Способ очистки цефалоспорина с

 

снаR Ю

ОП ИСАНИЕ

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) 603343

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 11.11. 73 (21) 1967978/23-04 (51) М. Кл

С 07 D 501/60 (23) Приоритет — (32) 13. 11 ° 72

306130 19,09,73 (31) 398725 (33) ctuA

Гоовдарвтвоавый конто(Совота Манветров CCCP во дол м авойрвтевай а открытий (43) Опубликовано 15.04.78.Бюллетень № 14 (53) УЙК 547.869.07 (088. 8) (45) Дата опубликования описания 2803.78

Иностранцы

Вилли Гриннелл Джексон, Марта Каролин Стампер и Эдмонд Милтон Ботторфф (США) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма Эли Лилли энд Компани (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ЦБФАЛОСПОРИНА С

Изобретение относится к новому способу очистки цефалоспорина С, образующегося при процессе брожения, от полисахаридов и протеиновых примесей,обычно присутствующих в ферментационных 5 жидкостях. Цефалоспорин С сам обладает слабым антибиотическим действием и, что особенно важно, является ценным исходным сырьем для получения ряда более сильных антибиотиков,;акнх как цефал- 10 ,отин и цефалоридин,7-аминоцефалоспорановой кислоты и различных ее производных.

Известен способ выделения цефало- l5 спорина С, получаемого ферментацией, в виде натриевой соли, причем высокомолекулярные полисахариды и протеиновые примеси, образовавшиеся во время ферментации, удается удалить фильтро- 20 ванием через мембрану (1) . Однако этот способ в настоящее время неприменим в промышленности из-за больших объемов образующихся ферментационных жидкостей. В то же время очистка натрие- 25 вой соли цефалоспорина С перекристаллизацией удается лишь частично, так как применяемые при этом условия также вызывают осаждение примесей, последнее объясняется близкими харктеристиками растворимости натриевой соли цефалоспорина С и указанных примесей. .Известна также очистка цефалоспорина С, которая заключается в N-аци» лировании цефалоспорина С, выделением

N -ацилпроизводного и последующим удалении защитной группы. Известно большее число Х-ацилпроизводных цефалоспорина С, однако они не пригодны для очистки цефалоспорина С от полисахаридов и протеиновых примесей, так как не обладают необходимыми свойствами растворимости, отличающимися заметно от растворимостей примесей.

Так, например, Я-ацилпроиэводные цефалоспорина С, в котором ацильная группа представляет собой A --галоид или «,<-дигалоидалканоил-, хотя и растворимы в органических растворителях при образовании прямо из ферментационного раствора цефалоспорина С, трудно растворимы или совсем нерастворимы в соответствующих растворителях при попытках снова растворить их в органическом растворителе, что не позволяет использовать эти производные для отделения цефалоспорина С от полисахаридов и протеиновых примесей (21.

Целью изобретения является новый способ выделения цефалоспоринов. С из

603343 их сырых растворов превращением в я- воляет получать эти производные в чис,-ацилпроиэводные, имеющие характеристи- том виде, без загрязнения укаэанными ки растворимости, заметно отличающие- примесями и далее из них известными ся от характеристик цолисахаридов,про- приемами получать 7-ACA или 7-аминотеиновых пРимесей, цефалоспорина С и 5 цефалоспорины. солей цефалоспорина С, причем эти 1 ° ацилпроизводные цефалоспоринов раство- Согласно изобретению описывается римы в обычных органических раствори- способ очистки цефалоспоринов С фортелях и нерастворимы в воде, что поз- мулы I н,ьт- бн- <сн.),4-мн- CH1

6001 .ф — 4 (aC» СНф»

0 6 ООИ где каждый М пРедставляет собой водо- взаимодействию с 2 415 с, -дихлорбензоилгарод или щелочной металл, лоидом или 4-хлорбензоилгалоидом в

R — водород, ацетокси-, окси- или водной среде, содержащей смешивающий метилтиогруппа, ся органический растворитель, наприот полисахаридов и протеиновых приме- мер ацетон, и указанные примеси, с сей, заключающийся в том, что сырой образование Яцефалоспорин С формулы Х подвергают . 20 формулы П ра ованием -ацилцефалоспорина С

