Способ скрининговой диагностики острого клеточного отторжения трансплантированного сердца


 


Владельцы патента RU 2614726:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, может быть использовано при ведении пациентов после трансплантации сердца для диагностики отторжения трансплантированного сердца. Сущность способа: в сыворотке крови определяют концентрацию PlGF-1 и при уровне P1GF-1 выше 5,33 пг/мл диагностируют острое клеточное отторжение. Преимущество изобретения заключается в обеспечении простоты, доступности, неинвазивности диагностики, сокращении времени ее проведения при одновременном достижении достоверного диагностического скрининга острого клеточного отторжения как в раннем, так и в отдаленном посттрансплантационных периодах у реципиентов сердца, а также в улучшении результатов трансплантации сердца, повышении выживаемости реципиентов путем своевременного определения показаний к внеплановой эндомиокардиальной биопсии, коронароангиографии и уточнения тактики ведения больных путем определения уровня концентрации PlGF-1 в сыворотке крови. 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, может быть использовано при ведении пациентов после трансплантации сердца для диагностики отторжения трансплантированного сердца.

Трансплантация сердца (ТС) является эффективным методом лечения пациентов в терминальной стадии застойной сердечной недостаточности. За последние 5 лет число операций ТС многократно увеличилось, при этом улучшились показатели продолжительности и качества жизни.

Несмотря на значительные достижения и существенный прогресс в лечении реципиентов сердца, различные виды отторжения трансплантированного сердца являются главными причинами потери трансплантата на ранних и отдаленных сроках после операции.

Объективным отражением системности процессов, происходящих в организме реципиентов, является изменение концентрации в крови ряда специфических молекул - биомаркеров. Выявление лабораторных биомаркеров для диагностики осложнений после ТС - сложная задача, поскольку тесты на большинство предполагаемых биомаркеров имеют недостаточную чувствительность и специфичность.

Факторы роста эндотелия сосудов (VEGF) - мощные ангиогенные факторы, которые продуцируются макрофагами, фибробластами, гепатоцитами, эндотелиальными и другими клетками сосудов и участвуют в активации, пролиферации, миграции и дифференцировке клеток эндотелия кровеносных и лимфатических сосудов. При этом упомянутые факторы взаимодействуют с сосудами через специфические тирозинкиназные рецепторы.

Плацентарный фактор роста, как и другие представители семейства VEGF, участвует в регуляции роста эндотелия сосудов и инициирует воспалительный процесс в сосудистой стенке, привлекая из кровотока циркулирующие моноциты и макрофаги в зону повреждения или в область атеросклеротической бляшки, а также усиливая пролиферацию гладкомышечных клеток и стимулируя макрофаги к выбросу моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (МСР-1) и фактора некроза опухолей альфа (ФНО-α) [Плацентарный фактор роста и коронарный неоангиогенез при ишемической болезни сердца / М.В. Туликов, О.П. Шевченко, А.О. Шевченко и др. // Клиницист. - 2013. - №1. - С. 4-9; Accomero F. Placental growth factor as a protective paracrine effector in the heart / F. Accornero, J.D. Molkentin // Trends in Cardiovascular Medicine. - 2011. - Vol. 21. - №8. - P. 220-224; Mechanism of monocyte activation and expression of proinflammatory cytochemokines by placenta growth factor / S.K. Selvaraj, R.K. Giri, N. Perelman et al. // Blood. - 2003. - Vol. 102. - P. 1515; Proteolytic processing regulates placental growth factor activities / D.C. Hoffmann, S. Willenborg, M. Koch et al. // The Journal of Biological Chemistry. - 2013. - Vol. 288. - №25. - P. 17976-89]. Показано, что PlGF повышает экспрессию мРНК провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкины -1, -8 (ИЛ-1, ИЛ-8), а также других факторов роста эндотелия сосудов [Carnevale D. Placental growth factor and cardiac inflammation / D. Carnevale, G. Lembo // Trends in cardiovascular medicine. - 2012. - Vol.22. - №8. - P. 209-212; Dewerchin M. PlGF: a multitasking cytokine with disease-restricted activity / M. Dewerchin, P. Carmeliet // Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. - 2012. - Vol.2. - №8; PlGF repairs myocardial ischemia trough mechanisms of angiogenesis, cardioprotection and recruitment of myo-angiogenic competent marrow progenitors / H. Iwasaki, A. Kawamoto, M. Tjwa et al. // PLoS ONE. - 2011. - Vol.6. - №9. - P. 1-14].

