случае, если соединение имеет какую-либо пригодную,активность по отношению к ЦНС и/или автономную активность, Определяют максимальную нелетальную дозу и, если это возможно, приблизительные значения LDqp u EDqp
В приложении А представлены результаты, полученные с использованием N-(3 -меркапто-2 -метилпропаноил-L-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин)-3-карбоновой кислоты (соединения
9 3371). В приложении В представлены результаты полученные с исполь1 о зованием N-(3 -ацетилтио-2 — метилпропаноил-L- (1, 2, 3,4-тетрагидроизохинолин) -3-карбоновой кислоты (соединение Ф 3370). Соединение 3371 испытано на автономную активность
ЕРш) мг/кг веса тела
Автономная
Усиление лакримации-22
Расширение зрачка-23
715
640
Общая.
НД
НД-ЕР ) не достигается
Код SKI-D-59-В
Проект: алканоиламинокислоты
Цвет желтый
Форма: жидкий раст- Носитель Tween вор 80
СООН
Структура:
С 3 понижение рек25 тальной температуры-30
30 Ж р ) 6 4 0 м г / к ) веса тела
35 Источник: специалист/виварий
40 Основной фактор:
1,0
Вид: крыса, выдержанная беэ пищи
18 ч
Использованные дозы
640-10 мг/кг
Количество животных на 1-ю дозу: 6 рН 3,0
Пол: самцы
; Комнатная темпе-, ратура: 22,4 С
Доведение рН: перорально
Способ введения: перорально
19 1304748
Первичный фармакологический отбор, Центральная нервИспытание 100 особей на сильную ре- ная система акцию в интервале доз Испытывали соединение 11 - 3371 (1/2 ч) 20 снижение моторной 5 активнос113 ти
ED, мг/кг веса тела
Автономная птоэ 20
120
Автономная усиление лакримации 22 НД расширение зрачка 23 НД расширение зрачка 23 НД
Общая снижение температуры пищевода 32 )60
640 мг/кг веса тела
НД-ED не достигается
Код Ф: SKI-D-59-В Проект: алкано- 20 иламинокислоты
Цвет желтый
Проект: алканоиламинокислоты
Код 11 SKI-D-59-В
Носитель: Tween
Цвет: желтый
Форма: жидкий раствор рН 3,0
30 Форма: жидкий раст- Носитель: 15Х вор Tween 80
Основной фактор:
1,0 Пол:. самцы
Основной фактор:
1,0 рН: 3,5
35 держанная без нищи
Пол: самцы
Температура
21,8 С
Использованные дозы:
Доведение рН:
640-10 кг/кг веса тела
40 Использованные доSb):
320-20 мг/кг
Способ введения: перорально .
Способ введения: внутрибрюшинно
Количество животных на 2-ю дозу: 6
Количество животных на 1-ю дозу: 4
Структура:
Q COOH
Структура:
Н$ 1 в
О POOH
50 сн
Первичный фармакологический отбор, Испытание IOO особей на сильную секцию в интервале доз. Испытывали соединение 1- 3371, ED®, Mr/кг веса тела
Источник: специалист/ виварий
Вид: крыса, выдержанная беэ пищи
18 ч
Температура
22,3 С
Доведение рН—
ЕР О приблизительно НД=ЕП не досравна 320 мг/кг тигается веса тела. Х=EDso LDso
LD равна приблио эительно 160 мг/кг веса тела
Источник: специалист/ виварий
Первичный фармакологический отбор, Испытание 100 особей на сильную реакцию в интервале доз. Испытывали соединение 9 3371 (3,5 и 24 ч), 21
Сильные симптомы
1304748 отсутствуют
Код Р: SKI-D--59-В
Проект: алканоиламинокислоты .О » 640 мг/кг веса тела
НД=ЕР О не достигается
Проект: алканоил- . аминокислоты.Код У: Kl" "-59-В
Цвет: желтый!
Носитель: Tween
Форма: жидкий раствор
Форма: жидкий раствор Цвет желтый
Основной фактор:
190 рН 3,0
Носитель:Tween
Основной фактор:
l 0
Пол: самцы
Вид: крыса, не выдержанная без пищи рН 3,0
Использованные дозы:
Температура
22,4 С
Пол: самцы
Комнатная температура: 21,7 С
640-10 мг/кг
Доведение рН:
Количество животных на 1 дозу: 6
Способ введения: перорально
Доведение рН:
Количество животных 25 на 1-ю дозу: 6 Способ введения: перорально
Первичный фармакологический отбор, Испытание !00 особей на сильную ре акцию в интервале доз. Испытывали со единение Ф 3371, Структура:
О СООН
Первичный фармакологический отбор, Испытание 100 особей на сильную реакцию в интервале доз ° Испытывали соединение - 3371 (! ч) Центральная нервная система
39 113 2,83
1,42 0,48
Автономная птоз 20
39 120 2167
1,33 0,44
Автономная
45 расширение зрачка 23 усиление лакримации 22 >320 >715 »0)9
)0е9 >0,4
НД НД НД НД
НД расширение зрачка 23 » 320 >640»!