СООН метиленхлорида и . N,N -диметилацетамида, и отделяют нерастворимые вещест ва от раствора, где Х вЂ . водород или хлор, R имеет указанные выше значения, растворимого в водно-органической среде, и выпавшие в осадок полисахариды и протеиновые. примеси отфильтровывают от водно-органической среды, доводят

РН раствора до 1,5-3,5 и подвергают соединение формулы П многократной перекристаллизации из органического водосмешивающегося растворителя, содержащего до 15% .воды, с последующим снятием защитной группы известными приемами °

Отделение полисахаридов и протеиновых примесей от N-ацилцефалоспорина, 40

С формулы П, растворенного в водно-органической среде, согласно изобретению, проводят также следующим образом.

Отделяют нерастворимые вещества из водно-органической среды, доводят РН 45 полученного раствора до 1 5 -3,5, а затем добавляют к этому раствору хинолин, обычно 1,5-12 молей хинолина на

1 моль соединения формулы П, и выделяют очищенный М-ацилцефалоспорин С 50 формулы П в виде его хинолиновой соли.

Согласно изобретению, дополнительную очистку N-ацилцефалоспоринов формулы П от указанных примесей можно проводить следующим образом.

После отделения нерастворимых ве ществ от водноорганической смеси, содержащей растворенное соединение формулы И, выделяют кристаллизацией г(-ацилцефалоспорин формулы П описанным выше способом и. далее растворяют выделенный . K-ацилцефалоспорин формулы It или его хинолиновую соль в .растцорителе или смеси растворителей, пригодных для выполнения отщепления

7-ацильной группы, например, в смеси

В дальнейшем согласно изобретению соединения формулы П или хинолиновые соли подвергают отщеплению 7-ацильной боковой цепи с образованием 7-аминоцефалоспоринового соединения, Й вЂ (4-)(лорбенэоил) — и Я вЂ (2,4-дихлорбензоил)-производные цефалосйорина С и связанные с ним соединения (см. формулу П ) в виде их свободных кислот или хинолиновых солей обладают свойст вами, которые заметно отличаются от свойств цефалоспоринов С и их соответствующих солей. Таким образом, сырой цефалоспорин С, содержащий примеси, очищают рядом стадий, а именно превращением сырого цефалоспорина С в его соответствующее производное формулы II и отделением нерастворимых примесей от полученного раствора соединения формулы П. Сырой це< алоспорин С превращают в производное формулы II взаимодействием с 2,4-дихлорбенэоилгалоидом или

4-хлорбензоилгалоидом, обычно бромидом или хлоридом, преимущественно хлоридом, взятом с молярным избытком 315%, в присутствии водной среды, содер.жащей водосмешивающийся инертный органический растворитель.

Под инертным подразумевается органический растворитель, который не реагирует с 2,4-дихлорбенэоилгалоидом

И 4-хлорбенэоилгалоидом, применяемымц при получении производных цефалоспорина С . К типичным водосмешивающимся инертным органическим растворителям относятся такие как кетоны, например . ацетон; эфиры, например диоксан, тет603343 рагидрофуран, диметоксиэтан и диэтоксиэтан; нитрилы, например ацетонитрил.

Обычно водосмешивающийся органичес кий рас воритель берут в количестве приблизительно равном по объему водной среды. Однако можно применять смесь, содержащую избыток водной среды или органического растворителя в отно-! шении 10:l по объему.

Как правило, ацилирование ведут в водной щелочной среде, достаточной для образования соли щелочного металла цефалоспорина С, что получают добавлением в реакционную смесь гидроокиси щелочного металла, преимущественно едкого натра. Ацилирование ведут при температуре от 0 С до комнатной температуры1 ацилирующий реагент добавляют к заранее приготовленной щелочной смеси, во нремя добавления поддерживают нужную температуру реакции и рН около

9,0-9,5. Во время добавления ацилирующего агента рН держат добавлением при необходимости щелочного реагента, такого как третичный амин, например триэтиламин, или гидроокись щелочного металла, например едкий катр. В данном случае лучше применять едкий натр.