Клинические исследования показали, что отсутствие плацентарного фактора роста в крови при таких патологических состояниях, как рак, ишемия, воспаление или заживление ран, приводит к нарушению процесса ангиогенеза [Dewerchin M. PlGF: a multitasking cytokine with disease-restricted activity / M. Dewerchin, P. Carmeliet // Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. - 2012. - Vol. 2. - №8; Proteolytic processing regulates placental growth factor activities / D.C. Hoffmann, S. Willenborg, M. Koch et al. // The Journal of Biological Chemistry. - 2013. - Vol. 288. - №25. - P. 17976-89]. Уровень PlGF в плазме крови повышается при различных патологических состояниях, включая заживление ран, образование и развитие опухоли [de Falco S. The discovery of placenta growth factor and its biological activity / S. de Falco // Experimental & Molecular Medicine. - 2012. - №44. - P. 1-9].

В настоящее время PlGF рассматривают как показатель нестабильного течения атеросклероза. Более высокие уровни плацентарного фактора роста в плазме крови больных ишемической болезнью сердца связаны с неблагоприятным отдаленным прогнозом [Шевченко А.О. Новые лабораторные маркеры ангиогенеза и повреждения атеросклеротической бляшки / А.О. Шевченко // Клиническая лабораторная диагностика. - 2006. - №6. - С. 23-34; Elevated concentration of placental growth factor (PlGF) and long term risk in patients with acute coronary syndrome in the PROVE IT-TIMI 22 trial / A.H. Bui, M.P. Bonaca, M.S. Sabatine et al. // The Journal of Thrombosis and Thrombolysis. - 2012. - Vol. 34. - №2. - P. 222-228].

Как показали Selvaraj S.К. и соавт., PlGF оказывает прямое действие на моноциты, активируя их посредством рецепторов VEGFR-1 (flt-1). Активация этих рецепторов на поверхности моноцитов приводит к активации моноцитарной PI3 киназы, что приводит к повышению выброса провоспалительных цитокинов и матриксных металлопротеиназ, обладающих способностью дестабилизировать атеросклеротическую бляшку [Mechanism of monocyte activation and expression of proinflammatory cytochemokines by placenta growth factor / S.K. Selvaraj, R.K. Giri, N. Perelman et al. // Blood. - 2003. - Vol. 102. - P. 1515].

У реципиентов сердца в отдаленные сроки после трансплантации (один год и более) с ангиографическими признаками васкулопатии трансплантата уровень плацентарного фактора роста в плазме крови достоверно выше, чем у пациентов без васкулопатии трансплантата. Показано, что у пациентов с трансплантированным сердцем маркер является предиктором развития сердечно-сосудистых осложнений: повышенный уровень PlGF в плазме крови реципиентов в первый год после трансплантации связан с развитием осложнений в более поздние сроки [Клиническое значение маркера неоартериогенеза - плацентарного фактора роста PlGF у реципиентов трансплантированного сердца / О.П. Шевченко, О.В. Орлова, С. Эль-Бустани и др. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2009. - №3. - С. 88-95].

Проблема диагностики острого клеточного отторжения трансплантированного сердца является актуальной ввиду того, что в настоящее время в клинике диагностика производится по результатам инвазивных методов - эндомиокардиальной биопсии [Белецкая Л.В., Баранова Ф.С., Куприянова А.Г. и др. C4d-компонент комплемента как один из маркеров отторжения гуморального типа // Вестник трансплант. и искусств. органов. 2003. №4. С. 72-777 - (прототип)]. Многочисленные публикации зарубежных и отечественных авторов свидетельствуют о высоком риске осложнений и неблагоприятного исхода при использовании данного метода.