»1 >0,5
Общая снижение температуры пищевода 32
80 160 2 1
0,5
Общая
LD равна приблизител но
320 мг/кг веса тела НД=ED не достигается
Источник: специалист/ виварий
Использованные дозы:
640-10 мг/кг снижение рек--. тальной температуры 30
EDo EDro LD+p
/LDî ) LDî/ ЕП о
ED yp ED НД НД НД НД НД НД=Е 50 не достигается 22 640 мг/кг веса тела Источник: специалист/ виварий Вид: крыса, выдержанная без пищи 18 ч снижение моторной активности — 5 Ego EDso LDm / "о / "По Е1Ъо ED ЕП„„„мг/кг веса тела 1304748 24 Общая снижение температуры пищевода 32 42. Проект: алканоил5 аминокислоты Код Р: SKI-D-59-В Цвет желтый Форма: жидкий раствор Носитель: 15Х Tween 80 равна приблизительно 42 мг/кг веса Р Основной фактор: 1,0 рН 3,5 Код М: БК?-С-113-D Проект: алканоиламинокислоты Вид: мьппь, беэ выдерживания Пол: самцы Температура 21 8.С Источник: специа20 лис т/ виварий без пищи Цвет белья Форма: жидкокристаллический раст25 Доведение рН— Количество живот- Способ введения: ных на дозу: 4 внутрнбрюшинно Основной фактор: 1, 56 Приложение В, Первичный фармакологический отбор. Испытание 100 на сильную реакцию в интервале доз, Испытывали соединение Ð 3370-W. Пол: самцы Температура 22,5 С 30 Вид: мыши, не выдержанные без пищи ED, мг/кг веса тела Доведение рН— Центральная нервная система тремор 2 40 Способ введения: внутрибрюшинно конвульсии 3 Хпонижение моторной активности 5 57 45 афпг атаксия 6 40 соон NH Автономная 80 гиперемия 19 50 расширение зрачков 23 Первичный фармакологический отбор. Испытание 100 особей на сильную ре55 акцию в интервале доэ. Испытывали соединение У 3370-W . Дыхание 60 ЬЭ равна приблизительно 160 мг/кг веса тела Источник: специалист/ виварийь Использованные дозы: 320-20 мг/кг г потеря pecbлекса выпрямления 11 одьппк а 26 цианоз 27 равна приблизительно 64 мг/кг веса тела Использованные дозы: 160-10 мг/кг Количество животных на 1-ю дозу: 4, Структура: НД=ЕП не достигается х=кп, п Носитель: вода рН 6,0 1304748 EDî EDso LD о /LDo/ЬРо/ ЕРso ED ЕР1оо р мг/кг веса тела Тремор 2 8 .Конвульсии 3 34 снижение моторной активности 5 40 атаксия 6 20 потеря рефлекса выпрямления 11 42 84 1 0,5 0,25 Автономная! 40 80 1,05 0,52 0,26 гиперемия 19 расширение зрачков 23 40 89 0,94 0,47 0,21 Дыхание 0,5 0,25 42 84 1 20 60 1 4 0)7 О 23 Общая снижение темпе21 42 2 0 5 НД=ЕВюо не достигае гся LD приблизительно равна 84 мг/кг веса тела LD приблизительно равна 42 мг/кг веса тела Код Ф: $К?-С-113-П Проект: алканоиламинокислоты Источник: специалист виварий Цвет белый Носитель ". вода рН 6 Пол самцы Центральная нервная система одышка 26 цианоз 27 ратуры пищевода 32 Форма: жидкокристаллический раствор Основной фактор: l,56 40 2,1 1 05 0,22 108 0,78 0,39 0,12 57 1в47 0 74 О ° 53 40 211 1ю05 Ов53 27 1304748 Вид: мышь, не выдержанная без пищи Температура 22,5 С о Доведение рН— Использованные дозы: 160-10 мг/кг Способ введения: внутрибрюшинно Количество животных на 1-ю дозу: 4 Формула изобретения Способ получения производных тетрагидроизохинолина общей формулы подвергают ацилированию кислотой формулы Составитель Г, Жукова Редактор В. Ковтун Техред; В.Кадар Корректор А. Обручар Заказ 1326/58 Тираж 372 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий )13035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д.4/5 Производственно-полиграфическое предприятие,.г, Ужгород, ул. Проектная, 4 О,ОН 3 1 5 S — с — с — с-Х 0 ! I II в,в о где R --R — независимо друг от друга водород или низший алкил с 1-6 атомами. углерода; R — водород или низший алканоил с 1-6 атомами углерода, отличающийся тем, что тетрагидроиэохинолин общей формулы COOY . н © где Y — - низший алкил,, R3 1 R,-S-С вЂ” С вЂ” С 1 t 8 ц g„o 25 где R -R4 имеют указанные значения, в присутствии лициклогексилкарбодии.мида с последующим гидролизом и выделением целевого продукта.