После образования производного формулы 1! рН реакционной смеси снижают с 9,0- 9,5 примерно до 5,5-б,5. При этих условиях производное цефалоспорина С формулы И остается в растворе, тогда как большая часть полисахаридов и протеиновых примесей остается нерастворимой и легко удаляется обычными приемами (фильтрование, декантирование, центрифугиронание и др.)

Затем производное формулы П ныделяют из ее частично очищенного раствора, например, понижением рН смеси до более кислой среды, например, до 1,5-3,5.

Выделение производного формулы П можно облегчить добавлением воды к смеси с пониженным рН для уменьшения растворимости производного формулы П в среде. Производное формулы П можно выделить как н виде его свободной кислоты, так и в виде соли присоединения, например хинолиновой соли N --ацилпроизводного формУлы П. Хинолиноную соль производного формулы П легко получают добавлением хинолина к смеси, содержащей свободную кислоту К -ацилпроизводного цефалоспорина С формулы П. Достаточно эквимолярного количества хинолина в пересчете на цефалоспорин С, однако, лучше приг.:снять избыток, обычно 1,5-12 молей хинолина на 1 моль N

-ацилцефалоспорина С формулы 11.

Для осуществления дальнейшего удаления примесей, выделенное таким образом, производное формулы П или его хинолиновую соль можно затем обработать любым из двух списанных ниже ме.тодов. Первым из них выделенное производное перекристаллизонывают в регулируемых .условиях, расчитанных на исилючение остаточных количеств полимерных примесей, что достигается растворением производного формулы П илн его

5 хинолиновой соли в органическом водо смешивающемся растворителе.

К типичным органическим водосмешинающимся растворителям относятся такие как кетоны,например ацетон;эфиры,в част)0 ности диоксан, тетрагидрофуран, диметоксиэтан или диэтоксиэтан; спирты, например метанол, этанол, н-пропанол или изо-пропанол; или нитрилы, например ацетонитрил . Органические водосме15 шивающиеся растворители могут содержать воду, но в этом случае лучше небольшое количество воды (до 15 ) .

В этих условиях перекрнсталлизацни остаточные количества примесей остац) ются нерастворимыми и легко удаляются известными приемами. Производное цефалоспорина С осаждают из очищенного таким образом раствора добавлением воды и отделяют в виде свободной киср5 лоты или ее хинолиноной соли. При применении этого способа лучше, чтобы производное цефалоспорина С формулы П находилось н виде свободной кислоты.

Другим методом обработки выделенного производного цефалоспорина С формулы П или его хинолиновой соли является простое растворение указанного нронзнодного, как н виде свободной кислоты, так и в виде хинолиновой соли . н растворителе, пригодном для выполнения отщепления N-ацилированного 5-аминоаднпоильного заместителя производного цефалоспорина С. Остаточные количества примесей остаются нерастворимыми в растворителе, который используется для проведения реакции отщепления, что позволяет после удаления примесей известными приемами применять раствори:тель для реакции отщеплення.Раствор

45:производного цефалоспорина С, который остается после удаления нерастворимых примесей, затем используют н процессе расщепления без выделения производного из растворителя.

50 Типичными растворителями, применяемыми в процессе расщепления, являются галондированные углеводороды, например хлороформ или метиленхлорид; эФиры, в частности тетрагидрофуран или диоксан.

55 Очень выгодно применять такие амиды, как N,N — диметилформамнд или-И,К-.диметилацетамид, для смесей растворителей, йрименяемых н реакциях расщепления. Согласно изобретению, для этой бо цели преимущественно используют смесь метиленхлорида и М,й-диметилацетамида.

При использовании этого последнего метода, когда производное цефалоспорнна С не выделяетря нз растворителя до расщепления желательно, чтобы производное было высушено до помещения в

603343 растворитель для расщепления, посколь-, ку в безводной среде достигается лучшее расщепление.

Цефалоспорины С, применяемые согласно изобретению как исходные вещест- 5 ва, могут быть в виде их свободных кислот, тогда М в формуле I представляет собой водород, но лучше применять цефалоспорин С в виде его соли щелочного металла, такого как литий, натрий 10 или калий, преимущественно в виде натриевой соли.