Нами поставлена задача - разработать доступный, неинвазивный, достоверный способ скрининговой диагностики острого клеточного отторжения трансплантированного сердца.

Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в обеспечении простоты, доступности, неинвазивности диагностики, сокращении времени ее проведения при одновременном достижении достоверного диагностического скрининга острого клеточного отторжения как в раннем, так и в отдаленном посттрансплантационных периодах у реципиентов сердца, а также в улучшении результатов ТС, повышении выживаемости реципиентов путем своевременного определения показаний к внеплановой эндомиокардиальной биопсии, коронароангиографии и уточнения тактики ведения больных путем определения уровня концентрации PlGF-1 в сыворотке крови.

Нами эмпирически установлен достоверный скрининговый диагностический показатель острого клеточного отторжения трансплантированного сердца, основанный на оценке концентрации PlGF-1 у реципиентов сердца в сыворотке крови, который оказался информативным в любые сроки после трансплантации. Использование предлагаемого прогностического маркера позволяет ограничить круг пациентов, которым требуется проведение эндомиокардиальной биопсии для уточнения диагноза острого клеточного отторжения трансплантированного сердца.

Сущность изобретения состоит в следующем.

Для скрининговой диагностики острого клеточного отторжения трансплантированного сердца в сыворотке крови определяют концентрацию PlGF-1 и при уровне PlGF-1 выше 5,33 пг/мл диагностируют острое клеточное отторжение.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве материала для исследования концентрации биомаркера используют сыворотку крови. Взятие крови для исследования производят, как правило, одновременно с плановым обследованием пациентов.

Кровь собирают в одноразовые пробирки (BD Vacutainer, Becton Dickinson, США) и центрифугируют в течение 10 минут при 3500/1500 g оборотах при комнатной температуре. Полученную сыворотку переносят в эппендорф и замораживают в случае необходимости. Образцы сыворотки необходимо хранить при температуре -20°С.

Концентрация PlGF-1 может быть измерена, например, с использованием технологии хМАР и реагентов Simplex ProcartaPlex™ (Affymetrix, США). Цифровая обработка сигналов может быть произведена на проточном флуоресцентном анализаторе Luminex (Luminex Corporation, США). Обслуживание прибора и обработку результатов анализа проводят с помощью программного обеспечения xΡΟΝΕΝΤ 3.1.

Определение проводят в соответствии с инструкцией. Анализ выполняют с помощью устройства Hand-Held Magnetic для фиксирования магнитных частиц на дне планшета.

Процедура анализа включает несколько этапов.

1. Подготовка калибраторов

Для построения калибровочной кривой используют четыре готовых стандартных набора калибраторов (А, В, С и Е), содержащих исследуемый аналит. В первый стандарт (А) добавляют 250 мкл универсального буфера и инкубируют на льду в течение 10 минут, затем осторожно перемешивают при помощи магнитной мешалки в течение 30 секунд. Все содержимое переносят во второй флакон с другим стандартом (В) и процедуру повторяют еще три раза для растворения стандартов всех 4-х флаконов. Далее для построения калибровочной кривой, состоящей из 8 точек, готовят серию четырехкратных разведений с использованием универсального буфера.

2. Детекторные антитела

Все детекторные антитела в наборе находятся в виде концентрата (50х), требующего последующего разведения в 50 раз. Смесь детекторных антител (1х) готовят в соответствии со следующими расчетами: 25 мкл смеси детекторных антител (1х) на одну лунку. Пипетируют 1/50 конечного объема каждого концентрата детекторных антител (1x) (Simplex) во флакон с этикеткой «Смесь детекторных антител (1х)»; до конечного объема доводят растворителем для детекторных антител.

3. Подготовка планшета

Во все лунки планшета вносят смесь микросфер с нагруженными на них антителами объемом 50 мкл, далее планшет устанавливают в устройство Hand-Held Magnetic для фиксации магнитных сфер, что позволяет проводить отмывку микросфер.

В первый и второй стрипы вносят подготовленные калибраторы, каждый образец повторяется дважды. В оставшиеся лунки вносят по 25 мкл буфера и 25 мкл исследуемых образцов.

Время инкубации составляет 2 часа при комнатной температуре и постоянном перемешивании (500 об/мин в планшетном термостате). После трехкратного отмывания микросфер от несвязавшихся компонентов реакции во все лунки добавляют по 25 мкл детекторных антител.

Время инкубации составляет 30 минут. После 3-кратной промывки микросфер с помощью устройства Hand-Held Magnetic в каждую лунку добавляют по 50 мкл раствора стрептавидина-фикоэритрина для детекции комплекса антиген-антитело.

Для построения калибровочных кривых, обработки и расчета результатов используют программное обеспечение xΡΟΝΕΝΤ 3.1.

При уровне PlGF-1 выше 5,33 пг/мл диагностируют острое клеточное отторжение.

Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Пример 1

Пациенту Е., 40 лет, с диагнозом: ишемическая болезнь сердца, выполнена ортотопическая ТС. Послеоперационный период протекал гладко. Иммуносупрессивная терапия была назначена по стандартной схеме. Однако измеренный на 43 сутки после операции уровень PlGF-1 в сыворотке крови составил 21,61 пг/мл. В соответствии с предлагаемым способом у пациента диагностировано острое клеточное отторжение трансплантированного сердца. Методом эндомиокардиальной биопсии диагноз подтвержден: было установлено острое клеточное отторжение типа 1В.

Пример 2

Пациент Б., 67 лет, поступил с диагнозом: дилатационная кардиомиопатия. Пациенту выполнена операция - ортотопическая ТС. Послеоперационный период протекал гладко. Иммуносупрессивная терапия была назначена по стандартной схеме. Измеренный уровень PlGF-1 в сыворотке крови на 592 сутки после ТС составил 0,66 пг/мл. В течение периода наблюдения (с первых суток до двух лет после ТС) клинически, а также по данным эндомиокардиальных биопсий не было обнаружено морфологических и иммуногистохимических признаков острого клеточного отторжения сердечного трансплантата.

Предложенный способ апробирован в клинической практике на 98 пациентах. Острое клеточное отторжение, подтвержденное эндомиокардиальной биопсией, развилось у 11 реципиентов сердца, у всех уровень PlGF-1 был выше установленного нами порогового значения - 5,33 пг/мл.

Использование в клинической практике патентуемого способа дает возможность достоверно диагностировать острое клеточное отторжение на ранних этапах его развития, произвести отбор пациентов, которым показано специальное дообследование для подтверждения диагноза.

Способ скрининговой диагностики острого клеточного отторжения трансплантированного сердца, характеризующийся тем, что в сыворотке крови определяют концентрацию плацентарного фактора роста -1 (PlGF-1) и при уровне PlGF-1 выше 5,33 пг/мл диагностируют острое клеточное отторжение.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для выявления риска формирования Т-хелперного иммунодефицита у человека в условиях Арктики. Для этого осуществляют забор крови из вены и определяют общее количество лимфоцитов, малых лимфоцитов в лимфоцитограмме и содержание зрелых функционально активных Т-клеток CD3+.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использована для одновременного выявления представителей условных таксономических групп микроорганизмов, патогенных для человека и животных.
Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике, и может быть использовано для прогнозирования внутриутробного инфицирования плода у женщин во втором триместре гестации при обострении хронического простого бронхита, обусловленного гриппом A(H3N2).
Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике, и может быть использовано для прогнозирования синдрома задержки роста плода в третьем триместре гестации при обострении хронического простого бронхита, обусловленного гриппом A(H3N2), у женщин во втором триместре беременности.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения присутствия белка STEAP-1 в биологическом образце, полученном от индивида, имеющего подозрение на метастатический рак предстательной железы.
Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии и дерматологии, и может быть использовано для прогнозирования инфекционного осложнения атопического дерматита у детей при специфической иммунотерапии.