Пример 1. 60 г натриевой соли цефалоспорина С (128 ммолей) перемешивают с 300 мл дистиллированной воды до окончания растворения. Добавляют около 300 мл ацетона. Смесь перемешивают и охлаждают до 5 С, в это время выпадает осадок натриевой соли цефалосгорина С. РН смеси доводят до 9,09,5 добавлением водного 20Ъ-ного раствора едкого натра. К полученному раствору при 5 C добавляют 19,7 мл 2,4-ди. хлорбензоилхлорида (141 ммоля, 10%-ный избыток) при перемешивании в течение

30-35 мин РН смеси поддерживают равным 9,0-9,5 во время добавления 2,4-дихлорбензоилхлорида добавлением, при необходимости, 20Ъ-ного водного раствора едкого натра. По окончании добавления 2,4-дихлорбензоилхлорида смесь

30 перемешивают при 5 С в течение 10 мин .или до установления рН 9,0-9,5 в течение 2 мин. Затем смесь подкисляют концентрированной соляной кислотой до

РН 6,5. Полученную смесь обрабатывают

300 мл воды, затем 5 — 10 r фильтрующей добавки (Гифло). Смесь фильтруют через фильтр (толщина 0,25-0,5 дюйма (6,2-12,7 мм) на воронке Бюхнера Р 3), осадок промывают 50 мл воды. Фильт- 40 рат и промывки соединяют, перемешивают и нагревают до 20 С. Для доведения

РН смеси до 3,0 в нее добавляют концентрированную соляную кислоту. Раствор заражают кристаллами продукта, по- 45 лученными из небольшой лабораторной пробы, рН доводят до 2,7 концентрированной соляной кислотой. Смесь перемешивают 30 мин при 20-23 С, в это время кристаллизуется N †(2,4-дихлорбензоил)-цефалоспорин С (сначала выпадает в виде масла, затем капли масла за,— вердевают). Смесь подкисляют концент— рированной соляной кислотой до РН=1,8, перемешивают 2-3 мин и добавляют 300мл воды. Водную органическую смесь перемешивают 2-3 мин, охлаждают до 5 С и перемешивают при 0-5 С в течение 1 ч.

Продукт фильтруют, промывают 500 мл воды„ сушат в вакууме при 45 С и получают 68,0 r (89,1Ъ) .

Смесь 20,0 г N — (2,4 — дихлорбензоил) -цефалоспорина С в 180 мл ацетона реактивного сорта перемешивают до получения равномерной смеси, затем добавляют 9Ä0 мл дистиллированной воды. 65

Смесь перемешивают до растворения продукта (около 10-15 мин). К полученному раствору добавляют 2 г фильтрующей добавки (Гифло) и 2 г обесцвечивающего угля (Дарко). Смесь перемешивают около

5 мин и фильтруют через фильтрующую подушку (около 1 г в воронке БюхнеРа

9 О). Фильтрование можно повторить беэ обесцвечивания углем до получения прозрачного фильтрата. Небольшое количество осадка промывают 20 мл ацетона.

Фильтрат и промывки соединяют и пере мешивают с 250 мл дистиллированной воды. Затем смесь охлаждают до 25 С и добавляют дистиллированную воду до сохранения первых следов мутности (после добавления 75-110 мл воды). Затем смесь заражают 0,5 г перекристаллизованного продукта. Смесь перемешивают 30 мин при комнатной температуре (23-25 С), добавляют 350 мл воды при перемешивании в течение 10 мин. По окончании добавления воды смесь охлаждают и держат при 5 С в течение 1 ч.

Полученную смесь фильтруют, промывают водой и сушат в вакууме при 15ОC. Выход > †(2,4-дихлорбензоил) -цефалоспорина С составляет 16-16,5ã..

Пример 2. 60 r (134 ммоля) натриевой соли цефалоспорина С перемешивают в 300 мл воды до растворения. Добавляют около 150 мл ацетона и раствор перемешивают и охлаждают до 10 С.

РН раствора доводят до 9,0 с помощью водного 20%-ного раствора едкого натрия и .добавляют 17 мл (134 ммоля) 4-хлорбензоилхлорида. Смесь перемешивают при 10-15 С в течение 30 мин, за это время добавляют водный 20%-ный раствор едкого натра в количестве, достаточном для поддержания РН смеси около

9,0. Затем добавляют двумя порциями около 1050 мл воды (800 и 250 мл) и

РН доводят до 1,9 концентрированной соляной кислотой. Смесь заражают кристаллами N -(4-хлорбензоил)-цефалоспорина С и охлаждают на ледяной бане.