Изобретение относится к области ветеринарной и медицинской гельминтологии, в частности к иммунологическому методу обнаружения антигена личинок анизакид в мышечной ткани рыбы, и может быть рекомендовано для ветеринарно-санитарной экспертизы морепродуктов.

Изобретение относится к области иммунодиагностики и может быть использовано для иммунодиагностического тестирования биологического образца. Карта иммунодиагностического тестирования включает плоскую подложку и множество содержащихся на ней прозрачных колонок с инертным тестовым материалом, выполненным с возможностью формирования реакции агглютинации при добавлении биологического образца и реагента.

Изобретение относится к медицине, а именно к профессиональной патологии и пульмонологии, и может быть использовано для диагностики профессиональной хронической обструктивной болезни легких, сформировавшейся в условиях действия токсических промаэрозолей.

Изобретение относится к области молекулярной онкологии и может быть использовано для дифференциальной диагностики рака желудка различных гистологических типов. Способ включает получение ДНК, выделенной из биопсийного материала; амплификацию фрагментов локусов GSTP1, NFKB1 и HV2 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) с помощью набора высокоспецифичных праймеров; количественную интерпретацию результатов амплификации.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для выявления антиотцовских антител после иммунизации женщин с идиопатическим привычным выкидышем лимфоцитами полового партнера. Женщинам двукратно с интервалом в один месяц на 5-9 день менструального цикла внутрикожно вводят партнерские лимфоциты в однократной дозе 50 млн клеток в 10-12 точек ладонной части предплечья. Затем через две недели получают сыворотку крови, в которую добавляют в соотношении 1:1 выделенные из цельной периферической венозной крови лимфоциты (CD3+) партнера, полученные в градиенте плотности фиколл-верографин 1,077 г/см3 в течение 10 минут при 1600 g в соотношении 500 мкл фиколла к 1000 мкл крови, разведенной в 2 раза фосфатно-солевым раствором. Далее инактивированную женскую сыворотку с полученными лимфоцитами партнера инкубируют в течение 30 минут при температуре 37°С, после чего добавляют антитела к Fc-фрагменту иммуноглобулина G в разведении 1:4 с фосфатно-солевым раствором в объеме 1:1 суспензии лимфоцитов и инкубируют в течение 30 минут при температуре 4°С. Методом проточной цитометрии определяют процент партнерских лимфоцитов (CD3+), покрытых антителами к Fc-фрагменту иммуноглобулина G партнера, которые соответствуют уровню антиотцовских антител в сыворотке женщин. Изобретение позволяет отразить динамику появления антиотцовских антилейкоцитарных антител после иммунизации указанных женщин. 3 ил., 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к медицине и касается способа получения бифункционального аффинного сорбента для хроматографической очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих путем иммобилизации неосмектина с гетерологичными антигенами, дающими перекрестные реакции с иммуноглобулинами, где к сорбенту вносят водорастворимый антиген, проводят экспозицию, отмывают от несвязавшегося антигена, доводят рН и проводят одномоментную очистку иммуноглобулинов флуоресцирующих от несвязавшегося ФИТЦ и гетерологичных антител с контролем иммунологических показателей готовых препаратов в РИФ. Изобретение обеспечивает эффективную очистку иммуноглобулинов флуоресцирующих от несвязавшегося красителя и гетерологичных антител. 2 пр., 3 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике. Сущность способа: осуществляют забор крови в пробирку, содержащую антикоагулянт, перемешивают и оставляют на 20 мин для свободного осаждения эритроцитов при комнатной температуре, после седиментации эритроцитов берут 0,5 мл лейкоцитарной взвеси и определяют в ней количество лейкоцитов любым способом (рутинным или автоматизированным), доводят ее концентрацию до величины 5*109 лейкоцитов/л дистиллированной водой, биологическую жидкость помещают в морозильную камеру при температуре -20°С до полного замораживания и используют ее после процесса размораживания для иммуноферментного определения спонтанной продукции цитокинов. Применение изобретения обеспечивает точность определения концентрации цитокинов методом ИФА, снижается индивидуальная вариабельность показателей. 1 табл.
Наверх