Смесь охлаждают в течение 10-15 ч (при 5 C) .Кристаллический осадок отфильтровывают, промывают водой и сушат в вакууме при 40 С. Вес кристаллического N †(4-хлорбензоил) †цефалоспорина составляет 55,7 г.

Частично очищенный Я -(4-хлорбензоил)-цефалоспорин С дальше очищают перекристаллизацией согласно методике примера 1.

П р H м е р 3. 11,8 г (20 ммолей)

N †(2,4-дихлорбензоил)-цефалоспорина

С перемешивают в 150 мл хлороформа, ингибированного от амилена. К этой смеси добавляют 5,? мл (48 ммолей) хинолина и 8,8 мл (95 ммолей) N,M -диметилацетамида. Температура смеси поднимается примерно до 28 С. Смесь охлаждают до 15 C и быстро добавляют

9,60 мл (135 ммолей) ацетилхлорида.

603343

Температура смеси поднимается до 23 C смесь перемешивают при 24-25оС н течение 40 мин, за это время растворяется

N †(2,4-дихлорбензоил)-цефалоспорин С.

Затем смесь охлаждают до -35 С и добав- 5 ляют 26 мл (162 ммоля) К,N -диэтиланилина ° Смесь снова охлаждают до -25 С и добавляют 9,8 г (47 ммоля) пятихлористого фосфора. Смесь перемешивают

30 мин при -15 С, охлаждают до -40 С 10 и добавляют 34 мл пропиленгликоля. Полученную смесь перемешивают 1,5-2 ч при 0 С, охлаждают до (-15) С и добавляют 100 мл льда и воды.

Водную фазу отделяют оТ органической фазы, органическую фазу экстрагируют 20 мл воды. Водные фазы соединяют и доводят рН до 3,5 концентрированным раствором гидроокиси аммония. Выпадает твердый осадок, его отфильтровывают, промывают водой, затем метанолом и ацетоном, сушат и получают 4,8-5,0 r

7-аминоцефалоспорановой кислоты.

Формула изобретения

Способ очистки цефалоспорина С формулы 1

Составитель С.Плужнов

Редактор Т.Девятко Техред М.Борисова Корректор С.Гарасиняк

Заказ 1675/63 Тираж 559 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 л.

Н 1 Ся (щ ) — C — КН вЂ” СН вЂ” СН СБг

БООИ О"

Q — ыл С Сяг

БООИ где каждый М представляет собой во- фалоспорин С о лы Г дород или щелочной металл, 20 и формулы Г поднер гают

R-вооо нзаимодейстнию с 2,4-дихлорбензоилгаводород, ацетокси-, окси- или лоидом или 4метилтиогруппа, — и -хлорбензоилгалоидом в водот полисах ри ной среде, содержащей смешивающийся сей сахаридон и протеиновых примесе,о тли чающий сят органический растворитель такой как с я тем, что, ацетон, с образованием N -а

I с целью упрощения процесса сы и ро це- спорина формулы П ем -ацилцефало/ 3 °

О

С1 С- чБ- Сн-(Снг ; С-NH-(H — (H (г (Ъ

Х СООН 0+

С О ОН где Х вЂ” водород или хлор, Приоритет по признакам:

R имеет укаэанные выше значения, 13.11.72 — по признаку очистки и растворимого в водно-органической сре- выделения целевого продукта в ниде де, и выпавшие в осадок полисахариды 35 свободного соединения; и протеиновые примеси отфильтровывают 19.09.73 — по признаку выделения от водно-органической среды, доводят целевого продукта в виде ето хинолинорН раствора до 1,5-3,5 и подвергают вой соли. соединение формулы П многократной перекристаллизации из органического во- 4 Источники информации, принятые во досмешинающегося растнорителя, содер- внимание при экспертизе: жащего до 154 воды, с последующим

1. Патент США Р 3739002, кл.260-243, снятием защитной группы и выделением 1969.(прототип) . целевого продукта в виде кислоты или 2. Патент США М 3641018, кл. 260-243, соли. 45 1969.